चूहे मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में जब्ती की तरह गतिविधि के प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना और मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग

Neuroscience

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Lu, H. C., Chang, W. J., Chang, W. P., Shyu, B. C. Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation. J. Vis. Exp. (112), e53709, doi:10.3791/53709 (2016).

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Abstract

Cathodal Transcranial प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना (tDCS) दवा प्रतिरोधी दौरे पर दमनकारी प्रभाव लाती है। प्रभावी कार्रवाई करने के लिए, उत्तेजना मानकों (जैसे, ओरिएंटेशन, क्षेत्र की ताकत है, और उत्तेजना की अवधि) चूहों के मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में जांच की जानी चाहिए। परीक्षण और चूहों के मस्तिष्क टुकड़ा की स्थिति के लिए इलेक्ट्रोड रिश्तेदार के उन्मुखीकरण की व्यवस्था संभव है। वर्तमान पद्धति पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था जब्ती-तरह की गतिविधियों पर डीसीएस के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए thalamocingulate मार्ग को बरकरार रखता है। मल्टीचैनल सरणी रिकॉर्डिंग के परिणाम संकेत दिया कि cathodal डीसीएस काफी उत्तेजना पैदा प्रतिक्रियाओं के आयाम और 4-aminopyridine और bicuculline प्रेरित जब्ती की तरह गतिविधि की अवधि में कमी आई है। इस अध्ययन में यह भी पाया गया है कि 15 मिनट पर cathodal डीसीएस अनुप्रयोगों thalamocingulate मार्ग में लंबे समय तक अवसाद का कारण बना। वर्तमान अध्ययन thalamocingulat पर डीसीएस के प्रभावों की जांचई synaptic plasticity और तीव्र जब्ती-तरह की गतिविधियों। वर्तमान प्रक्रिया अभिविन्यास, क्षेत्र की ताकत है, और इन विट्रो माउस मॉडल में उत्तेजना अवधि सहित इष्टतम उत्तेजना मापदंडों का परीक्षण कर सकते हैं। इसके अलावा, विधि दोनों सेलुलर और नेटवर्क के स्तर पर cortical जब्ती-तरह की गतिविधियों पर डीसीएस के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकते हैं।

Protocol

प्रक्रियाओं है कि पशु विषयों को शामिल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, एकेडेमिया सिनिका, ताइपेई, ताइवान द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्रायोगिक समाधान और multielectrode ऐरे रिकॉर्डिंग के लिए उपकरण तैयार कर रहा है

  1. कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF तैयार करें; 124 मिमी NaCl, 4.4 मिमी KCl, 1 मिमी नः 2 पीओ 3, 2 मिमी MgSO 4, 2 मिमी 2 CaCl, 25 मिमी 3 NaHCO, और 10 मिमी ग्लूकोज, 95% हे के साथ bubbled 2 और 5% सीओ 2)।
  2. 6 x 10 तलीय विदेश मंत्रालय और विदेश मंत्रालय के 8 x 8: विदेश मंत्रालय जांच के दो प्रकार का प्रयोग करें। पूर्व जांच क्षेत्र है कि कोर्टेक्स, स्ट्रिएटम, और चेतक शामिल शामिल किया गया है। उत्तरार्द्ध जांच केवल cortical क्षेत्र शामिल हैं।
  3. एक बैंड पास फिल्टर 0.1 हर्ट्ज और 1,200 प्रवर्धन में 3 किलोहर्ट्ज़ के बीच सेट के साथ एक 60-चैनल एम्पलीफायर का उपयोग करें। एक 10 kHz नमूना दर पर डेटा मोल।
  4. डीसीएस के लिए विदेश मंत्रालय के कक्ष के अंदर दो AgCl लेपित चांदी के तारों रखें। AgCl का प्रयोग करेंलेपित चांदी के तारों बिजली क्षेत्र है कि एक अलग उत्तेजक द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं उपज है।
  5. एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड (; लंबाई, 7.62 सेमी, 8 ° एसी पतला टिप; व्यास, 127 माइक्रोन प्रतिरोध, 5 MΩ) प्लेस thalamic उत्तेजना के लिए, और विदेश मंत्रालय के कक्ष में संदर्भ इलेक्ट्रोड जगह है। एक अलग उत्तेजक है कि एक पल्स जनरेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है का उपयोग कर टंगस्टन इलेक्ट्रोड की धाराओं उद्धार।

2. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी

  1. पुरुष C57BL / 6J चूहों, 4-8 सप्ताह पुरानी प्रयोग करें। हाउस एक वातानुकूलित कमरे में जानवरों (21-23 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता 50%, 12 घंटा / 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र, 8:00 PM पर रोशनी) भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ।
  2. aCSF कि 1.1 चरण में तैयार किया गया था की एक 250 मिलीलीटर विभाज्य ले लो, और एक बीकर कि बर्फ में शामिल है में जगह है। इसी समय, निरंतर गैस है कि 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 से बना है आपूर्ति।
  3. सर्जरी
    1. एक गिलास में 4% isoflurane के साथ पशु anesthetizeलगभग 3 मिनट के लिए बॉक्स। एक बार जानवर संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा की गहराई (पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए एक प्रतिक्रिया की कमी से संकेत) पहुँचता है, एक उथले ट्रे कुचल बर्फ से भर जाता है पर जगह है, और कैंची का उपयोग कर सिर को हटा दें।
    2. खोपड़ी का पर्दाफाश, और शेष पेशी बंद ट्रिम। अगले, rongeurs का उपयोग, मस्तिष्क से खोपड़ी के पृष्ठीय सतह दूर छील। खोपड़ी rongeurs का उपयोग के पक्ष दूर ट्रिम। एक 75% इथेनॉल समाधान के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों के सभी जीवाणुरहित।
    3. एक रंग का प्रयोग, मस्तिष्क के उदर सतह के साथ घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन काट, और मस्तिष्क को हटा दें। कत्ल के बाद, जल्दी ठंडा ऑक्सीजन aCSF से भरा एक बीकर मस्तिष्क हस्तांतरण।
  4. औसत दर्जे का थैलेमस (एमटी) -ACC मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी
    नोट: स्लाइस कि एसीसी से 13 मीट्रिक टन से मार्ग शामिल तैयार करें।
    1. दो बाण कटौती के साथ मस्तिष्क ब्लॉक 2.0 मिमी प्रत्येक गोलार्द्ध में midline के लिए पार्श्व हाथ कटsubcortical शरीर रचना विज्ञान प्रदर्शित करने के लिए। फिर दो कोणीय कटौती कर। स्ट्रिएटम में दिखाई फाइबर तंत्र के लिए पहली पार कटौती समानांतर बनाओ।
    2. पूर्वकाल संयोजिका और ऑप्टिक पथ है कि उदर और thalamocingulate मार्ग के समानांतर हैं के बीच मध्य लिए सेरिबैलम और दृश्य कोर्टेक्स के बीच के संबंध से दूसरे पार कटौती करें।
    3. एक कोणीय प्लेट (~ 120 °) cyanoacrylate चिपकने के साथ करने के लिए मस्तिष्क ब्लॉक संलग्न है, और बस मार्ग के मोड़ के ऊपर एक कट बना। प्लेट प्रकट करना, इसे समतल, और एक vibratome के कक्ष के मंच पर यह गोंद।
    4. औसत दर्जे का चेतक-एसीसी मस्तिष्क स्लाइस (500 माइक्रोन मोटी) और फिर 1 के लिए ऑक्सीजन ACSF के साथ रिकार्डिंग कक्ष के लिए ठंडा ऑक्सीजन aCSF.Transfer स्लाइस में उन्हें विसर्जित कर, और निरंतर छिड़काव (12 मिलीग्राम / मिनट) के तहत 32 डिग्री सेल्सियस पर रख कर मानव संसाधन।

Multielectrode ऐरे रिकॉर्डिंग के लिए छिड़काव चैंबर के 3. तैयारी

  1. तैयारीछिड़काव चैम्बर की
    1. एक मल्टी चैनल सिस्टम पर एक विदेश मंत्रालय जांच जगह है, और एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए जांच कनेक्ट करने के लिए दो अलग-अलग पॉलीथीन ट्यूब का उपयोग करें। एक ट्यूब का उपयोग विदेश मंत्रालय के कक्ष और कक्ष के बाहर aCSF मार्गदर्शन करने के लिए अन्य ट्यूब में aCSF मार्गदर्शन करने के लिए। अंत में, लगातार गर्म (29-30 डिग्री सेल्सियस) ऑक्सीजन aCSF (8 मिलीग्राम / मिनट) के साथ तैयारी छिड़कना।
  2. विदेश मंत्रालय के मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण। विदेश मंत्रालय के एक गीला कपास झाड़ू का उपयोग करने पर मस्तिष्क टुकड़ा दबाए रखें। ध्यान से यह सुनिश्चित करने के लिए एसीसी इलेक्ट्रोड ऊपर उन्मुख है मस्तिष्क टुकड़ा ले जाते हैं।
  3. टुकड़ा लंगर किट और पकड़-चढ़ाव का उपयोग मस्तिष्क टुकड़ा प्रेस करने के लिए। यह कदम टुकड़ा और इलेक्ट्रोड के बीच एक अच्छा विद्युत कनेक्शन सुनिश्चित करता है।

डीसीएस द्वारा बिजली क्षेत्र के 4 जनरेशन

नोट: बिजली के क्षेत्र की ओर रुख की परिभाषा एसीसी में axodendritic अक्ष की दिशा पर आधारित था। डेन्ड्राइट और सोमा डिब्बों का झुकाव थेGolgi धुंधला 12 का उपयोग कर पुष्टि की।

