Sikkerhetstiltak og driftsprosedyrer i en (A) BSL-4 Laboratorium: 2. Generelle Practices

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Arbeid i et biosikkerhetsnivå 4 (BSL-4) oppdemming laboratorium krever tid og stor oppmerksomhet på detaljer. Det samme arbeidet som er gjort i en BSL-2 laboratorium med non-high-konsekvens patogener vil ta betydelig lenger i en BSL-4 setting. Denne økte tidskrav er på grunn av en rekke faktorer som er rettet mot å beskytte forsker fra laboratorieinfeksjoner, arbeidsmiljøet mot mulig forurensning og lokalsamfunnet fra mulig frigjøring av høy konsekvens patogener. Inne i laboratoriet, er bevegelsen begrenset på grunn av luftslanger festet til de obligatoriske kropps sikkerhetsdrakter. I tillegg er desinfeksjon av hvert element som er fjernet fra klasse II biosikkerhet skap (BSC) nødvendig. Laboratorie spesialister må trenes i praksis av BSL-4 laboratorium, og må vise høy kompetanse i ferdigheter de utfører. Fokuset i denne artikkelen er å skissere riktige prosedyrer og teknikker for å sikre laboratorium biosafety og eksperimentell nøyaktighet ved anvendelse av en standard virus-plaque-analysen som et eksempel prosedyre. Spesielt til riktige teknikker arbeide trygt i en BSL-4-miljø når du utfører et eksperiment vil bli visuelt vektlagt. Disse teknikkene inkluderer: å sette opp en klasse II BSC for eksperimenter, riktig rengjøring av klasse II BSC når du er ferdig å jobbe, avfallshåndtering og trygg avhending av avfall inne i en BSL-4 laboratorium, og fjerning av inaktiverte prøver fra inne i en BSL- 4 laboratorium til laboratorium BSL-2.

Introduction

Som sikkerhet for laboratoriepersonell som håndterer høy konsekvens patogener (ingen infeksjon prophylaxes eller behandlingstilbud finnes) er viktig, har det amerikanske Department of Health and Human Services fastsatt retningslinjer for bygging og installasjon og beste praksis for sikker utføring av arbeid med patogener i biomedisinsk og kliniske laboratorier fra et biosikkerhet perspektiv en. Gjennom lovgivning og regulering, mange av de rutiner og prosedyrer er blitt obligatoriske krav som må følges for arbeid med disse patogener. I USA patogener som er lett overføres fra person til person, resultere i høye letalitet priser, og / eller har potensial for stor innvirkning på folkehelsen og bioterrorisme, er kategorisert som National Institute of Health / National Institute of Allergy og smittsomme sykdom (NIH / NIAID) Prioritet A patogener og eller Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bioterrorisme Kategori A Agents 2. I tillegg high-konsekvens patogener er klassifisert som Tier 1 Velg Agents hvis disse patogener er potensielle bekjempe bioterrorisme agenter, har potensiale for masse havarier eller ødeleggende effekter på økonomien, kritisk infrastruktur, eller tillit tre.

BSL-4 operasjoner, inkludert tilgang til institutter med BSL-4 laboratorier, er mer svært kontrollert enn BSL-2/3 operasjoner. For eksempel er det vesentlig vanskeligere å få tilgang til en BSL-4 laboratorium i forhold til en BSL-2 eller BSL-3 laboratorium på grunn av betydelige dress krav til opplæring, omfattende mentorer krav, og ytterligere medisinsk biologisk forutsetninger. I tillegg er det vanligvis flere fysiske sikkerhetsbarrierer i et BSL-4- versus en BSL-2 eller BSL-3-anlegget 4-6. Som beskrevet i vår første artikkel om BSL-4 Åpnings- og avslutningsprosedyrer, laboratoriepersonell gjennomgå omfattende opplæring og psykologisk screening for å kvalifisere for inngangen til BSL-4 laboratorium 7. WTVen på BSL-4 laboratorium, er risikoen for infeksjoner og feil unngås eller reduseres ved å følge etablerte prosedyrer. Forskningen må gå forsiktig og bevisst, med minimal multitasking eller distraksjoner. Bøyd over i overtrykks dresser er vanskelig, og visir kan begrense prosedyrer som mikroskopi. Klumpete hansker hindre utførelsen av finmotoriske oppgaver, for eksempel håndtering av små gjenstander eller merking rør. For å minimere tiden brukt i BSL-4 laboratorier, bør laboratorie eksperter vurderer arbeidsprosedyrer for å identifisere tiltak som kan gjøres videre i en BSL-2 laboratoriet og deretter transportere disse materialene inn i BSL-4 laboratorium for gjennomføring av oppgaven (e). Ved fjerning av materialer for videre bearbeiding i BSL-2 laboratorium, blir materialene fast og fjernet fra BSL-4-laboratoriet i en forseglet sekundær beholder. Eksempler på prøver som kanskje må fjernes er: faste plater eller rør av infisert materiale som vil bli analysert ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescens-analyse (IFA) eller polymerase kjedereaksjon (PCR).

