Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) laboratorio BSL-4: 2. Pratiche generali

Immunology and Infection

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Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

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Abstract

Lavoro in un laboratorio di contenimento livello di biosicurezza 4 (BSL-4) richiede tempo e grande attenzione ai dettagli. Lo stesso lavoro che viene fatto in un laboratorio BSL-2 con gli agenti patogeni non ad alta conseguenza ci vorrà molto più tempo in un ambiente BSL-4. Questo aumento di requisito di tempo è dovuto ad una moltitudine di fattori che mirano a proteggere il ricercatore dalle infezioni acquisite in laboratorio, l'ambiente di lavoro dalla contaminazione potenziale e la comunità locale dal possibile rilascio di agenti patogeni ad alto conseguenza. All'interno del laboratorio, il movimento è limitato a causa di tubi dell'aria fissati ai obbligatorie tute di sicurezza di tutto il corpo. Inoltre, è necessaria la disinfezione di ogni elemento che viene rimosso dagli armadi classe II biosicurezza (BSC). specialisti del laboratorio devono essere addestrati nelle pratiche del laboratorio BSL-4 e devono dimostrare di alta competenza nelle abilità che stanno svolgendo. Il focus di questo articolo è quello di delineare le procedure e le tecniche per garantire laboratorio b adeguatiiosafety e precisione sperimentale utilizzando un saggio di placca virale standard, come un esempio di procedimento. In particolare, tecniche adeguate per lavorare in sicurezza in un ambiente BSL-4 durante l'esecuzione di un esperimento verrà sottolineata visivamente. Queste tecniche comprendono: la creazione di un BSC Classe II per gli esperimenti, la corretta pulizia del BSC Classe II, quando finito di lavorare, di gestione dei rifiuti e lo smaltimento sicuro dei rifiuti prodotti all'interno di un laboratorio BSL-4, e la rimozione di campioni inattivati ​​dall'interno di un BSL- 4 di laboratorio al laboratorio BSL-2.

Introduction

Poiché la sicurezza del personale di laboratorio di manipolazione di agenti patogeni ad alto conseguenza (non esistono profilassi delle infezioni, né le opzioni di trattamento) è di primaria importanza, il Dipartimento di Salute e Servizi Umani ha stabilito le linee guida per la costruzione impianto e le migliori pratiche per lo svolgimento sicuro del lavoro con agenti patogeni Biomediche e laboratori clinici dal punto di vista sicurezza biologica 1. Attraverso la legislazione e la regolamentazione, molte delle pratiche e delle procedure sono diventate requisiti obbligatori che devono essere seguite per il lavoro con questi patogeni. Negli Stati Uniti, gli agenti patogeni che possono essere facilmente trasmessi da persona a persona, portare a elevati tassi di letalità, e / o che hanno il potenziale per la maggior impatto sulla salute pubblica e bioterrorismo, sono classificati come National Institute of Health / National Institute of Allergy e infettive malattia (NIH / NIAID) Priorità a Agenti patogeni e o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism categoria a Agents 2. Inoltre, hpatogeni IGH-conseguenza sono classificati come Tier 1 selezionare gli agenti se questi agenti patogeni sono potenziali agenti di bioterrorismo, hanno un potenziale per incidenti di massa o effetti devastanti per l'economia, le infrastrutture critiche, o la fiducia del pubblico 3.

BSL-4 operazioni, compreso l'accesso agli istituti con BSL-4 laboratori, sono più altamente controllati di BSL-2/3 operazioni. Ad esempio, è sostanzialmente più difficile ottenere l'accesso a un laboratorio BSL-4 rispetto ad un laboratorio BSL-2 o BSL-3 a causa dei requisiti sostanziali di formazione tuta, ampi requisiti di mentorship, e ulteriori requisiti di biosicurezza medico. In aggiunta, ci sono tipicamente barriere di sicurezza più fisico in una struttura BSL-4 contro un BSL-2 o BSL-3 struttura 4-6. Come indicato nel nostro primo articolo sulle procedure di BSL-4 entrata e di uscita, il personale di laboratorio sottoposti a una formazione completa e screening psicologico a qualificarsi per l'ingresso nella BSL-4 di laboratorio 7. Wntro il laboratorio BSL-4, il rischio di infezione e gli errori sono evitati o mitigati seguendo procedure stabilite. La ricerca deve procedere con cautela e deliberatamente, con multitasking minimo o distrazioni. Chinandosi in giacca e cravatta a pressione positiva è difficile, e la visiera può limitare le procedure, come la microscopia. guanti ingombranti ostacolano lo svolgimento delle funzioni motorie, come ad esempio la manipolazione di piccoli oggetti o l'etichettatura tubi. Per ridurre al minimo il tempo trascorso in BSL-4 laboratori, specialisti del laboratorio dovrebbero rivedere le procedure di lavoro per identificare i passi che può essere fatto in anticipo in un laboratorio BSL-2 e quindi il trasporto di questi materiali nel laboratorio BSL-4 per il completamento del compito (s). Durante la rimozione di materiali per l'ulteriore elaborazione in BSL-2 di laboratorio, i materiali sono fissi e rimossi dal laboratorio BSL-4 in un contenitore secondario sigillato. Esempi di campioni che possono avere bisogno di essere rimosso includono: lastre o tubi di materiale infetto fisse che verranno analizzati da immunosorbe enzyme-linkedsaggio nt (ELISA), test di immunofluorescenza (IFA), o la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Oltre ad essere più limiti fisici imposti dal dispositivo di protezione individuale richiesto nella BSL-4 laboratori a confronto con quelli BSL-2 laboratori, le procedure per l'inattivazione degli agenti patogeni ad alto conseguenza in piastre di coltura cellulare e lo smaltimento dei rifiuti sono più rigorosi di quelli necessari per i virus meno patogeni studiata in un laboratorio BSL-2. Come minimo, questi metodi dovrebbero soddisfare le richieste del CDC. Per esempio, piastre di coltura cellulare contaminati e altri materiali possono essere inattivati ​​con reagenti chimici, quali formalina neutra tamponata. piastre di coltura cellulare o tubi trattati saranno collocate in buste termosaldante contenenti formalina e rimosso dal laboratorio con un serbatoio dunk riempito con un liquido disinfettante. secchi rifiuti pieni di soluzioni disinfettanti e spray disinfettanti vengono utilizzati per ricevere temporaneamente i rifiuti prodotti durante l'esperimento e per disinfecting guanti, la pulizia di superfici e strumenti armadio biosicurezza, rispettivamente. Quaternario di ammonio in soluzione disinfettante alla concentrazione indicata è considerata il gold standard per tutti gli Stati Uniti BSL-4 laboratori (Barr J, comunicazione personale, 2015). Rifiuti solidi da un secchio di rifiuti è in autoclave per eliminare rischio di contaminazione.

Nel tentativo di dimostrare visivamente il flusso di lavoro e limitazioni di procedure generali BSL-4, abbiamo usato un saggio di placca virale standard come esempio di una procedura virale comunemente usato. Mentre la procedura del test virale è descritta in generale, sottolineiamo le procedure di biosicurezza utilizzate per garantire la sicurezza del personale di laboratorio in questo protocollo. Si prega di fare riferimento alle precedenti visualizzazioni saggio di placca classici per il fondo supplementare sul saggio di placca tecnica di 8,9.

Le procedure qui presentati seguono le specifiche BMBL delineate dal CDC 1. Tuttavia, i protocolli sono presentatispecifica al IRF-Frederick. Ogni struttura BSL-4 ha diverse procedure operative standard (SOP) e dei metodi operativi che influenzano l'esecuzione di esperimenti all'interno del laboratorio BSL-4. Procedure alternative per la gestione dei rifiuti e l'esecuzione di test di placca può variare in base sulla gestione e il funzionamento di questi laboratori. Tuttavia, una comprensione generale del setup di un BSL-4 di laboratorio e le procedure per l'esecuzione di lavori di classe II armadi all'interno dell'ambiente BSL-4 tuta aiuterà gli scienziati a capire i vincoli e le implicazioni di sicurezza quando contemplando studi di agenti patogeni ad alto rischio. Una maggiore consapevolezza di collaboratori esterni delle difficoltà che lavoro in un laboratorio BSL-4 circostanti può portare ad aspettative regolato e maggiore facilità nello sviluppo di contromisure mediche nella comunità di ricerca.

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Protocol

1. Ingresso Laboratorio

  1. Raccogliere tutte le forniture da un laboratorio BSL-2 per l'esperimento (per esempio, le cellule, i media, e materiali di consumo) prima dell'entrata in laboratorio BSL-4.
  2. Completare la procedura di inserimento BSL-4 (descritto in dettaglio in riferimento 7).

2. Preparazione di una classe II biosicurezza Gabinetto nel laboratorio BSL-4

  1. Una volta all'interno del laboratorio BSL-4, assicurare la lista di controllo interno giornaliero (Figura 1) è stato completato. Completare l'elenco di controllo se la lista di controllo non è stato precedentemente compilato e indicare quali saranno utilizzati i virus. Se la lista di controllo è già stato completato, aggiungere il nome e che il virus sarà utilizzato per la lista.
  2. Pulire la BSC Classe II spruzzando lungo l'intero interno del BSC (compreso l'anta) con soluzione al 5% dual ammonio quaternario disinfettante (ad esempio, n-alchil dimetil ammonio cloruro benzilico, n-alchil dimetil benzil ammonio etilecloruro o altra appropriata disinfettanti per l'agente in uso) e pulire con carta assorbente 10,11. Spruzzare soluzione di etanolo al 70% all'interno del mobile ed il telaio per rimuovere la soluzione disinfettante appiccicosa.
  3. Se seduto, impostare la sedia davanti al BSC Classe II ad un'altezza comoda per assicurare che la parte posteriore del mobile può essere raggiunta e che la faccia dello specialista di laboratorio si trova sopra l'apertura frontale (Figura 2) 11.
  4. Preparare un contenitore per rifiuti per l'armadio biosicurezza. Assicurarsi che la concentrazione finale della soluzione duale ammonio quaternario disinfettante nel contenitore rifiuti non è inferiore al 5%. Piano di conseguenza e fare una soluzione al 10% a cui sarà aggiunto rifiuti che diluire il disinfettante. Inoltre, inserire un flacone spray con duplice soluzione di ammonio quaternario disinfettante 5% all'interno della classe II BSC per spruzzare tutti gli elementi prima di rimozione e le mani guantate durante e dopo il completamento del test.
  5. <li> Posizionare i materiali appropriati necessari per l'intero esperimento nella Classe II BSC fin nel gabinetto possibile per evitare introduzioni di materiale ripetuti nel BSC Classe II e interruzione del flusso d'aria 11.