  1. AgCl इलेक्ट्रोड एसीसी को समीपस्थ (एनोड के रूप में परिभाषित) प्लेस, और अन्य इलेक्ट्रोड (कैथोड के रूप में परिभाषित) एसीसी के लिए बाहर जगह है। क्षेत्र की ताकत है कि दो क्षेत्र झुकाव (समानांतर और एसीसी axodendritic तंतुओं को सीधा) विदेश मंत्रालय द्वारा उत्पन्न होता है रिकॉर्ड है, और एक उत्तेजक का उपयोग कर बिजली क्षेत्र की धाराओं देने के लिए।
  2. AgCl इलेक्ट्रोड (के बारे में 1.5-2 सेमी) की दूरी तय कर लो, और उत्तेजक की मौजूदा ताकत 0.5 और 2 मा के बीच डीसीएस बनाने के लिए समायोजित करें।

5. विद्युत प्रेरित Cortical synaptic प्रतिक्रियाओं

नोट: मीट्रिक टन में बिजली की उत्तेजना, जिसमें एक प्रोग्राम बिजली के प्रोत्साहन जनरेटर आयताकार biphasic वर्तमान दालों का उत्पादन द्वारा एसीसी में synaptic प्रतिक्रियाओं को प्रेरित।

  1. ऊपर दोहराएँ धारा 3।
  2. मीट्रिक टन में एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड रखें, और थाल लिए उत्तेजक से दालों देनेद्विध्रुवी टंगस्टन इलेक्ट्रोड के माध्यम से स्लाइस की Amic क्षेत्र।
  3. सीमा है कि एक एसीसी प्रतिक्रिया elicits निर्धारित करने के लिए विभिन्न वर्तमान तीव्रता का प्रयोग करें। इधर, ± 150 μA की तीव्रता और 200 μsec की अवधि, जो सबसे अधिक स्लाइस में एसीसी में एक 80% अधिक से अधिक प्रतिक्रिया हासिल उपयोग करें।
  4. इष्टतम प्रतिक्रिया प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एमटी एसीसी टुकड़ा में thalamocingulate मार्ग (मीट्रिक टन से महासंयोजिका करने के लिए) के साथ टंगस्टन इलेक्ट्रोड ले जाएँ।
  5. एसीसी प्रतिक्रियाओं का 10-20 स्वीप करें, और सॉफ्टवेयर का उपयोग स्वचालित रूप से एसीसी मीट्रिक टन उत्तेजना के द्वारा पैदा की सभी औसत करने के लिए। परिणाम एसीसी में synaptic प्रतिक्रियाओं मीट्रिक टन एसीसी मार्ग द्वारा मीट्रिक टन उत्तेजना से प्रेरित आईएसएस।

6. विद्युत प्रेरित जब्ती की तरह गतिविधि

नोट: जब्ती की तरह गतिविधि 4-aminopyridine के आवेदन के द्वारा प्रेरित किया गया था (4-एपी, 250 माइक्रोन) के और bicuculline (5 माइक्रोन) के। पिछले समय-नियंत्रण के अध्ययन से पता चला है कि अधिक से अधिक और स्थिर प्रतिक्रियाओं दिखाई दियादवा आवेदन 14 के बाद 2-3 घंटा।

  1. दोहराएँ धारा 5 के ऊपर।
  2. छिड़काव समाधान करने के लिए दवाओं जोड़ें। 4-एपी (250 माइक्रोन) के और bicuculline (5 माइक्रोन) के प्रयोग करें। समान रूप से दवाओं के मिश्रण, और 2-3 घंटे के लिए छिड़काव जारी है।
  3. जब्ती की तरह गतिविधि की सुविधा के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से छिड़काव दर (8 मिलीग्राम / मिनट) है, जो भी मदद कर सकते हैं एक पीएच ढाल का निर्माण हुआ रोकने पर छिड़काव पंप बनाए रखें।
  4. मीट्रिक टन में एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड रखें, और एसीसी प्रतिक्रिया प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए बिजली की उत्तेजना (150 μA, 200 μsec अवधि) देने के लिए।
  5. 10-20 स्वीप बनाओ और प्रतिक्रियाओं औसत।
  6. दवाओं के बाहर धोने के लिए नए सिरे से ACSF के साथ छिड़काव समाधान बदलें। दोहराएँ चरण 6.5।

