احتياطات السلامة وإجراءات التشغيل في (A) مختبر BSL-4: 2. الممارسات العامة

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عمل في مختبر الاحتواء مستوى السلامة الحيوية 4 (BSL-4) يتطلب وقتا واهتماما كبيرا بالتفاصيل. فإن العمل نفسه الذي يتم في مختبر BSL-2 مع مسببات الأمراض غير عالية نتيجة أن تتخذ لفترة أطول كثيرا في إعداد BSL-4. هذه الزيادة في متطلبات الوقت ويرجع ذلك إلى العديد من العوامل التي تهدف إلى حماية باحث من العدوى المكتسبة من المختبر، وبيئة العمل من التلوث المحتمل والمجتمع المحلي من احتمال إطلاق سراحهم من مسببات الأمراض عالية نتيجة. داخل المختبر، يتم تقييد الحركة بسبب خراطيم الهواء تعلق على الدعاوى سلامة كامل الجسم إلزامية. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من تطهير كل بند من البنود التي تم إزالتها من خزانات الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSCs). يجب تدريب المتخصصين مختبر في ممارسات مختبر BSL-4 ويجب أن تظهر عالية الكفاءة في المهارات التي تقوم بها. محور هذه المقالة هو لتوضيح الإجراءات والتقنيات لضمان مختبر ب المناسبةiosafety ودقة التجريبية باستخدام معيار فحص اللوحة الفيروسي كإجراء سبيل المثال. على وجه الخصوص، والتقنيات المناسبة للعمل بأمان في بيئة BSL-4 عند إجراء التجربة سيتم التركيز بصريا. وتشمل هذه التقنيات: إنشاء BSC الدرجة الثانية للتجارب، والتنظيف السليم للش.م.ب الدرجة الثانية عند الانتهاء من العمل، وإدارة النفايات والتخلص الآمن من النفايات المتولدة داخل مختبر BSL-4، وإزالة عينات المعطل من داخل BSL- 4 المختبر إلى المختبر BSL-2.

Introduction

كما سلامة العاملين في المختبرات التعامل مع مسببات الأمراض عالية نتيجة (أي مواد الوقاية عدوى ولا خيارات العلاج موجودة) أمر بالغ الأهمية، أنشأت وزارة الصحة والخدمات البشرية مبادئ توجيهية لتشييد مرافق وأفضل الممارسات لإجراء آمن للعمل مع مسببات الأمراض في الطب الحيوي و المختبرات الطبية من منظور السلامة الأحيائية 1. من خلال التشريع والتنظيم، وأصبحت العديد من الممارسات والإجراءات المتطلبات الإلزامية التي يجب اتباعها للعمل مع هذه الجراثيم. في الولايات المتحدة، مسببات الأمراض التي تنتقل بسهولة من شخص لآخر، تؤدي إلى ارتفاع معدلات إماتة الحالات، و / أو لديها القدرة على التأثير كبيرا على الصحة العامة والإرهاب البيولوجي، يتم تصنيفها على أنها المعهد الوطني لل/ معهد الصحة الوطني للحساسية والأمراض المعدية مرض (NIH / NIAID) الأولوية ألف مسببات الأمراض وأو مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) الإرهاب البيولوجي الفئة (أ) وكلاء 2. وبالإضافة إلى ذلك، حيتم تصنيف مسببات الأمراض IGH-نتيجة في الفئة حدد وكلاء 1 إذا كانت هذه الجراثيم وكلاء الإرهاب البيولوجي المحتملة، لديهم احتمال سقوط ضحايا كتلة أو الآثار المدمرة للاقتصاد والبنية التحتية الحرجة، أو الثقة العامة 3.