I tillegg til større fysiske begrensninger som følger av personlig verneutstyr som kreves i BSL-4 laboratorier i forhold til de i BSL-2 laboratorier, rutiner for inaktivering av høy konsekvens patogener i cellekulturplater og avfallshåndtering er strengere enn de som trengs for mindre patogene virus undersøkt i en BSL-2 laboratorium. Som et minimum bør disse metodene oppfyller CDC kravet. For eksempel kan forurensede cellekulturplater og andre materialer bli inaktivert med kjemiske reagenser, så som nøytral bufret formalin. Behandlede cellekulturplater eller rør som skal plasseres i et varmeforseglet poser inneholdende formalin og fjernet fra laboratoriet via en dunk tank fylt med en væske desinfeksjonsmiddel. Avfalls bøtter fylt med desinfeksjonsløsninger og spray desinfeksjonsmidler brukes for midlertidig mottak av avfall som genereres under forsøket og for desinfisenfecting hansker, rengjøring biosikkerhet skap overflater og instrumenter, henholdsvis. Kvartær ammonium desinfeksjonsmiddel på konsentrasjon oppført regnes som gullstandarden for alle amerikanske BSL-4 laboratorier (Barr J, personlig kommunikasjon, 2015). Fast avfall fra et avfalls bøtte autoklaveres å eliminere muligheten for forurensning.

I et forsøk for å demonstrere visuelt arbeidsflyten og begrensningene ved de generelle BSL-4 prosedyrer, anvendte vi en standard virus-plaque-analysen som et eksempel på et vanlig brukt viral prosedyre. Mens den virale analyseprosedyren er beskrevet generelt, stress vi biologisk prosedyrer som brukes for å sikre sikkerheten av laboratoriepersonale i denne protokollen. Vennligst referer til tidligere klassiske plakkassay visualiseringer for ytterligere bakgrunns på plakett analyseteknikken 8,9.

Prosedyrene som presenteres her følger BMBL spesifikasjoner skissert av CDC en. Men de presenterte protokoller erspesifikk for IRF-Frederick. Hver BSL-4-anlegget har forskjellige standard operasjonsprosedyrer (SOP) og driftsmetoder som påvirker gjennomføring av eksperimenter innenfor BSL-4 laboratorium. Alternative prosedyrer for avfallsstrømmen styring og gjennomføring av plakk analyser kan variere basert på forvaltning og drift av disse laboratoriene. Likevel vil en generell forståelse av oppsettet av en BSL-4 dress laboratorium og prosedyrer for å utføre arbeid med klasse II skap inne i BSL-4 miljø hjelpe forskerne å forstå de begrensninger og sikkerhetsmessige implikasjoner når som vurderer studier av høyrisiko patogener. Økt bevissthet om utenfor samarbeidspartnere av vanskelighetene rundt arbeidet i en BSL-4 laboratorium kan føre til justerte forventninger og større letthet i å utvikle medisinske mottiltak i forskersamfunnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Laboratorie Entry

  1. Samle alle forsyninger fra en BSL-2 laboratorium for forsøket (f.eks, celler, media og forbruksmateriell) før inntreden i BSL-4 laboratorium.
  2. Fullfør BSL-4 entry prosedyre (beskrevet i detalj i referanse 7).