पैदा Cortical प्रतिक्रियाओं पर डीसीएस 7. परीक्षण प्रभाव

  1. दोहराएँ धारा 3 और 4 सुनिश्चित करें कि वर्दी बिजली क्षेत्र दो समानांतर AgCl लेपित चांदी के तारों कि एम के अंदर रखा जाता है के बीच धाराओं गुजर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैंईए चैंबर। अगर कोई मुद्दे हैं, डीसीएस के बीच 0.5 और 2 मा रहता है।
  2. डीसीएस बंद करें, और (150 μA, 200 μsec अवधि ±) चेतक को प्रोत्साहित करने के लिए एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड जगह है। एसीसी में अधिक से अधिक synaptic प्रतिक्रियाओं प्राप्त, 10-20 स्वीप बनाने के लिए और प्रतिक्रियाओं औसत करने के लिए।
  3. इसके साथ ही डीसीएस (2 एम वी / मिमी डीसीएस ताकत) और thalamic उत्तेजना (350 μA, 200 μsec अवधि) पर बारी। डीसीएस दौरान thalamic उत्तेजना पैदा एसीसी प्रतिक्रिया के आयाम के परिवर्तन का मूल्यांकन।
  4. डीसीएस बंद करें, और छिड़काव समाधान करने के लिए 4-एपी (250 माइक्रोन) के और bicuculline (5 माइक्रोन) के जोड़ें। फिर 2-3 मानव संसाधन प्रतीक्षा करें। दवाओं मस्तिष्क टुकड़ा को प्रभावित करते हैं, टुकड़ा cortical जब्ती की प्रतिक्रियाएं पैदा करता है।
  5. एसीसी प्रतिक्रियाओं का 10-20 स्वीप, और उसके आयाम और बिजली पैदा की cortical जब्ती प्रतिक्रियाओं की अवधि को मापने।
  6. कदम 7.5 के बाद, एक साथ DCS (2 एम वी / मिमी डीसीएस ताकत) और thalamic उत्तेजना पर 150 μA, 200 durati बारी (μsec पर)। डीसीएस आवेदन के दौरान आयाम और पैदा cortical जब्ती प्रतिक्रियाओं की अवधि में परिवर्तन का मूल्यांकन।
  7. दवाओं के बाहर धोने के लिए नए सिरे से ACSF के साथ छिड़काव समाधान बदलें, और दोहराने 7.2 और 7.3 कदम।
  8. विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में रिकॉर्डिंग डेटा के सभी ले लीजिए, और समूह डेटा। आयाम और विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत cortical जब्ती प्रतिक्रियाओं की अवधि का मूल्यांकन।

8. डेटा विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (जैसे, एम सी रैक सॉफ्टवेयर) स्वचालित रूप से दर्ज की प्रतिक्रियाएं औसत करने, और एक स्प्रेडशीट के लिए कच्चे डेटा निर्यात। आयाम और कच्चे डेटा की अवधि का विश्लेषण करें और रंग आंकड़े उत्पन्न करते हैं।
  2. oscillatory जब्ती घटनाओं का पता लगाने के लिए, सॉफ्टवेयर का उपयोग आधारभूत मूल्य और मानक विचलन (एसडी) को मापने के लिए। निर्धारित सीमा के रूप में शोर के स्तर के 3 एसडी। एक दोलन घटना के दौरान चोटियों के आयाम है कि इस सीमा को पार स्वतः ही पता लगा रहे हैंईडी।
  3. छात्र टी -Test का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं।
  4. एक्सप्रेस माप और के एसई ± मतलब के रूप में पाठ में विचरण (एनोवा) के परिणाम एक तरह से विश्लेषण, एन के साथ स्लाइस की संख्या का संकेत 12 ​​का अध्ययन किया।

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Representative Results

Thalamocingulate स्लाइस और विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग सिस्टम सेटअप की तैयारी

चूहों से मीट्रिक टन एसीसी टुकड़ा एक विशेष टुकड़ा तैयारी है कि thalamocingulate मार्ग की electrophysiological गुण के अन्वेषण के लिए अनुमति देता है। चित्रा 1 ए तरीका है जिसमें मीट्रिक टन एसीसी टुकड़ा तैयार किया गया था पता चलता है। माउस के मस्तिष्क जल्दी से हटा दिया है और (चित्रा 1 ए, ए, बी) शांत ऑक्सीजन aCSF में रखा गया था। Subcortical शरीर रचना को प्रकट करने के लिए, मस्तिष्क 2.0 मिमी पार्श्व midline से प्रत्येक गोलार्द्ध में बाण मस्तिष्क ब्लॉकों के अधिग्रहण के लिए काट दिया गया (चित्रा 1 ए, सी, डी)। दो कोणीय उदर में कटौती मस्तिष्क ब्लॉकों में किए गए थे thalamocingulate मार्ग बनाए रखने के लिए। पहली पार कटौती मस्तिष्क ब्लॉक के सामने बनाया गया था, स्ट्रिएटम में दिखाई फाइबर पथ के समानांतर। दूसरी पार कटौती कनेक्शन शर्त से मस्तिष्क ब्लॉक के पिछले हिस्से में बनाया गया थापूर्वकाल संयोजिका और ऑप्टिक पथ के बीच मध्य लिए सेरिबैलम और दृश्य कोर्टेक्स समझना। बाद में कटौती किए गए थे, मस्तिष्क ब्लॉक एक angled प्लास्टिक की प्लेट (120 डिग्री कोण) पर चिपका था, और एक कट सीधे प्रांतस्था (चित्रा 1 ए, उदाहरण के लिए) के माध्यम से पृष्ठीय पक्ष पर बनाया गया था। मस्तिष्क ब्लॉक प्लेट एक vibratome से चिपके और शांत ऑक्सीजन aCSF में डूब गया था। (चित्रा 1 ए, एच, मैं) अंत में, कुछ स्लाइस (500 माइक्रोन मोटी) मस्तिष्क ब्लॉक से लिया है और ऑक्सीजन aCSF में incubated रहे थे।