BSL-4 عمليات، بما في ذلك الوصول إلى المعاهد مع BSL-4 المختبرات ويتم التحكم بدرجة أعلى من 2 BSL / 3 العمليات. على سبيل المثال، هو إلى حد كبير أكثر صعوبة للوصول إلى مختبر BSL-4 مقارنة مختبر BSL-2 أو بي إس 3 نظرا إلى متطلبات كبيرة تدريب دعوى، ومتطلبات الإرشاد واسعة، ومتطلبات إضافية للسلامة الأحيائية الطبية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عادة الحواجز الأمنية الفعلية أكثر في منشأة BSL-4 مقابل مرفق BSL-2 أو BSL-04-06 مارس. كما هو مبين في المادة الأولى بالنسبة لنا على إجراءات BSL-4 الدخول والخروج، وموظفي المختبر الخضوع لتدريب مكثف والفحص النفسي للتأهل لدخول BSL-4 مختبر 7. Within المختبر BSL-4، وتجنب خطر العدوى والأخطاء أو التخفيف منها باتباع الإجراءات المعمول بها. البحث يجب المضي قدما بعناية وروية، مع الحد الأدنى من تعدد المهام أو الانحرافات. الانحناء في الدعاوى بالضغط الإيجابي من الصعب، ودرع الوجه قد تقيد إجراءات مثل المجهر. قفازات ضخمة تعوق أداء المهام الحركية الدقيقة، مثل التعامل مع أشياء صغيرة أو وصفها الأنابيب. لتقليل الوقت الذي يقضيه في BSL-4 مختبرات، يجب أن المتخصصين مختبر مراجعة إجراءات العمل لتحديد الخطوات التي يمكن القيام به قدما في مختبر BSL-2 ومن ثم نقل هذه المواد إلى المعمل BSL-4 لإنجاز المهمة (ق). عند إزالة المواد لمزيد من المعالجة في BSL-2 المختبر، يتم إصلاح المواد وإزالتها من مختبر BSL-4 في وعاء الثانوية مختومة. ومن أمثلة العينات التي قد تحتاج إلى إزالتها: لوحات أو أنابيب من مادة المصابة الثابتة التي سيتم تحليلها من قبل immunosorbe انزيم مرتبطالإقليم الشمالي فحص (ELISA)، المناعي فحص (IFA)، أو تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).

بالإضافة إلى مزيد من القيود المادية التي تفرضها معدات الوقاية الشخصية المطلوبة في BSL-4 مختبرات مقارنة مع أولئك في بي إس إل-2 المختبرات وإجراءات لتعطيل مسببات الأمراض عالية نتيجة في لوحات زراعة الخلايا والتخلص من النفايات هي أكثر صرامة من تلك اللازمة للبحث عن الفيروسات أقل المسببة للأمراض درس في مختبر BSL-2. كحد أدنى، ينبغي لهذه الأساليب تلبية الاحتياجات CDC. على سبيل المثال، لوحات زراعة الخلايا الملوثة وغيرها من المواد يمكن المعطل مع الكواشف الكيميائية، مثل الفورمالين محايدة مخزنة. تعامل لوحات ثقافة الخلية أو الأنابيب هي لتوضع في أكياس ختم الحرارة التي تحتوي على الفورمالين وإزالتها من المختبر عن طريق خزان دونك مليئة مطهر السائل. دلاء النفايات مليئة حلول مطهر والرش وتستخدم المطهرات لاستقبال النفايات المتولدة أثناء التجربة ولالديسي مؤقتاnfecting القفازات، وتنظيف الأسطح والأدوات المتعلقة بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، على التوالي. يعتبر رباعي محلول مطهر الأمونيوم في تركيز سرد المعيار الذهبي لجميع مختبرات الولايات المتحدة BSL-4 (بر J، والاتصالات الشخصية، 2015). وتعقيمها النفايات الصلبة من دلو النفايات للقضاء على احتمالات التلوث.

في محاولة لإظهار بصريا سير العمل والقيود المفروضة على الإجراءات العامة BSL-4، استخدمنا معيار فحص اللوحة الفيروسي كمثال على إجراء الفيروسية شيوعا. في حين وصفت الإجراء الفحص الفيروسي بشكل عام، فإننا نؤكد على إجراءات السلامة البيولوجية المستخدمة لضمان سلامة العاملين في المختبرات في هذا البروتوكول. يرجى الرجوع إلى تصورات لوحة فحص الكلاسيكية السابقة لخلفية إضافية على تقنية 8،9 وحة الفحص.

الإجراءات المقدمة هنا تتبع مواصفات BMBL التي حددها CDC 1. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المعروضة هيمحددة لIRF-فريدريك. كل مرفق BSL-4 ومختلف الإجراءات التشغيلية الموحدة (الأورام) وأساليب العمل التي تؤثر على تنفيذ تجارب في المختبر BSL-4. إجراءات بديلة لإدارة مجرى النفايات وتنفيذ فحوصات لوحة قد تختلف بناء على إدارة وتشغيل هذه المختبرات. ومع ذلك، فإن الفهم العام للالإعداد لBSL-4 دعوى المختبرات وإجراءات لأداء العمل مع الدرجة الثانية خزائن داخل بيئة BSL-4 تساعد العلماء على فهم القيود والآثار على السلامة عند التفكير في دراسات من مسببات الأمراض مخاطر عالية. زيادة الوعي من المتعاونين الخارجيين من الصعوبات المحيطة عمل في مختبر BSL-4 يمكن أن يؤدي إلى التوقعات المعدلة وسهولة أكبر في تطوير المضادة الطبية في الأوساط البحثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الدخول مختبر

  1. جمع جميع المستلزمات من مختبر BSL-2 للتجربة (على سبيل المثال، الخلايا، وسائل الإعلام، والمواد الاستهلاكية) قبل الدخول إلى المختبر BSL-4.
  2. استكمال إجراءات دخول BSL-4 (المبينة بالتفصيل في إشارة 7).

2. إعداد الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء في مختبر BSL-4

  1. مرة واحدة داخل المختبر BSL-4، وضمان أن تم الانتهاء من المرجعية الداخلية اليومية (الشكل 1). استكمال القائمة المرجعية إذا كانت المرجعية لم يتم شغل سابقا خارج وتشير والتي سوف تستخدم الفيروسات. إذا تم بالفعل الانتهاء من المرجعية، إضافة اسم والفيروس الذي سيتم استخدامه إلى القائمة.
  2. تنظيف ش.م.ب الدرجة الثانية عن طريق الرش أسفل داخل كامل من ش.م.ب (بما في ذلك وشاح) مع 5٪ المزدوج محلول مطهر الأمونيوم الرباعية (على سبيل المثال، ن ألكيل كلوريد الأمونيوم ثنائي ميثيل البنزيل، ن ألكيل ثنائي ميثيل ايثيل البنزيل الأمونيومكلوريد أو غيرها من التدابير الملائمة مطهر للعامل تستخدم) ويمسح أسفل مع المناشف الورقية 10،11. رش 70٪ من محلول الإيثانول داخل مجلس الوزراء وشاح لإزالة محلول مطهر مبتذل.
  3. إذا يجلس، تعيين كرسي أمام ش.م.ب الدرجة الثانية على ارتفاع مريح لضمان أن الجزء الخلفي من مجلس الوزراء يمكن التوصل اليه وان مواجهة أخصائي مختبر يقع فوق فتح جبهة (الشكل 2) 11.
  4. إعداد حاوية النفايات لمجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تأكد من أن تركيز النهائي من ثنائي رباعي محلول مطهر الأمونيوم في حاوية النفايات لا يقل عن 5٪. التخطيط وفقا لذلك وجعل حل 10٪ التي ستضاف النفايات التي من شأنها أن تخفف من مطهر. وبالإضافة إلى ذلك، ضع زجاجة رذاذ مع 5٪ ثنائي رباعي الأمونيوم محلول مطهر داخل BSC الدرجة الثانية للرش أي البنود قبل إزالة واليدين القفاز أثناء وبعد الانتهاء من الفحص.
  5. <لى> ضع المواد المناسبة اللازمة للتجربة برمتها في BSC الدرجة الثانية بقدر ما يعود في مجلس الوزراء وقت ممكن لتجنب المقدمات المادية المتكررة في ش.م.ب الدرجة الثانية وانقطاع تدفق الهواء 11.

3. مثال: اللوحة الفحص

  1. استرداد عينات التي تحتوي على الفيروس والسيطرة على الفيروس من موقع التخزين من جهة، وذوبان الجليد المواد في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. تسمية الآبار من 6 لوحات بشكل جيد لاستخدامها وفقا لالتخفيفات فيروس المخطط لها. بمناسبة الأغطية والجسم من لوحات لضمان مطابقة ناجحة إذا تم عزل الأغطية والجسم.
  3. جلب مواد من الخطوات 3،1-3،2 في الدرجة وش.م.ب الثاني. وضع كافة العناصر التي لم أو لن تأتي في اتصال مع الفيروس على جانب واحد ( "الجانب نظيفة") والنفايات على الجانب الآخر ( "الجانب القذر"). إذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على "العناصر النظيفة" لا يقل عن 30 سم بعيدا من "العناصر القذرة" خلال الأنشطة المدرة للالهباء الجوي 11.
  4. العمل أقرب إلى مركز من داخل الدرجة الثانية ش.م.ب وقت ممكن، كما تم تصميم المركز الداخلي ليكون الموقف الأكثر فعالية لحماية نفسه 11.
  5. إزالة 50 ميكرولتر من الفيروس عينة ومراقبة الفيروس ومكان في 450 ميكرولتر من المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر مع 2٪ الجنين المصل البقري. المضي قدما في جعل التخفيفات المسلسل كبعيد حسب الحاجة (الشكل 3A).
  6. خلال التخفيفات، مزيج من عينات الفيروس لا يقل عن 5 مرات مع طرف ماصة ببطء وبعناية في حين تسعى للحد من جيل فقاعة هواء داخل العينات. تغيير نصائح ماصة بعد كل إضافة إلى تخفيف المقبل أيضا.
  7. في التخفيف الماضي، بعد خلط العينة 5 مرات، ونبذ 50 ميكرولتر من عينة الفيروس في حاوية النفايات لضمان كميات متساوية من التخفيفات.
  8. عند التخلص من النصائح، وشطف كل طرف مع محلول مطهر من دلو النفايات لتطهير داخل وخارج غيض من قبل في طردجي طرف في دلو النفايات.
  9. مرة واحدة يتم إجراء التخفيفات، تعيين آبار تخفيف جانبا والبدء الشفط وسائل الإعلام من الآبار لوحات زراعة الخلايا، وترك 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام في كل بئر من لوحة 6 جيدا.
  10. عند الانتهاء مع ماصة، نضح مطهر حل من دلو النفايات إلى أعلى ماصة باستخدام دليل، وحجم قابل للتعديل، ودفع زر pipettor، لضمان تطهير السليم من الداخل من ماصة. ترك طرف في دلو النفايات حتى نهاية التجربة.
  11. وبمجرد إزالة وسائل الاعلام من لوحات، وإضافة 100 ميكرولتر من العينة الصحيحة في البئر السليم في لوحات وصفت مسبقا في نسختين، وتغيير نصائح لكل من كل عينة.
  12. عند الانتهاء من عملية التلقيح لوحة الفحص، رذاذ من أيدي القفاز مع محلول مطهر واستخدام منشفة ورقية مبللة بمحلول مطهر لمسح خارج كل لوحات قبل وضع لوحات العودة إلى الحاضنة باليد. إعادةالجفت هذه العملية حتى كل لوحات تعود إلى الحاضنة.
  13. موسيقى الروك لوحات في حركة الرقم 8 لضمان تشتت المناسب للعينة على الخلايا كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة.
  14. عند الانتهاء من لوحات هزاز، والعودة لوحات في ش.م.ب الدرجة الثانية جنبا إلى جنب مع خليط من المتوسطة الضروري الحد الأدنى 2X النسر و 1.6٪ الكثيراء، تراكب شبه صلبة الذي هو أسهل للتلاعب من الاغاروز، وتستخدم لتراكب من فحص اللوحة.
  15. إضافة 2 مل من مزيج تراكب على كل بئر في لوحة 6 جيدا والصخور مرة أخرى في حركة الرقم 8 التوزيع المتساوى للتراكب في جميع أنحاء سطح البئر. كرر هذه العملية حتى يتم مضافين كل ما استخدمت بشكل جيد مع الخليط تراكب.
  16. تأكد من أن غيض من ماصة المصلية لا تلمس أي سائل في الآبار لتجنب التلوث عند تنفيذ الإجراء تراكب.

4. التخلص من النفايات وتنظيف أدوات والسلامة الأحيائية مجلس الوزراء

<رأ>
  • تماما غمر جميع النفايات في محلول مطهر 5٪ في دلو النفايات لفترة الاتصال لا يقل عن 10 دقيقة. تطهير نصائح ماصة، الماصات المصلية، والنفايات الأخرى كما هو موضح أعلاه. وبالإضافة إلى ذلك، رش دلو النفايات (الداخل والخارج) مع 5٪ محلول مطهر السماح الحل يبقى في اتصال مع دلو النفايات لفترة الاتصال من 10 دقيقة.
  • أثناء انتظار وقت الاتصال لمرور للنفايات، بلل منشفة ورقية مع 5٪ محلول مطهر، مسح أسفل أدوات مثل بال micropipettes، وإخراجها من ش. رش يد القفاز مع 5٪ محلول مطهر قبل ان يصل قفاز من فئة ال BSC الثاني.
    1. بعد إزالة بال micropipettes من BSC، وتصفيتهم مع منشفة ورقية منفصلة مع 70٪ من محلول الإيثانول لتجنب تراكم لزجة على الصكوك. رش أي الأدوات التي لا يمكن أن تمحى بصورة فعالة إلى أسفل مع 5٪ مطهر وترك في اتصال مع الحل في BSC لمدة 10 دقيقة.
  • بعد وقت الاتصال كافية، وإزالة كافة العناصر من ش. اتخاذ البنود، بما في ذلك دلو النفايات التي تحتوي على مواد النفايات، الى بالوعة. شطف الأدوات التي يمكن استخدامها لإزالة بقايا مطهرة. عودة جميع البنود في جميع مواقع التخزين الخاصة بهم.
  • تنظيف سطح عمل BSC من الدرجة الثانية، والجانبين مجلس الوزراء والظهر، والمناطق الداخلية من الزجاج، وشاح 1 مع 5٪ محلول مطهر تليها 70٪ محلول الإيثانول.
  • سحب وتصريف ماصات المصلية من دلو النفايات ومكان تطهيرها سطح الماصات المصلية في صواني ماصة منفصلة عن التعقيم (يمكن الماصات المصلية تشكل خطرا الأدوات الحادة وربما المسيل للدموع خلال كيس القمامة. ضع هذه الماصات في وعاء من الصعب على الوجهين قبل التعقيم).
  • صب محتويات دلو النفايات في مصفاة توضع في قاع الحوض.
  • جلب شحنة نفايات بيولوجية الذي اصطف مع حقيبة واقية حمراء على الحوض وتفريغ محتويات straineص في ​​حقيبة واقية الحمراء. لا تصل إلى مصفاة لإزالة نصائح micropipette التي قد تلتصق داخل مصفاة. ضرب مصفاة جنبا إلى جنب داخل حاوية النفايات حتى تتم إزالة كافة النصائح، أو استخدام زوج من ملاقط لإزالة نصائح من مصفاة.
  • التشطيف دلو النفايات ومكان لتجف على الرف بجانب الحوض.
  • 5. التعقيم النفايات

    1. إزالة كيس واقية من حاوية النفايات واقية وضعها في صينية الأوتوكلاف على عربة.
    2. ترك أكياس واقية مفتوحة ووضع قطعة من شريط الأوتوكلاف على السطح الخارجي للحقيبة، وربط الجانبين من الدرج الأوتوكلاف للحفاظ على حقيبة المضمون في الدرج.
    3. وضع قطعتين من شريط الأوتوكلاف على علبة ماصة المصلية وتسميته مع واحد بالاحرف الاولى والتاريخ. وضع علبة ماصة المصلية على عربة مع علبة التعقيم.
    4. فتح الأوتوكلاف. ربط المقدمة الأوتوكلاف التحميل / التفريغ كاليفورنياغ إلى الأوتوكلاف واخراج منصة الأوتوكلاف قابل للراحة على العربة.
    5. إزالة قضيب معدني من الأوتوكلاف وفتح الجزء العلوي. ضع قارورة مؤشر البيولوجية التي تحتوي على جراثيم عصوية دهنية أليفة الحرارة إلى قضيب معدني للتأكد من أن تم الانتهاء من دورة الأوتوكلاف التعقيم بنجاح.
    6. وضع قضيب معدني في وسط كيس النفايات في علبة الأوتوكلاف ولكن تأكد من أن قضيب معدني لا يزال الوصول إليها بسهولة.
    7. وضع علبة الأوتوكلاف مليئة النفايات وصينية ماصة المصلية على منصة الأوتوكلاف قابل للسحب ودفع مرة أخرى في الأوتوكلاف.
    8. فصل الأوتوكلاف تحميل / تفريغ سلة من الأوتوكلاف وإغلاق الباب الأوتوكلاف.
    9. بدء تشغيل جهاز التعقيم.
    10. لا تترك الأوتوكلاف حتى بدأت دورة. وشاشة تعمل من الأوتوكلاف تشير إلى الوقت المتبقي لهذا المدى.
    11. بعد الانتهاء من تشغيل جهاز التعقيم، وإزالة دائرة الهجرة والجنسية البيولوجيةicator وتقييم للنمو عن طريق التسخين في حاضنة محدد. إذا تم الكشف عن نمو في مؤشر البيولوجي، وإعادة تشغيل القمامة في الأوتوكلاف، وتقييم جديد المؤشر. إذا لم يتم الكشف عن النمو، وإزالة القمامة من المنشأة.