2. Utarbeidelse av en klasse II biosikkerhet kabinett i BSL-4 Laboratory

  1. En gang inne i BSL-4 laboratorium, sikre den daglige intern sjekkliste (figur 1) er fullført. Fullfør sjekklisten hvis sjekklisten ikke tidligere har vært fylt ut, og angi hvilke virus vil bli brukt. Hvis sjekklisten er allerede gjennomført, legge navn og hvilke virus vil bli brukt til listen.
  2. Rens klasse II BSC ved å sprøyte ned langs hele innsiden av BSC (inkludert rammen) med 5% dual kvaternært ammonium desinfeksjonsmiddel (f.eks, n-alkyl-dimetyl-benzyl ammoniumklorid, n-alkyl-dimetyl-benzyl-etyl-ammoniumklorid eller annen desinfiserende passende for agenten som brukes) og tørk av med tørkepapir 10,11. Spray 70% etanol løsning inne i skapet og rammen for å fjerne klebrig desinfeksjonsmiddel.
  3. Hvis du sitter, satt stolen foran klasse II BSC i en komfortabel høyde for å sikre at baksiden av kabinettet kan nås og at ansiktet av laboratoriet spesialist ligger over inngangsåpningen (figur 2) 11.
  4. Forbered en avfallsbeholder for biosikkerhet skap. Sikre at sluttkonsentrasjonen av dual kvaternært ammonium desinfiserende oppløsning i avfallsbeholderen er ikke mindre enn 5%. Planlegge deretter og lage en 10% løsning der avfallet skal legges som vil utvanne desinfeksjonsmiddel. I tillegg plasseres en sprayflaske med 5% dual kvaternært ammonium desinfeksjonsløsningen inne i klasse II BSC for å sprøyte alle elementer før fjerning og hansker i løpet av og etter fullføring av analysen.
  5. <li> Plasser de riktige materialer som trengs for hele eksperimentet i klasse II BSC så langt tilbake i skapet som mulig for å unngå gjentatte materielle introduksjoner inn i klasse II BSC og forstyrrelse av luftstrømmen 11.

3. Eksempel: plakkassay

  1. Hente virus-inneholdende prøver og kontrollere viruset fra lagringsstedet for hånd og tine materialer i en inkubator ved 37 ° C.
  2. Merke brønnene på 6-brønners plater som skal anvendes i henhold til virus fortynninger planlagt. Marker lokk og kroppen av platene for å sikre en vellykket matching hvis lokkene og kroppen er separert.
  3. Ta med materialer fra trinn 3,1-3,2 inn i klasse II BSC. Legg alle elementer som ikke har eller ikke vil komme i kontakt med virus på den ene siden ( "ren side") og avfall på den andre siden ( "dirty side"). Hvis mulig, beholde "rene elementer" minst 30 cm avstand fra "skitne elementer" under aerosol-genererende aktiviteter 11.
  4. Arbeide så nær innsiden midten av klasse II BSC som mulig, som på innsiden sentrum er utformet for å være den mest effektive stilling for å beskytte seg selv 11.
  5. Fjern 50 ul av virusprøven og kontrollvirus og fyll i 450 ul Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 2% føtalt bovint serum. Fortsett med å lage serielle fortynninger så langt ut som nødvendig (figur 3A).
  6. I løpet av fortynninger, blande de virusprøver minst 5 ganger med en pipettespiss langsomt og forsiktig under forsøk på å minimere luftbobledannelse i prøvene. Endre pipettespisser etter hver tilsetning til den neste fortynning brønnen.
  7. I den siste fortynningen, etter blanding av prøven 5 ganger, forkaste 50 ul av virusprøve inn i avfallsbeholderen for å sikre like volumer av fortynninger.
  8. Når du kaster tips, skyll hver spiss med desinfiserende løsning fra avfalls bøtte å rense innsiden og utsiden av tuppen før expelling spissen inn avfallet bøtte.
  9. Når fortynninger er gjort, stilles fortynningen brønnene til side og begynner å aspirere mediet fra brønnene i cellekulturplater, slik at 500 ul av mediet i hver brønn i en 6-brønns plate.
  10. Når ferdig med pipettespissen, aspirere desinfiserende løsning fra avfallet bøtte til toppen av pipetten ved hjelp av en manuell, justerbart volum, trykk-knapp pipette, for å sikre riktig rensing av innsiden av pipetten. La spissen inn i avfallsverdiområdet helt til slutten av forsøket.
  11. Når mediet er fjernet fra platene, tilsett 100 ul av den korrekte prøven inn i riktig godt i pre-merkede plater i duplikat, endre tips hver for hver prøve.
  12. Ved ferdigstillelse av plakk analyse vaksiner, spray av hansker med desinfiserende løsning og bruke et papirhåndkle fuktet med desinfeksjonsmiddel til å tørke utsiden av alle platene før du legger platene tilbake i inkubatoren for hånd. Retorv denne prosessen til alle platene er tilbake i inkubatoren.
  13. Rock platene i en figur 8 bevegelse for å sikre korrekt spredning av prøven over cellene hvert 15 min i 1 time.
  14. Ved fullføring av gynge plater, returnerer platene til klasse II BSC sammen med en blanding av 2 x Eagles minimale essensielle medium og 1,6% tragant, et halvfast overlegg som er lettere å manipulere enn agarose, anvendes for overlegget av plakk-analyse.
  15. Tilsett 2 ml av overlegget blanding til hver brønn i en 6-brønns plate og stein nok en gang i en figur 8 bevegelse for lik fordeling av overlegget hele overflaten av brønnen. Gjenta denne prosessen til alle brukt godt er kledde med overlegg blanding.
  16. Pass på at spissen av serologisk pipette ikke berører noe væske i brønnene for å unngå smitte når du utfører overlegget prosedyren.