चित्रा 1 बी विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग प्रणाली की स्थापना से पता चलता है। योजनाबद्ध आरेख एक रिकॉर्डिंग कंप्यूटर से जुड़ा छिड़काव और विदेश मंत्रालय सिस्टम से पता चलता है। एक खाली विदेश मंत्रालय जांच एम्पलीफायर के अंदर रखा गया था, और छिड़काव 8 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर शुरू हुआ। एमटी एसीसी मस्तिष्क टुकड़ा विदेश मंत्रालय जांच पर रखा गया था जबकि यह सुनिश्चित करना है कि रिकॉर्डिंग क्षेत्र केंद्र के लिए संभव के रूप में बंद था। एक उत्तेजक उपयोग किया गया थाडी मस्तिष्क टुकड़ा उत्तेजित और बिजली के क्षेत्र उत्पन्न करते हैं। सभी चरणों के पूरा कर रहे थे के बाद, सिस्टम thalamocingulate मार्ग की electrophysiological गुण दर्ज की गई।

चित्रा 1C रिकॉर्डिंग क्षेत्र आरेख और जिस तरह मीट्रिक टन एसीसी मस्तिष्क टुकड़ा विदेश मंत्रालय जांच पर रखा गया था पता चलता है। चित्रा 1C-एक विदेश मंत्रालय जांच की उपस्थिति से पता चलता है। काला लाइन (लाल तीर) से जांच कराने पर उपयोगकर्ता एम्पलीफायर के अंदर जांच के उचित दिशा का निर्धारण में मदद की। चित्रा -1 सी-बी विदेश मंत्रालय के जांच के प्रमुख सर्किट से पता चलता। चित्रा 1C-सी बिजली सरणी उस पर मढ़ा गया था पता चलता है cortical ऊतक।

परीक्षण पैदा प्रतिक्रियाएँ

टुकड़ा तैयारी में thalamocingulate मार्ग के संरक्षण की पुष्टि करने के लिए, इस अध्ययन को प्रेरित कियाचेतक और electrophysiological प्रयोगों में एसीसी पर दर्ज की गई। केवल एसीसी में पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता के साथ स्लाइस, जबकि मीट्रिक टन में वर्तमान की एक छोटी राशि पहुंचाने के प्रयोग में इस्तेमाल किया गया। चित्रा 2A उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और एसीसी में ठेठ thalamic उत्तेजना पैदा प्रतिक्रियाओं की स्थिति से पता चलता है। जब्ती की तरह गतिविधि, 4-एपी (250 माइक्रोन) के और bicuculline (5 माइक्रोन) के लिए प्रेरित करने के epileptiform गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे। bicuculline प्रेरित सहज जब्ती की तरह गतिविधि के साथ ठेठ 4-एपी एक ictal शुरुआत से बना था, एक टॉनिक चरण और लंबी अवधि के द्वारा पीछा किया। निशान चित्रा 2B में बढ़ाई के लिए चयन किया गया था। इस अध्ययन में यह भी दवा प्रेरित बरामदगी के उत्प्रेरण के बाद मीट्रिक टन में उत्तेजना देने का प्रयास किया। 4-Aminopyridine / bicuculline पैदा epileptiform गतिविधि बिजली की उत्तेजना (चित्रा 2 सी) के बाद प्रेरित किया गया था।

परिक्षणडीसीएस और स्लाइस के अभिविन्यास

पिछला नैदानिक ​​अध्ययन से पता चला है कि cathodal डीसीएस के बिजली के क्षेत्र की ओर रुख thalamic उत्तेजना पैदा गतिविधि को प्रभावित करता है। चित्रा 3A बिजली क्षेत्र है, जो समानांतर या एसीसी में डेन्ड्राइट और सोमा डिब्बों के उन्मुखीकरण के लिए सीधा व्यवस्थित किया गया था की अलग झुकाव से पता चलता है। जब बिजली के क्षेत्र में neuronal कोशिकाओं के समानांतर व्यवस्था की गई थी, cathodal उत्तेजना दबा एसीसी (चित्रा 3 बी की औसत दर्जे का भाग में thalamic उत्तेजना पैदा प्रतिक्रियाओं, ऊपरी पैनल)। बिजली के क्षेत्र में neuronal कोशिकाओं को सीधा व्यवस्था की गई है, thalamic उत्तेजना पैदा प्रतिक्रियाओं पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव (चित्रा 3 बी, कम पैनल) मनाया गया। समानांतर cathodal डीसीएस भी 4-एपी दबा दिया और एसीसी (चित्रा -3 सी, ऊपरी पैनल) की औसत दर्जे का भाग में bicuculline प्रेरित जब्ती की तरह गतिविधि।यह जब्ती की तरह गतिविधि की अवधि को छोटा और सीधा cathodal डीसीएस का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव देखा गया (चित्रा -3 सी, कम पैनल)। इन परिणामों की पुष्टि की बिजली के क्षेत्र की ओर रुख thalamocingulate मार्ग में synaptic प्रसारण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण था।