    6. مثال: تحديد وتلون البلاك فحوصات

    1. بعد العدد المناسب من أيام (التي تعتمد على الفيروس المستخدمة) قد مرت، والعودة مرة أخرى إلى مختبر وتنفيذ الخطوات من المادتين 1 و 2 من جديد.
    2. إزالة بعناية لوحات لوحة فحص من الحاضنة الانتهاء منها في خطوة 3.1.2، ومكان في الدرجة وش.م.ب الثاني باليد.
    3. ماصة من جميع وسائل الإعلام وتراكب المواد والاستغناء في مطهر حل الحاويات واستبدالها مع خليط من 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة و 0.8٪ الكريستال البنفسجي 12،13. السماح للخليط يبقى على لوحات لمدة 30 دقيقة لإبطال نشاط الفيروس على لوحات.
    4. بعد تعطيل، وإزالة بعناية محايدمخزنة الفورمالين / الكريستال البنفسجي الخليط ووضعه في حاوية النفايات منفصلة ليتم تحييد قبل التخلص منها.
    5. رش يد القفاز مع مطهر ومسح خارج من لوحات قبل تمريرها من فئة ال BSC الثاني كما هو موضح أعلاه.
    6. انتقل إلى المصارف، شطف لوحات لإزالة وصمة عار الزائدة، ثم قم بوضع لوحات على عربة لتجف.
    7. مرة واحدة لوحات جافة تماما، استخدام مربع ضوء لحساب ويحات. تسجيل جميع التهم وحساب التتر الفيروس من المعادلة القياسية (الشكل 3B).

    7. إزالة عينات من مختبر BSL-4

    1. تعطيل أي العينات التي سيتم التلاعب بها تحت ظروف المختبر BSL-2. اتبع أحد أسلوبين التي وافق عليها المكتب الداخلي للسلامة الأحيائية في IRF-فريدريك باستخدام 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (NBF) أو Trizol LS (الفينول، ثيوسيانات غوانيدين، ثيوسيانات الأمونيوم، خلات الصوديوم، الجلسرين) 1،14. نقل ساmples إلى أنبوب جديد نظيف أو لوحة خارج BSC قبل التعبئة والتغليف لإزالة من المختبر BSL-4.
    2. للحرارة ختم العينات المعطلة في أنابيب أو لوحات في الحقيبة حرارة ختم تحتوي على ما يكفي من 5٪ مطهر أو حل تثبيتي لتطهير داخل كيس وخارج أنابيب العينات تمر نقل من مختبر BSL-4. ضع هذه الحقيبة إلى آخر الحقيبة التالية نفس الإجراء.
    3. ختم الحقيبة الثانية ووضع الحقيبة مختومة الحرارة إلى خزان دونك تحتوي على 5٪ محلول مطهر لمدة 10 دقيقة على الأقل لتطهير خارج الحقيبة مختومة الحرارة.
    4. ملء كتاب سجل خزان دونك داخل المختبر من قبل ترسيم عدد وحجم الأنابيب، وحجم في أنابيب، وكيل تستخدم، طريقة تعطيل المستخدمة، وغرفة إلى حيث سيتم نقل العينات.
    5. التنسيق مع زميل له في الخارج من المختبر BSL-4 لاسترداد الحقيبة من خزان دونك وأخذ عينات إلى المختبر BSL-2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    وفقا للإجراءات المناسبة داخل المختبر BSL-4 حاسمة لضمان إنجاز آمنة وفعالة من المقايسات. من خلال الإشارة إلى المرجعية الداخلية اليومية الانتهاء (الشكل 1)، وموظفي المختبر التأكد من أن المعدات تعمل بشكل كامل. سليم المواقع الجسم في وسط ش.م.ب يضمن أن يتم تنفيذ هذه التجربة في ظل ظروف تدفق الهواء الأمثل (الشكل 2). يتم تخفيف عينة فيروس متسلسل للحصول على لوحات التي لديها 30-300 لويحات في لوحة (الشكل 3A) وتحديد عيار الفيروس (الشكل 3B). وهناك عدد من العوامل التي تؤثر تشكيل لويحات، بما في ذلك مع الأجسام الفيروس لخطوط الخلية المضيفة، تقنية التلقيح، والشروط اللازمة لنمو الفيروسات، ومدى التخفيف المناسبة، واختيار تراكب 8. وتعقيم النفايات المتولدة في BSC أثناء إجراء صحيح قبل إزالة من BSC ومرة ​​أخرى عن طريق التعقيم قبلترك البيئة BSL-4. باتباع هذه الإجراءات، لم تسجل العدوى المكتسبة من المختبر خلال BSL-4 الأبحاث في IRF-فريدريك.