4. Avfallshåndtering og rengjøring av instrumenter og biosikkerhet Cabinet

<ol>
  • Fullstendig senk alt avfallsmateriale i 5% desinfiserende oppløsning i avfallet bøtte for en kontakttid på minst 10 min. Desinfiser pipettespisser, serologiske pipetter og annet avfall som beskrevet ovenfor. I tillegg spray avfallsbøtte (innvendig og utvendig) med 5% desinfiserende oppløsning lar oppløsningen forbli i kontakt med avfallet bøtte for en kontakttid på 10 min.
  • Mens du venter på kontakt lang tid det tar for avfallet, suge et papirhåndkle med 5% desinfeksjonsmiddel, tørke ned instrumenter som mikropipetter, og fjerne dem fra BSC. Spray hansker med 5% desinfeksjonsmiddel før bringe hansker ut av klasse II BSC.
    1. Etter å ha fjernet mikropipetter fra BSC, tørk dem med et separat tørkepapir med 70% etanol løsning for å unngå klissete buildup på instrumentene. Spray eventuelle instrumenter som ikke effektivt kan tørkes ned med 5% desinfeksjonsmiddel og la i kontakt med oppløsningen i den BSC i 10 min.
  • Etter tilstrekkelig kontakttid, fjerne alle elementer fra BSC. Ta elementer, inkludert avfall bøtte som inneholder avfall, til vasken. Skyll elementer som kan gjenbrukes for å fjerne desinfeksjonsmiddel rest. Returnere alle elementer til sine lagringsplasser.
  • Rens klasse II BSC største arbeidsflate, skapsider og tilbake, indre av glass, og rammen 1 med 5% desinfeksjonsløsning, etterfulgt av 70% etanolløsning.
  • Trekk ut og tøm de serologiske pipetter fra avfall bøtte og plassere overflate desinfiseres serologiske pipetter i separate pipettes skuffer for autoklave (serologiske pipetter kan presentere en sharps farlig og kan rive gjennom søppelsekk. Plasser disse pipetter i en hard-sided beholder før autoklave).
  • Helle innholdet i avfallet bøtten inn i en sil plassert i bunnen av vasken.
  • Ta en biohazard avfallsbeholder som er foret med en rød biohazard bag til vasken og dumpe innholdet i strainer inn i den røde biohazard bag. Ikke grip inn i sil for å fjerne Mikropipette tips som kan feste seg til innsiden av silen. Hit silen langs innsiden av avfallsbeholderen før alle tips er fjernet, eller bruke en pinsett til å fjerne tips fra silen.
  • Skyll avfallsbøtten og sted å tørke på stativet ved siden av vasken.
  • 5. Autoklave Avfall