जब्ती गतिविधि पर डीसीएस का प्रभाव

Transcranial चुंबकीय उत्तेजना के नैदानिक ​​आवेदन, tDCS, और डीसीएस दवा प्रतिरोधी बरामदगी के इलाज के लिए एक noninvasive दृष्टिकोण प्रदान करता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि क्षेत्र उत्तेजना synaptic plasticity और मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में प्रभावित epileptiform गतिविधि संग्राहक। वर्तमान नतीजे बताते हैं कि cathodal tDCS thalamocingulate synaptic प्रसारण उदास। उत्तेजना पैदा प्रतिक्रियाओं और जब्ती की तरह गतिविधि की अवधि के आयाम उदास थे (11 9 स्लाइस, 81.82%; छविUre -4 ए, बाएं पैनल)। चित्रा -4 ए (सही पैनल) से पता चलता है कि cathodal डीसीएस के 15 मिनट के लिए प्रभावी ढंग से मीट्रिक टन एसीसी मार्ग में लंबे समय तक अवसाद (लिमिटेड) प्रेरित और उदास प्रतिक्रियाओं पैदा की (एन 11, पी <0.05)। चित्रा = 4 बी (बाएं पैनल) से पता चलता है कि thalamic उत्तेजना सिंगुलेट प्रांतस्था में मजबूत जब्ती की तरह गतिविधि पैदा की। बाद तीस मिनट 15 मिनट cathodal डीसीएस आवेदन, thalamic उत्तेजना पैदा जब्ती की तरह गतिविधि की अवधि छोटा था। चित्रा 4 बी, परिणाम यह भी पता चला है कि जब्ती की अवधि काफी कोई डीसीएस आवेदन (एन = 9, पी <0.05 के साथ तुलना में 15 मिनट cathodal डीसीएस के बाद कम था सही पैनल)।