    شكل 1
    الشكل 1: نموذج اليومية الأنظمة الداخلية المرجعية الانتهاء اليومي من هذه المرجعية يضمن أن موظفي المختبر وفحص المعدات داخل المختبر (أهمها BSC) قبل الشروع في العمل. إذا تم العثور على BSC أن تكون خارج نطاق معايرة، وهذا BSC يجب عدم استخدامها، ويجب أن يتم إخطار الصيانة. كل BSCs يجب أن تكون محسوبة بشكل صحيح وفعال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: العودة وعرض جانب من عينات متخصص مختبر pipetting لفي مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (A) دلو النفايات التي تحتوي على محلول مطهر الأصفر والماصات المستخدمة للحق من لوحات بشكل جيد (B)، وزجاجة مطهر رذاذ هو حق دلو النفايات (A). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (3)
    الرقم 3: حساب عيار الفيروسية من عينة يتم التعبير عن عيار الفيروسية وحدات اللوحة تشكيل (PFU) لكل مل. لحساب عيار الفيروسية، حساب عدد لويحات واضحة المعالم (PFU) والقسمة على المنتج من معامل التخفيف (د) أضعاف حجم الفيروس المخفف تضاف إلى البئر (V).د / 53600 / 53600fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    عمل في مختبر BSL 4 يتطلب قدرا كبيرا من الوقت ومزيدا من الاهتمام بالتفاصيل. أي نوع من العمل في هذه البيئة تتطلب تدريبا جيدا وشاملة، وأصحاب الضمائر الحية. يوفر معيار لوحة الفحص الفيروسي نموذجا دقيقا لإجراء شائع للعمل مع مسببات الأمراض عالية نتيجة في مختبر BSL-4، كما ينطوي على فحص العديد من المفاهيم الرئيسية التي يجب تدريب العاملين في المختبرات.

    أول مفهوم الرئيسي هو الاستخدام الصحيح وتطبيق الممارسات الآمنة في الدرجة الثانية ش.م.ب، التي تعمل كما الاحتواء الرئيسي لمسببات الأمراض عالية نتيجة. فهم كيف يمكن لمن الدرجة الثانية ظائف ش.م.ب سوف تملي الممارسات التي تحد بشكل كبير مخاطر التعرض للأفراد. تدفق العمل من منطقة نظيفة ( "الجانب نظيفة") لمنطقة ملوثة ( "الجانب القذر") في جميع أنحاء منطقة عمل في الدرجة الثانية ش.م.ب يساعد أيضا على تجنب التلوث 11. المواد وملحق النظيفة والملوثةيجب فصل المنشأ للحد من حركة المواد الملوثة أكثر من البنود نظيفة.

    مفهوم الرئيسي الثاني هو إدارة النفايات الفيزيائية والبيولوجية. الخطوات الصحيحة في التخلص كلا النوعين من النفايات ضرورية لضمان أن المتخصصين مختبر يبقى آمنا وليس ملوثة للبيئة. صممت خطوات خلال تجربة لتعطيل وتدمير مسببات الأمراض قبل أن يتم جلب عينات من BSL-4 المختبر. ومن الأمثلة على هذه الخطوات الحاسمة وتشمل: pipetting لمطهر في كل طرف، والسماح على الأقل في وقت الاتصال 10 دقيقة من المواد التي قد تكون ملوثة مع المطهرات والنفايات التعقيم، والتحقق من صحة العقم خلال دورات الأوتوكلاف. وقد تم تصميم هذه الخطوات لتكون زائدة عن الحاجة لضمان تدمير مسببات الأمراض عالية نتيجة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics