Misure di sicurezza e procedure operative in un (A) laboratorio BSL-4: 2. Pratiche generali

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare le pratiche sicure quando si lavora in un laboratorio di biosicurezza con tuta di livello 4 utilizzando il test della placca come esempio. Questa procedura dimostra le modifiche necessarie per eseguire un test standard della placca in un ambiente di biosicurezza di livello 4. A dimostrare la procedura con me è Tracey Burdette, un tecnico dell'Integrated Research Facility.

Dopo aver completato la lista di controllo giornaliera dei sistemi interni, pulire la cabina di sicurezza biologica di classe II spruzzando all'interno, compresa l'anta, una soluzione disinfettante di ammonio quaternario doppio al 5%. Quindi, pulisci l'armadio con carta assorbente, assicurandoti di lasciare il flacone spray contenente la soluzione disinfettante all'interno dell'armadio per spruzzare le mani guantate durante e dopo il completamento del test. Spruzzare una soluzione di etanolo al 70% all'interno dell'armadio e dell'anta per rimuovere la soluzione disinfettante appiccicosa.

Preparare un contenitore per i rifiuti per la cabina di biosicurezza. Assicurarsi che la concentrazione finale della soluzione disinfettante a doppio ammonio quaternario nel contenitore dei rifiuti non sia inferiore al 5%, tenendo conto di qualsiasi liquido aggiuntivo aggiunto. Posizionare il contenitore dei rifiuti contenente il 5% di soluzione disinfettante di ammonio quaternario doppio all'interno della cabina di biosicurezza di classe II.

Eseguire tutti i lavori il più vicino possibile al centro interno della cabina di biosicurezza di classe II. Il centro interno è progettato per essere la posizione più affettiva per proteggersi. Rimuovere 50 microlitri di campione virale e virus di controllo e metterli in 450 microlitri di terreno Dulbecco's Modified Eagle's con il 2% di siero fetale bovino in pozzetti di diluizione.

Procedere con l'esecuzione di diluizioni seriali fino a quando necessario. Mescolare i campioni di virus almeno cinque volte con un puntale per pipetta, cambiando i puntali dopo ogni diluizione. Mescolare lentamente per ridurre al minimo la generazione di bolle d'aria nei campioni.

Al termine, mettere da parte i pozzetti di diluizione. Quando si smaltiscono i puntali, sciacquare ogni puntale con una soluzione disinfettante dal secchio dei rifiuti per decontaminare l'interno e l'esterno del puntale prima di espellere il puntale nel secchio dei rifiuti. Rimuovere la maggior parte del terreno dai pozzetti delle piastre di coltura cellulare a sei pozzetti.

Aggiungere 100 microlitri del campione corretto nell'apposito pozzetto delle piastre pre-marcate in duplicato. Al termine, spruzzare le mani guantate con la soluzione disinfettante. Utilizzare un tovagliolo di carta imbevuto di soluzione disinfettante per pulire l'esterno di tutte le piastre prima di posizionare le piastre nell'incubatrice a mano.

Scuotere le piastre con un movimento a forma di 8 per garantire una corretta dispersione del campione sulle celle ogni 15 minuti per un'ora. Aggiungere due millilitri della miscela di rivestimento a ciascun pozzetto e oscillare ancora una volta con un movimento a forma di 8 per una distribuzione uniforme del rivestimento su tutta la superficie del pozzo. Immergere completamente tutto il materiale di scarto in una soluzione disinfettante al 5% nel secchio dei rifiuti per un tempo di contatto di almeno 10 minuti.

Spruzzare l'interno e l'esterno del secchio dei rifiuti, l'interno della cabina di biosicurezza di classe II, l'esterno dell'attrezzatura e le mani guantate con una soluzione disinfettante al 5%. Lasciare che la soluzione rimanga nel secchio dei rifiuti e su altre superfici per un tempo di contatto di 10 minuti. Quindi rimuovere gli oggetti dalla cabina di biosicurezza e portarli nel lavandino.

Posizionare la pipetta usata in un vassoio per pipette per la sterilizzazione in autoclave. Versare il contenuto del secchio dei rifiuti in un colino nel lavandino. Quindi porta nel lavandino un contenitore per rifiuti a rischio biologico rivestito con un sacchetto rosso per il rischio biologico e scarica il contenuto del colino nel sacchetto rosso per il rischio biologico.

Posizionare la sacca per rischio biologico su un vassoio per autoclave su un carrello. Chiudere senza stringere le sacche dell'autoclave con del nastro adesivo che permetta al vapore di entrare nella sacca. Ed etichettare uno dei nastri dell'autoclave con le proprie iniziali e la data.

Rimuovere l'asta metallica forata dall'autoclave e aprire la parte superiore. Posizionare una fiala di indicatore biologico contenente spore di Geobacillus stearothermophilus nell'asta metallica per verificare che il ciclo di sterilizzazione in autoclave si completi con successo. Posizionare la vaschetta dell'autoclave piena di rifiuti nell'autoclave.

Avviare l'autoclave e verificare che il ciclo sia iniziato. La schermata di funzionamento dell'autoclave indicherà il tempo rimanente per quella corsa. Al termine del periodo di incubazione richiesto, rimuovere con cautela le piastre di analisi della placca dall'incubatore e posizionarle manualmente nella cabina di biosicurezza pulita di classe II.

Aspirare il terreno e il materiale di rivestimento con una pipetta ed erogare nel contenitore della soluzione disinfettante. Sostituire il terreno con una miscela di formalina tamponata neutra al 10% e cristallovioletto allo 0,8% per inattivare il virus per un tempo di contatto di 30 minuti. Dopo l'inattivazione, rimuovere con cautela la miscela di formalina neutra tamponata/cristallovioletto e metterla in un contenitore per rifiuti separato da neutralizzare prima dello smaltimento.

Al lavandino, sciacquare le piastre per rimuovere le macchie in eccesso e poi posizionare le piastre in un vassoio ad asciugare completamente. Usa una scatola luminosa per contare le targhe. Registra tutti i conteggi e calcola i titoli virali dall'equazione standard.

Per la rimozione di campioni inattivati dal laboratorio BSL-4, posizionare le provette o le piastre in un sacchetto termosaldato. Spruzzare l'interno della sacca con una soluzione disinfettante o fissativa al 5%, per disinfettare l'interno della sacca e l'esterno delle provette del campione. E poi sigillare a caldo il sacchetto.

Metti questa busta in un'altra busta seguendo la stessa procedura. Sigillare a caldo la seconda busta e posizionare le buste a doppia chiusura in una vasca da immersione contenente il 5% di soluzione disinfettante per almeno 10 minuti, per disinfettare l'esterno delle buste. Compila un registro delle bombole all'interno del laboratorio delineando il numero e le dimensioni delle provette, il volume nelle provette, l'agente utilizzato, il metodo di inattivazione utilizzato e la stanza in cui verranno trasferiti i campioni.

Seguire le procedure corrette all'interno del laboratorio di biosicurezza di livello 4 è fondamentale per garantire il completamento sicuro ed efficace dei saggi. Facendo riferimento alla lista di controllo interna compilata quotidianamente, il personale di laboratorio garantisce che le apparecchiature siano pienamente operative. Il campione di virus viene diluito in serie per ottenere piastre con 30-300 placche per pozzetto e per determinare il titolo del virus.

Una serie di fattori influenzano la formazione delle placche, tra cui il tropismo virale per le linee cellulari ospiti, la tecnica di inoculazione, le condizioni per la crescita del virus, l'intervallo di diluizione appropriato e la selezione della sovrapposizione. I rifiuti generati nella cabina di biosicurezza durante la procedura vengono disinfettati due volte. I rifiuti vengono adeguatamente disinfettati una volta prima di essere rimossi dalla cabina di biosicurezza.

Successivamente, i rifiuti vengono sterilizzati in autoclave prima di lasciare l'ambiente di biosicurezza animale di livello 4. Seguendo queste procedure, non sono state registrate infezioni acquisite in laboratorio durante la ricerca di livello 4 sulla biosicurezza animale presso l'Integrated Research Facility di Frederick. Questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore a seconda del numero di campioni, se la tecnica viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di eseguire correttamente le diluizioni, contare le placche di conseguenza e rispettare tutte le precauzioni di sicurezza, per garantire un esperimento sicuro e di successo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei limiti fisici imposti dalle tute a pressione positiva e del tempo aggiuntivo necessario per completare un test standard della placca