आकृति 1
चित्रा 1:। Thalamocingulate स्लाइस और विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग सिस्टम सेटअप की तैयारी (ए) एमटी एसीसी टुकड़ा समर्थकcedure (क) ऑक्सीजन aCSF शांत करने के लिए मस्तिष्क और (ख) हस्तांतरण निकालें। (ग) midline से दो parasagittal कटौती करें। मस्तिष्क ब्लॉक की औसत दर्जे का हिस्सा (घ) साइड देखें। (ई) मस्तिष्क ब्लॉक के दो कोणीय उदर कटौती करें। (च) एक angled प्लास्टिक की प्लेट पर मस्तिष्क ब्लॉक गोंद। (छ) एक पृष्ठीय कटौती करें और मस्तिष्क ब्लॉक प्रकट करना। (ज) एक vibratome में मस्तिष्क ब्लॉक गोंद। (I) मस्तिष्क ब्लॉक से स्लाइस ले लीजिए। (बी) के विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग प्रणाली की स्थापना की। (सी) विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग क्षेत्र। (क) विदेश मंत्रालय की जांच। (ख) विदेश मंत्रालय सर्किट। (ग) मस्तिष्क टुकड़ा की एसीसी इलेक्ट्रोड जांच से ऊपर उन्मुख किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ई = "1"> चित्र 2
चित्रा 2: thalamic उत्तेजना और दवा प्रेरित उत्तेजना के विभिन्न पैदा प्रतिक्रियाएँ (ए) एसीसी में thalamic उत्तेजना पैदा हिमायती हैं।। (बी) 4 Aminopyridine- और bicuculline प्रेरित जब्ती की तरह गतिविधि। (सी) thalamic stimulation- और दवा प्रेरित जब्ती की तरह गतिविधि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। डीसीएस के अलग झुकाव का प्रभाव (ए) बिजली क्षेत्र के अलग झुकाव। (बी) डीसीएस साथ thalamic उत्तेजना पैदा हिमायती हैं। (सी) जब्ती की तरह गतिविधि पर cathodal डीसीएस का प्रभाव।: //www.jove.com/files/ftp_upload/53709/53709fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Cathodal tDCS जब्ती गतिविधि पर (ए) cathodal डीसीएस प्रेरित लिमिटेड पंद्रह मिनट और पैदा की गतिविधि उदास का प्रभाव। (बी) जब्ती की तरह गतिविधि की घटना cathodal उत्तेजना के दौरान कमी आई है। 15 मिनट cathodal डीसीएस द्वारा जब्ती की तरह गतिविधि के दमन सहा भी जब डीसीएस के आवेदन समाप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, एसीसी जब्ती की तरह गतिविधि पर अवधि और डीसीएस के उन्मुखीकरण के प्रभाव का परीक्षण किया गया। माउस मस्तिष्क स्लाइस में स्थिर डेटा प्राप्त करने के लिए, कैसे मीट्रिक टन एसीसी मार्ग की अखंडता को बनाए रखने के लिए और नुकसान से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से कदम, जिसमें दो कोणीय उदर में कटौती और कॉर्टेक्स के एक पृष्ठीय काट दिया जाता है। इसके अलावा, समय मस्तिष्क टुकड़ा तैयार करने के लिए भी मस्तिष्क टुकड़ा है, जो कम से कम समय में संभव मस्तिष्क ताजा और मजबूत रखने के लिए होना चाहिए की गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि लक्षित ऊतकों को नुकसान विद्युत एक विवो तैयारी 15 में हो सकता है। इन विट्रो मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी इस समस्या से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन विट्रो तैयारी में, ऊतक सीधे इलेक्ट्रोड संपर्क नहीं करता है, इस प्रकार विद्युत प्रभाव 16 कम से कम। डीसीएस के प्रभाव इलेक्ट्रोड है कि अलग अलग दिशाओं में उन्मुख थे के साथ तुलना की गई। जब Electrodतों 90 डिग्री और 270 डिग्री पर उन्मुख थे, डीसीएस पैदा की गतिविधि (चित्रा 3) को प्रभावित नहीं किया। इस प्रकार, इस नियंत्रित प्रयोग डीसीएस कि हमारे अध्ययन में ऊतक क्षतिग्रस्त करने के लिए विद्युत रासायनिक प्रतिक्रियाओं के किसी भी पक्ष प्रभाव की संभावना को बाहर रखा गया। मस्तिष्क स्लाइस की सुरक्षात्मक वसूली विधि एक और महत्वपूर्ण है; इस अध्ययन में aCSF सूत्र सुरक्षात्मक काटने विधि के लिए एक विकल्प प्रदान करता है और 4 से 8 सप्ताह पुराने जानवरों के लिए मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स के संरक्षण के लिए अत्यधिक प्रभावी है। विधि सभी उम्र के जानवरों के साथ प्रयोग के लिए तैयार नहीं है; Tris aCSF के उपयोग के रूप में चूहों आयु वर्ग के 6 सप्ताह और पुराने में nmdg सुरक्षात्मक वसूली विधि का इस्तेमाल होता है युवा चूहों में प्रभावी होना प्रतीत होता है। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को ध्यान में रखते हुए प्रजातियों भर रिश्तेदार उम्र equivalencies रखने के प्रयोग के लिए सबसे अच्छा तरीका चयन करने के लिए करना चाहिए।

मस्तिष्क स्लाइस रिकॉर्ड करने के लिए है एक आम तकनीक विदेश मंत्रालय का प्रयोग, लेकिन विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग व्यवस्था के साथ एक बिजली के क्षेत्र के संयोजनमंदिर आम तौर पर नहीं किया जाता है। विदेश मंत्रालय रिकॉर्डिंग प्रणाली की प्रवाहकीय समाधान में एक डीसी क्षेत्र को प्रभावित करने के लिए एक दिलचस्प दृष्टिकोण, खासकर मिनट के लिए कई सेकंड की अवधि के लिए है। पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि डीसीएस आवेदन ACSF समाधान में पीएच परिवर्तन नहीं किया, यह दर्शाता है कि प्रवाहकीय समाधान के पीएच इस प्रयोगात्मक स्थापना 12 में स्थिर था। एक अपेक्षाकृत तेजी से छिड़काव दर (8 मिलीग्राम / मिनट) जब्ती की तरह गतिविधि की सुविधा के लिए बनाए रखा गया था, और विदेश मंत्रालय की जांच में रासायनिक परिवर्तन की किसी भी उत्पाद छिड़काव से बाहर धोया गया है, इस प्रकार एक पीएच ढाल के निर्माण से परहेज। Multielectrode सरणी रिकॉर्डिंग प्रौद्योगिकी अक्सर मस्तिष्क टुकड़ा और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की सीमा के प्रकार के द्वारा सीमित है। मस्तिष्क टुकड़ा के प्रकार निर्धारित करता है जो सर्किट मार्ग दर्ज की गई है, और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की सीमा निर्धारित करता है कि एक या कई मस्तिष्क नाभिक दर्ज हैं। इन शर्तों प्रयोग से पहले पुष्टि की जानी चाहिए।