    1. Fjern biohazard posen fra biohazard avfallsbeholderen og plasser i en autoklav skuffen på en handlevogn.
    2. La biohazard poser åpen og legg et stykke autoklav tape over utsiden av posen, koble sidene av autoklaven skuffen for å holde posen sikret i skuffen.
    3. Plasser to stykker av autoklav tape på serologisk pipette tips skuffen og merk den med ens initialer og dato. Plasser den serologiske pipette brettet på vognen med autoklaven skuffen.
    4. Åpnes autoklaven. Koble den medfølgende autoklaven lasting / lossing cart til autoklaven og få ut det uttrekk autoklaven plattform å hvile på vognen.
    5. Fjern metallstang fra autoklaven og åpne topp. Plasser en biologisk indikator hetteglass som inneholder sporer av Geobacillus stearothermophilus inn i metallstang for å sjekke at autoklaven steriliseringssyklusen ble fullført.
    6. Plasser metallstangen i midten av avfallsposen i autoklaven skuffen, men sørge for at metallstaven er likevel lett tilgjengelig.
    7. Plasser autoklav brett fylt med avfall og serologisk pipette skuffen på uttrekkbar autoklav plattform og skyv den inn i autoklaven.
    8. Ta autoklaven lasting / lossing handlevogn fra autoklaven og lukker autoklaven døren.
    9. Start autoklaven.
    10. Ikke la autoklaven til syklusen har startet. Drifts skjermen av autoklaven vil indikere gjenværende tid for at kjøringen.
    11. Etter at autoklaven løp er fullført, fjerner den biologiske indicator og evaluere for vekst ved oppvarming i en spesifisert inkubator. Dersom veksten blir oppdaget på den biologiske indikatoren, re-kjøre søppel i autoklaven, og vurdere på nytt indikator. Hvis ingen vekst blir oppdaget, fjerne søppel fra anlegget.

    6. Eksempel: Fikse og Farging av platebedømmelser

    1. Etter at det riktige antall dager (som er avhengig av den virus som brukes) har passert, går tilbake inn i laboratoriet og utføre fremgangsmåten fra avsnitt 1 og 2 en gang til.
    2. Fjern forsiktig plakk analyseplatene fra inkubatoren ferdig i trinn 3.1.2, og sett den i klasse II BSC hånd.
    3. Pipettering av alle medier og overlegg materiale og dispensere inn desinfeksjonsmiddel beholderen og erstatte med en blanding av 10% nøytral bufret formalin og 0,8% krystallfiolett 12,13. La blandingen forbli på platene i 30 minutter for å inaktivere viruset på platene.
    4. Etter inaktivering, forsiktig fjerne nøytralbufret formalin / krystallfiolett blanding og plasser i en egen avfallsbeholder som skal nøytraliseres før tømming.
    5. Spray hansker med desinfiserende og tørk utsiden av platene før du passerer dem ut av klasse II BSC som beskrevet ovenfor.
    6. Fortsett til vask, skyll platene for å fjerne overflødig flekken, og deretter plassere platene på en vogn for å tørke.
    7. Når platene er helt tørre, kan du bruke en lyskasse å telle plakk. Spill alle punkter og beregne Virustitere fra standard ligning (Figur 3B).