3. Esempio: Plaque Assay

  1. Recupera campioni di virus contenenti virus e controllare dalla posizione di archiviazione a mano e scongelare i materiali in un incubatore a 37 ° C.
  2. Etichettare i pozzetti delle 6 pozzetti da utilizzare a seconda delle diluizioni di virus programmati. Segnare i coperchi e corpo delle piastre per garantire la corrispondenza successo se i coperchi e il corpo sono separati.
  3. Portare i materiali da passaggi 3.1-3.2 nel BSC Classe II. Mettere tutti gli elementi che non hanno o non entrano a contatto con il virus su un lato ( "lato pulito") e rifiuti sull'altro lato ( "lato sporco"). Se possibile, mantenere "puliti" articoli di almeno 30 cm di distanza da "oggetti sporchi" durante le attività di aerosol che generano 11.
  4. Il lavoro come vicino al centro all'interno della Classe II BSC possibile, il centro interno è progettato per essere la posizione più efficace per proteggersi 11.
  5. Rimuovere 50 ml di campione e controllo del virus virus e mettere in 450 ml di modificata mezzo di Eagle Dulbecco con il 2% di siero fetale bovino. Procedere con fare diluizioni seriali come lontano come necessario (Figura 3A).
  6. Durante le diluizioni, mescolare i campioni di virus almeno 5 volte con una punta della pipetta lentamente e con attenzione, cercando di ridurre al minimo la generazione di bolle d'aria nei campioni. Cambiare i puntali delle pipette dopo ogni aggiunta alla successiva diluizione bene.
  7. Nell'ultimo diluizione, dopo la miscelazione del campione 5 volte, scarta 50 ml di campione di virus nel contenitore dei rifiuti per garantire volumi uguali di diluizioni.
  8. Per lo smaltimento delle punte, sciacquare ogni punta con soluzione disinfettante dal secchio dei rifiuti per decontaminare l'interno e l'esterno della punta prima di espellereing punta nel secchio dei rifiuti.
  9. Una volta che le diluizioni sono fatte, impostare i pozzi di diluizione da parte e iniziare l'aspirazione dei media dai pozzi di piastre di coltura delle cellule, lasciando 500 ml di media in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
  10. Una volta terminato con la punta della pipetta, aspirare soluzione disinfettante dal secchio rifiuti all'inizio della pipetta utilizzando un manuale, volume regolabile, pulsante pipettatore, per garantire la corretta decontaminazione della parte interna della pipetta. Lasciare la punta nel secchio rifiuti fino alla fine dell'esperimento.
  11. Una volta che i mezzi sono stati rimossi dalle piastre, aggiungere 100 ml di campione corretta nella appropriata bene nelle piastre pre-etichettati in duplicato, cambiando punte ciascuno per ogni campione.
  12. Al completamento delle vaccinazioni saggio di placca, spruzzare fuori mani guantate con la soluzione disinfettante e utilizzare un tovagliolo di carta imbevuto di soluzione disinfettante per pulire la parte esterna di tutti i piatti prima di posizionare le piastre di nuovo nel incubatore a mano. Ritorba questo processo fino a quando tutti i piatti sono di nuovo nel incubatore.
  13. Oscillare le piastre in un movimento figura-8 per garantire un'adeguata dispersione del campione sulle celle ogni 15 minuti per 1 ora.
  14. Al completamento di piastre oscillanti, restituire piastre nel BSC Classe II insieme ad una miscela di mezzo essenziale minimo di 2x Aquila e 1,6% adragante, una sovrapposizione semi-solido che è più facile da manipolare di agarosio, usata per la sovrapposizione del saggio di placca.
  15. Aggiungere 2 ml della miscela overlay a ciascun pozzetto in una piastra da 6 pozzetti e rock ancora una volta in un movimento figura a 8 per equa distribuzione della sovrapposizione tutta la superficie del pozzetto. Ripetere questa operazione fino a che ogni usato bene si sovrappone con la miscela di sovrapposizione.
  16. Assicurarsi che la punta della pipetta sierologica non tocca alcun liquido nei pozzetti per evitare la contaminazione incrociata durante l'esecuzione della procedura di sovrapposizione.

4. smaltimento dei rifiuti e pulizia degli strumenti e biosicurezza Cabinet

<ol>
  • Completamente sommergere tutti i rifiuti in una soluzione disinfettante 5% nel secchio rifiuti per un tempo di contatto di almeno 10 min. Disinfettare punte di pipette, pipette sierologiche, e altri rifiuti come descritto sopra. Inoltre, spruzzare la benna residua (dentro e fuori) con soluzione disinfettante 5% lascia la soluzione rimanere in contatto con il secchio rifiuti per un tempo di contatto di 10 min.
  • In attesa che il tempo di contatto che deve trascorrere per i rifiuti, immergere un tovagliolo di carta con soluzione disinfettante 5%, pulire strumenti come micropipette, e rimuoverli dal BSC. Spray mani guantate con soluzione disinfettante 5% prima di portare le mani guantate fuori dal BSC Classe II.
    1. Dopo aver rimosso le micropipette dalla BSC, pulirli con un tovagliolo di carta separata con una soluzione di etanolo al 70% per evitare l'accumulo di appiccicoso sugli strumenti. Spray eventuali strumenti che non possono essere puliti efficacemente giù con 5% disinfettante e lasciare a contatto con la soluzione nel BSC per 10 min.
  • Dopo il tempo di contatto sufficiente, rimuovere tutti gli elementi dal BSC. Prendere elementi, tra cui secchio rifiuti contenenti materiali di scarto, al lavandino. Risciacquare gli elementi che possono essere riutilizzati per rimuovere i residui di disinfettante. Restituire tutti gli articoli alle loro posizioni di archiviazione.
  • Pulire la superficie di lavoro della BSC Classe II, le parti di gabinetto e posteriore, interni di vetro, e battente 1 con soluzione disinfettante 5% seguiti da soluzione di etanolo al 70%.
  • Estrarre e scaricare il pipette sierologiche dal secchio dei rifiuti e luogo superficie disinfettati pipette sierologiche in vassoi di pipette separate per la sterilizzazione in autoclave (pipette sierologiche possono rappresentare un pericolo taglienti e possono strappare attraverso il sacco della spazzatura. Mettere queste pipette in un contenitore rigida prima autoclave).
  • Versare il contenuto del secchio rifiuti in un filtro posto nella parte inferiore del dissipatore.
  • Portare un contenitore per rifiuti biologici, che è allineato con un sacchetto di rischio biologico rosso al lavandino e scaricare il contenuto del strainer all'interno del sacchetto rosso. Non toccare il filtro per rimuovere punte micropipetta che possono attaccarsi all'interno del filtro. Hit il filtro lungo l'interno del contenitore rifiuti finché tutti punte vengono rimossi, o usare una pinzetta per rimuovere punte dal filtro.
  • Risciacquare il secchio rifiuti e posto ad asciugare sulla cremagliera al lavello.
  • Rifiuti 5. autoclave

    1. Rimuovere la borsa di rischio biologico dal contenitore per rifiuti biologici e posto in un vassoio autoclave su un carrello.
    2. Lasciare sacchetti biohazard aperto e posizionare un pezzo di nastro autoclave sull'esterno della borsa, che collega i lati del vassoio autoclave per mantenere il sacchetto fissato nel vassoio.
    3. Mettere due pezzi di nastro autoclave sul vassoio punta della pipetta sierologica ed etichettarlo con le proprie iniziali e la data. Posizionare il vassoio pipetta sierologica sul carrello con il vassoio in autoclave.
    4. Aprire l'autoclave. Collegare il previsto dell'autoclave di carico / scarico cart all'autoclave e far emergere la piattaforma autoclave retrattile a riposo sul carrello.
    5. Rimuovere la barra di metallo dall'autoclave e aprire la parte superiore. Mettere un indicatore flacone biologico contenente spore di Bacillus Stearothermophilus in asta di metallo per verificare che il ciclo di sterilizzazione in autoclave è stata completata con successo.
    6. Posizionare l'asta di metallo nel centro del sacco rifiuti nel vassoio autoclave è da osservare che la barra di metallo è comunque facilmente raggiungibile.
    7. Mettere vassoio autoclave piena di rifiuti e il vassoio pipetta sierologica sulla piattaforma dell'autoclave retrattile e spingerlo indietro in autoclave.
    8. Staccare l'autoclave carico / scarico della spesa dall'autoclave e chiudere lo sportello dell'autoclave.
    9. Avviare l'autoclave.
    10. Non lasciare l'autoclave fino a quando è iniziato il ciclo. Lo schermo di funzionamento dell'autoclave indicherà il tempo rimanente per quella corsa.
    11. Dopo la corsa in autoclave, rimuovere l'ind biologicaicator e valutare la crescita mediante riscaldamento in un incubatore specificato. Se viene rilevata una crescita sul indicatore biologico, eseguire nuovamente la spazzatura in autoclave, e valutare di nuovo l'indicatore. Se non viene rilevato alcun crescita, togliere la spazzatura dalla struttura.

    6. Esempio: fissaggio e la colorazione della placca saggi

    1. Dopo il numero appropriato di giorni (che dipende virus impiegato) ha superato, ritornare nel laboratorio ed eseguire passi da sezioni 1 e 2 una volta.
    2. Rimuovere con attenzione le piastre saggio di placca dal termostato completato nella fase 3.1.2, e posto in Classe BSC II a mano.
    3. Pipettare off tutto il materiale media e overlay e versare in un contenitore soluzione disinfettante e sostituirla con una miscela di 10% formalina tamponata neutra e 0,8% cristalvioletto 12,13. Lasciare il composto rimane sulle piastre per 30 minuti per inattivare il virus sulle piastre.
    4. Dopo l'inattivazione, rimuovere con attenzione il neutrotamponata miscela viola in formalina / cristallo e posto in un contenitore di rifiuti separato per essere neutralizzati prima della disposizione.
    5. Spruzzare mani guantate con disinfettante e pulire l'esterno delle piastre prima di passarli fuori dal BSC Classe II come descritto sopra.
    6. Procedere al lavandino, lavare i piatti per rimuovere l'eccesso macchia, e quindi posizionare le piastre su un carrello ad asciugare.
    7. Una volta che le piastre sono completamente asciutti, utilizzare una casella di luce per contare le placche. Registrare tutti i conteggi e calcolare titoli dei virus dal equazione standard (Figura 3B).

    7. Rimuovere campioni dal laboratorio BSL-4

    1. Inattivare i campioni che saranno manipolati sotto BSL-2 condizioni di laboratorio. Seguire uno dei due metodi approvati dall'ufficio biosicurezza interna presso l'IRF-Federico utilizzando formalina al 10% neutra tamponata (NBF) o Trizol LS (fenolo, guanidina isotiocianato, tiocianato di ammonio, sodio acetato, glicerolo) 1,14. Trasferimento samples in una nuova provetta pulita o piastra esterna del BSC prima del confezionamento per la rimozione dal laboratorio BSL-4.
    2. campioni inattivati ​​termosaldabile in tubi o piastre in un sacchetto termosaldabile contenente sufficienti 5% disinfettante o soluzione fissativa per disinfettare l'interno del sacchetto e l'esterno delle provette per campioni sottoposti trasferimento dal laboratorio BSL-4. Inserire questo sacchetto in un altro sacchetto seguente stessa procedura.
    3. Sigillare la seconda sacca e posizionare la busta termosaldata in un serbatoio dunk contenente soluzione disinfettante 5% per almeno 10 minuti per disinfettare l'esterno della tasca termosaldata.
    4. Compilare un diario di bordo dunk serbatoio all'interno del laboratorio delineando il numero e le dimensioni dei tubi, volume in tubi, agente utilizzato, il metodo utilizzato inattivazione, e la sala dove verranno trasferiti i campioni.
    5. Coordinate con un collega sulla parte esterna del laboratorio BSL-4 per recuperare il sacchetto dal serbatoio dunk e prelevare campioni al laboratorio BSL-2.

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    Representative Results

    A seguito di procedure corrette all'interno del laboratorio BSL-4 sono fondamentali per garantire il completamento sicuro ed efficace di test. Con riferimento alla lista di controllo interno giornaliero completato (Figura 1), personale di laboratorio affinché le attrezzature è pienamente operativo. Posizionamento del corpo corretto nel centro della BSC assicura che l'esperimento viene eseguito in condizioni di flusso dell'aria ottimali (Figura 2). Il campione virus viene diluito serialmente per ottenere lastre che hanno 30-300 placche per piastra (Figura 3A) e nel determinare virus titolo (Figura 3B). Un certo numero di fattori influenzano la formazione di placche, tra cui tropismo virus per linee di cellule ospite, tecnica di inoculazione, le condizioni per la crescita del virus, gamma di diluizioni del caso, e la selezione di sovrapposizione 8. Rifiuti generati nel BSC durante la procedura è correttamente disinfettata prima della rimozione dal BSC e ancora in autoclave primalasciando l'ambiente BSL-4. Seguendo queste procedure, non infezioni acquisite in laboratorio sono stati registrati nel corso BSL-4 ricerca presso l'IRF-Federico.

    Figura 1
    Figura 1:. Esempio sistemi interni quotidiano lista completamento quotidiano di questa lista di controllo assicura che il personale di laboratorio ha verificato attrezzature all'interno del laboratorio (soprattutto il BSC) prima di iniziare il lavoro. Se il BSC si trova al di fuori del campo calibrato, questo BSC non deve essere usato, e la manutenzione deve essere notificato. Tutti BSC deve essere opportunamente calibrato e funzionante. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    figura 2:. Vista posteriore e laterale di un campione specialista di laboratorio pipettaggio in una classe II armadio biosicurezza (A) secchio di rifiuti contenenti soluzione disinfettante giallo e pipette usate sono a destra delle piastre e (B), e la bottiglia spray disinfettante è quello di il diritto della benna rifiuti (a). clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3: Calcolo del titolo virale di campione titolo virale è espresso in unità formanti placca (PFU) per millilitro.. Per calcolare il titolo virale, contare il numero di placche chiaramente definiti (PFU) e dividere per il prodotto del fattore di diluizione (d) volte il volume di virus diluito aggiunto al pozzo (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Lavoro in un laboratorio BSL-4 richiede molto tempo e ulteriore attenzione ai dettagli. Qualsiasi tipo di lavoro in questo ambiente richiede ben addestrato, approfondita, e gli individui coscienziosi. Il saggio di placca virale standard fornisce un modello accurato di una procedura comune per lavorare con gli agenti patogeni ad alto conseguenza in laboratorio BSL-4, come il saggio coinvolge alcuni importanti concetti in cui devono essere addestrati personale di laboratorio.

    Il primo concetto importante è l'uso corretto e l'applicazione delle procedure di sicurezza in classe II BSC, che funge da contenimento primario per gli agenti patogeni ad alto conseguenza. Comprensione di come una classe II funzioni BSC detterà le pratiche che limitano notevolmente i rischi di esposizione per gli individui. Il flusso di lavoro da una zona pulita ( "lato pulito") per una zona contaminata ( "lato sporco") attraverso la zona di lavoro in classe II BSC aiuta anche ad evitare la contaminazione incrociata 11. materiali e suppl pulite e contaminatii devono essere separati per limitare il movimento di oggetti contaminati oltre stoviglie pulite.

    Il secondo concetto principale è la gestione dei rifiuti fisico e biologico. misure adeguate a smaltire entrambi i tipi di rifiuti sono essenziali per garantire che gli specialisti del laboratorio rimane sicuro e l'ambiente non è contaminato. I passaggi durante un esperimento sono stati progettati per inattivare e distruggere gli agenti patogeni prima che i campioni vengono portati fuori BSL-4 di laboratorio. Esempi di tali punti critici includono: pipettando disinfettante in ogni punta, consentendo almeno un tempo di contatto 10 min di materiali potenzialmente contaminati con disinfettanti, rifiuti autoclave, e convalidare la sterilità durante i cicli di autoclave. Questi passaggi sono progettati per essere ridondanti per garantire la distruzione di agenti patogeni ad alto conseguenza.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

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