पूर्व vious अध्ययन है कि डीसीएस के दीर्घकालिक प्रभाव synaptic प्रसारण 17 के मॉडुलन के माध्यम से होती दिखाया। वर्तमान अध्ययन में, cathodal डीसीएस मीट्रिक टन एसीसी मार्ग में लिमिटेड का कारण बना। लिमिटेड या जब्ती से संबंधित potentiation के depotentiation tDCS उपचार के परिणाम की है कि वृद्धि का सुझाव संभव हो सकता जब्ती दमन की अंतर्निहित तंत्र का हिस्सा बनने के लिए प्रस्तावित किया गया था। हालांकि, कोई प्रकाशित एक अध्ययन सिंगुलेट प्रांतस्था पर क्षेत्र की ताकत पर ध्यान केंद्रित किया है। कोर्टेक्स की औसत दर्जे का भाग में सिंगुलेट प्रांतस्था के गहरे स्थान परीक्षण करने के लिए मुश्किल है। उदाहरण के लिए, यह है कि वर्तमान प्रवाह ऊतकों और वाहिकाओं है कि सतह के करीब हैं प्रभावित कर सकता है अपरिहार्य है। TDCS द्वारा गहरी ऊतक को निशाना बनाने की कठिनाई में विवो अध्ययन के लिए tDCS के आवेदन सीमित कर सकता है। इसलिए, समझने के लिए कैसे डीसीएस न्यूरोनल गतिविधियों को प्रभावित करता है, एक मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी गैर विशिष्ट संवहनी प्रभाव के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए बाहर रखा जाना करने की जरूरत है।

jove_content "> एक प्रयोगात्मक मॉडल की स्थापना के उद्देश्य के लिए, वर्णित जब्ती के लिए एक स्वस्थ मस्तिष्क में प्रेरित किया है। जब्ती-तरह की गतिविधियों के आगे एक विद्युत स्पंद से प्रेरित थे। जब्ती घटना के समय ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है जब डीसीएस लागू किया गया था । परिणाम tDCS उपचार के लिए और अधिक जानकारी उपलब्ध करा सकता है। एक और उल्लेखनीय लग रहा था कि लंबे समय से स्थायी tDCS से प्रेरित थे क्षेत्रीय cortical excitability में बदल जाता है। भविष्य में, tDCS की अंतर्निहित तंत्र elucidated किया जा सकता है, तो डीसीएस के संयोजन और औषधीय चिकित्सा मिर्गी के इलाज में लिमिटेड को बढ़ाने के लिए एक बहुत ही दिलचस्प विकास हो सकता है।

अंत में, thalamocingulate और transcallosal synaptic plasticity और तीव्र दौरे पर डीसीएस के प्रभाव की जांच के लिए एक पद्धति प्रदान किया गया। हमारे मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी में जब्ती की तरह गतिविधि पर डीसीएस के दीर्घकालिक प्रभाव एक लिमिटेड की तरह तंत्र के माध्यम से हुई।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic:
Isoflurane Halocarbon Products Corporation  NDC 12164-002-25 4%
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aCSF (total:1 L):
D(+)-Glucose MERCK 1.08337.1000 10 mM
Sodium hydrogen carbonate MERCK 1.06329.0500 25 mM
Sodium chloride MERCK 1.06404.1000 124 mM
(+)-Sodium L-ascorbate, >=98% SIGMA A4034-100G 0.15 g/2 c.c
Magnesium sulfate, anhydrous, ReagentPlus SIGMA M7506-500G 2 mM
Calcium chloride dihydrate MERCK 1.02382.1000 2 mM
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate MERCK 1.06346.1000 1 mM
Potassium chloride May & Baker LTD Dagenham England MS 7616 4.4 mM
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Drugs:
(+)-Bicuculline TOCRIS 0130 5 µM in aCSF
4-Aminopyridine TOCRIS 0940 250 µM in aCSF
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Brain slice Preparation:
Vibratome Vibratome Series 1000 Block slicing into 500 µm thick slices
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MEA system:
Multielectrode array (MEA) probes: 6 x 10 planar MEA Multi Channel Systems 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10 electrode diameter, 30 µm; electrode spacing, 500 µm; impedance, 50 kΩ at 200 Hz
Multielectrode array (MEA) probes: 8 x 8 MEA  Ayanda Biosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8 pyramidal-shaped electrode; diameter, 40 µm; tip height, 50 µm; electrode spacing, 200 µm; impedance, 1,000 kΩ at 200 Hz
A 60-channel amplifier was used with a band-pass filter set between 0.1 Hz and 3 KHz at 1,200X amplification Multi-Channel Systems MEA-1060-BC
MC Rack software at a 10 KHz sampling rate Multi-Channel Systems Software for data collect and recordings
control of a pulse generator Multi-Channel Systems STG 1002
slice anchor kits and hold-downs Warner Instruments SHD-26H/10; WI64-0250
Peristaltic Pump-minipuls3 Gilsom MINIPULS3 perfusion rate : 8 ml/min
Name Company Catalog Number Comments
Stimulation system:
Isolated stimulator A-M Systems Model 2100 intensity of ±350 μA , duration of 200 μsec
Tungsten electrode A-M Systems 575300 placed in thalamus

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References

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