    7. Ta Prøver fra BSL-4 Laboratory

    1. Inaktivere eventuelle prøver som vil bli manipulert i henhold BSL-2 laboratorieforhold. Følg en av to metoder som er godkjent av den interne biosikkerhet kontor på IRF-Fredrik som bruker 10% nøytral-bufret formalin (NBF) eller Trizol LS (fenol, guanidinisotiocyanat, ammoniumtiocyanat, natriumacetat, glyserol) 1,14. Transfer samples til en ny ren rør eller en plate utsiden av BSC før forpakning for fjerning fra BSL-4 laboratorium.
    2. Varme-forsegling inaktiverte prøver i rør eller plater i en varmeforseglet pose inneholdende tilstrekkelig 5% desinfeksjonsmiddel eller fikseringsmiddel for oppløsning for å desinfisere på innsiden av posen og utsiden av prøverørene som gjennomgår overføring ut av BSL-4 laboratorium. Plasser denne posen inn i en annen veske følge samme prosedyre.
    3. Tett andre posen og plasser varmeforseglet posen i en dunk tank som inneholder 5% desinfeksjonsmiddel i minst 10 minutter for å desinfisere utsiden av varmeforseglet pose.
    4. Fyll ut en dunk tank loggbok inne i laboratoriet ved opptegning av antall og størrelse på rør, volum i rør, middel, inaktivering metode som brukes, og plass til der prøvene vil bli overført.
    5. Koordinere med en kollega på utsiden av BSL-4 laboratorium for å hente posen fra dunk tanken og ta prøver i laboratoriet BSL-2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Etter riktige prosedyrer innenfor BSL-4 laboratoriet er avgjørende for å sikre trygg og effektiv gjennomføring av analyser. Ved å henvise til ferdig daglig intern sjekkliste (figur 1), laboratoriepersonell sikre at utstyret er i full drift. Riktig posisjonering legeme i midten av BSC sikrer at forsøket blir utført under optimale luftstrømningsforhold (figur 2). Viruset prøven fortynnet i serie for å oppnå plater som har 30-300 plakk pr plate (figur 3A) og for å bestemme virustiter (figur 3B). En rekke faktorer påvirker dannelsen av plakk, inkludert virus tropisme for vertscellelinjer, vaksinasjon teknikk, vilkår for virus vekst, passende fortynning rekkevidde, og overlay utvalg åtte. Avfall som genereres i BSC under prosedyren er riktig desinfiseres før fjerning fra BSC og igjen ved autoklavering førforlater BSL-4-miljø. Ved å følge disse prosedyrene, har ingen laboratorieinfeksjoner er registrert i løpet av BSL-4 forskning på IRF-Frederick.

    Figur 1
    Figur 1:. Prøve daglig interne systemer sjekkliste Daily ferdigstillelse av denne sjekklisten sikrer at laboratoriepersonalet har sjekket utstyret i laboratoriet (viktigst BSC) før oppstart av arbeidet. Hvis BSC er funnet å være utenfor kalibrerte området, må dette BSC ikke brukes, og vedlikehold skal varsles. Alle BSC må være riktig kalibrert og fungerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2:. Bakfra og fra siden av et laboratorium spesialist pipettering prøver i en klasse II biosikkerhet skap (A) Avfall bøtte med gul desinfeksjonsmiddel og brukte pipetter er til høyre for brønnplatene (B), og desinfiserende spray flaske er å høyre for avfall bøtte (A). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3: Beregning av viral titer av prøven viral titer er uttrykt som plakkdannende enheter (pfu) per ml.. For å beregne den virale titer, telle antallet klart definerte plakker (pfu) og dividere med produktet av fortynningsfaktoren (d) ganger volumet av fortynnet virus tilsatt til brønnen (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Arbeid i en BSL-4 laboratorium krever mye tid og ekstra oppmerksomhet på detaljer. Enhver type arbeid i dette miljøet krever godt trent, grundig og samvittighetsfulle individer. Standarden viral plakkassay gir en nøyaktig modell av en vanlig prosedyre for å arbeide med høy konsekvens patogener i BSL-4 laboratorium, som analysen omfatter flere store konsepter som laboratoriearbeidere må læres.

    Den første store konseptet er riktig bruk og anvendelse av sikker praksis i klasse II BSC, som fungerer som primær oppdemming for høy konsekvens patogener. Forståelse av hvordan en klasse II BSC funksjoner vil diktere praksis som i stor grad begrenser eksponeringsrisiko til enkeltpersoner. Arbeidsflyt fra et rent område ( "clean side") til et forurenset område ( "dirty side") over arbeidssonen i klasse II BSC hjelper også for å unngå krysskontaminering 11. Rene og forurensede materialer og suppltallet bør segregert for å begrense bevegelsen av forurensede elementer over ren elementer.

    Den andre store konseptet er fysisk og biologisk avfallshåndtering. Riktige skritt i kassere begge typer avfall er avgjørende for å sikre at laboratoriet spesialister forblir trygg og miljø ikke er forurenset. Trinn i løpet av et eksperiment som er utformet for å inaktivere og ødelegge patogener før prøvene er tatt ut av BSL-4 laboratorium. Eksempler på slike kritiske trinnene omfatter: pipettering desinfeksjonsmiddel inn i hver spiss, slik at i det minste en 10 min kontakttid på potensielt kontaminerte materialer med desinfeksjonsmidler, autoklavering avfall, og validere sterilitet under autoklaveringssykluser. Disse trinnene er utformet for å være overflødig for å sikre ødeleggelse av høy konsekvens patogener.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics