En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

Biology

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Summary

En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.

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Yu, Y., Xiong, Y., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries. J. Vis. Exp. (108), e53718, doi:10.3791/53718 (2016).

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Abstract

óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir del endotelio NO-sintasa (eNOS) es una de las moléculas vasoprotective más importantes en la fisiología cardiovascular. Disfuncional eNOS como desacoplamiento de eNOS conduce a la disminución en la biodisponibilidad de NO y el aumento de anión superóxido (O 2 .-) de producción, y a su vez promueve las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, la medición apropiada de NO y O 2 .- niveles en las células endoteliales son fundamentales para la investigación sobre las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO y O 2 .-, es difícil medir el NO y O 2 .- directamente en un vaso sanguíneo. Numerosos métodos se han desarrollado para medir el NO y O 2 .- producción. Es, sin embargo, ya sea insensible, o no específicas, o técnicamente exigente y requiere un equipo especial. A continuación se describe una adaptacióndel método de colorante de fluorescencia para la detección simultánea en face y visualización de intracelular NO y O 2 .- utilizando la celda permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE), respectivamente, en aortas intactos de un modelo de obesidad inducida ratón por la alimentación alta en grasas de la dieta. Hemos podido demostrar una disminución intracelular NO y O 2 .- mejorado los niveles en las aortas intactas recién aisladas de ratón de la obesidad, en comparación con el ratón magra control. Se demuestra que este método es una técnica fácil para la detección directa y la visualización de NO y O 2 .- en los vasos sanguíneos intactos y se puede aplicar ampliamente para la investigación de la función endotelial (dys) en (fisio) condiciones patológicas.

Introduction

Las células endoteliales vasculares mantienen la integridad funcional y estructural vascular por la liberación de factores vasoactivos 1. Entre estos factores, el óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir de L-arginina a través endotelial NO-sintasa (eNOS) es el factor más importante y mejor caracterizado en la fisiología cardiovascular 2. NO causa la relajación del músculo liso e inhibe la proliferación celular, inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión celular y la infiltración inflamatoria en el espacio subendotelial, por lo tanto, la protección contra el desarrollo de enfermedad vascular 3. Bajo muchas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento, la hipertensión, la diabetes, la hiperlipidemia, etc., la disfunción endotelial se caracteriza por disminución de la biodisponibilidad de NO y el aumento de O 2 .- producción está presente y promueve la patogénesis de la aterosclerosis 2. Los estudios realizados en los últimos años demuestran que el desacoplamiento de la eNOS es unamecanismo importante para la disfunción endotelial, en la que la enzima eNOS genera O 2 .- en lugar de NO, bajo las diversas condiciones antes mencionadas 1,4. Por lo tanto, el análisis de la función endotelial, en particular, la producción de NO endotelial y O 2 .- generación es fundamental para la investigación experimental en las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones.

Hay numerosos enfoques metodológicos que se han desarrollado para analizar y medir la producción de NO en muestras biológicas. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO que se oxida fácilmente en NO 2 - y NO 3 - con una vida media de 3 a 6 segundos, es difícil de medir directamente NO. Por lo tanto la determinación de NO 2 - / NO 3 - en las muestras de fluido se utiliza como un índice de NO liberado de las células o tejidos 5. Aunque el procedimiento es relativamente fácil, el método es, sin embargo, easily afectados por el alto fondo del NO estable 2 - / NO 3 - contenida en la solución. Debido a que no estimula la guanilato ciclasa soluble para producir monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) 6, el nivel de GMPc celular también se ha determinado para estimar la liberación de NO 7. Una vez más, esta es una estimación indirecta y puede no ser específica, ya que algunos factores derivados del endotelio como-péptido natriurético tipo C (CNP) también podrían aumentar los niveles de GMPc a través de la activación de la guanilato ciclasa particulada 8. El NO es producido a partir de L-arginina con generación de L-citrulina como se utiliza por lo tanto también subproducto 9, la medición de la producción de L-citrulina como un método indirecto para estimar la producción de NO. Los principales inconvenientes de este método son que es radiactivo y no mide los niveles de NO bioactivos, ya que libera NO podría ser inactiva rápidamente por O 2 .-; Por otra parte, L-citrulina puede ser reciclado a L-arginina 10. Otros métodos químicos, tales como la detección de quimioluminiscencia 11, la resonancia de spin electrónico 12, o porfirínico electroquímica NO sensor 13 son utilizadas por varios investigadores. Estos métodos no son generalmente fáciles de funcionamiento, procedimientos de detección y requieren equipo especial. También es de mencionar que muchos estudios se aplican experimentos baño de órganos con vasos sanguíneos aislados con o sin el endotelio para evaluar la función endotelial y indirectamente medir relajaciones NO vascular mediada derivados del endotelio. Sin embargo, este método, aunque es en su mayoría cerca de situación fisiológica, pero estrictamente decir, no mide NO función, en lugar evalúa respuestas vasomotoras mediada por el endotelio en general que reflejan efectos netos de la función eNOS, la producción de otro relajante derivado del endotelio factores y factores contratantes derivados del endotelio, la producción de O 2 .-, y también las respuestas de las células del músculo lisoa estos factores. Un análisis específico de la función eNOS o la producción de NO por lo general se requiere 3.

Muchos grupos de investigación, incluyendo la nuestra tienen en los últimos años utilizan el método de tintura fluorescente para detectar la producción intracelular de NO 14-19. En este método se utilizó la célula indicador de fluorescencia permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) para medir la función libre de NO y NOS en células y tejidos in vitro o ex vivo vivo. El principio es que en las células vivas, DAF-2DA se desacetila por esterasa intracelular a no fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) que después se convierte en fluorescente DAF-2 triazol (DAF-2T) por reacción con NO . La fluorescencia de DAF-2T se puede observar bajo un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de fluorescencia 14. Por tanto, la intensidad de la fluorescencia intracelular refleja la producción de NO intracelular en las células o el endotelio de un vesse en sangre intactal. En combinación con un colorante de fluorescencia específica tal como dihydroethidium (DHE), se puede evaluar simultáneamente intracelular NO y O 2 .- generación en las células o en los vasos sanguíneos 14. Del mismo modo, DHE es también un compuesto permeable a las células que se oxida por O 2 .- dentro de las células, y el producto oxidativo a continuación, se intercala con ácidos nucleicos para emitir un color rojo brillante detectable cuantitativamente mediante microscopio de fluorescencia o fluorescencia microscopio confocal. DHE es un colorante muy específico para la detección de O 2 .- partir de muestras biológicas, ya que detecta esencialmente radicales superóxido, se conserva bien por las células, e incluso puede tolerar fijación suave 20. Una de las ventajas de este método de tinte de fluorescencia es que detecta y visualiza NO y / o O 2 .- en face directamente sobre la capa endotelial intacta de un vaso sanguíneo de estar.

En este papel,describimos este método colorante fluorescente para detectar el NO y O 2 .- que hemos adaptado para la detección de rostros es de NO y O 2 .- en aortas intactos de un modelo de ratón de la obesidad inducida por el alto contenido de grasa-dieta de alimentación (HFD). Se demuestra que este método podría con éxito y de forma fiable de medir el NO y O 2 .- niveles y evaluar la función eNOS (dis) en la capa endotelial de las aortas recién aislados intactos de ratón en la obesidad.

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Protocol

los animales de trabajo fue aprobado por el Comité Ético de la Oficina Veterinaria de Friburgo, Suiza. El protocolo sigue las directrices sobre cuidado de los animales y la experimentación en nuestra institución.

1. Preparación de una puesta a punto para la incubación de las arterias aislada

  1. Construir un sistema de baño de órganos que puede ser calentado a 37 ° C y se aireó con 95% O 2 y 5% de CO 2 de un tanque de gas de carbono.
  2. Preparar como mucho tampón de bicarbonato Krebs-Ringer según sea necesario con la concentración de la composición siguiente: (NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0.026 EDTA mM, y 11,1 mM de D-glucosa).
  3. Mantener la reserva de estabilización en hielo y airear el tampón con un 95% de O2 y 5% de CO2.
  4. Active el sistema de baño de órganos, ajustar la temperatura a 37 ° C, añadir 5 ml del tampón listo para su uso a cada cámaray mantener la aireación del tampón con un 95% de O2 y 5% de CO2.
  5. Lavar las cámaras de una vez con tampón de Krebs-Ringer durante 30 min.
  6. Añadir 5 ml de tampón de Krebs-Ringer a cada cámara y la cubierta de la cámara para evitar la evaporación.

2. Aislamiento del mouse aortas

  1. Inyectar pentobarbital que se disuelve en 0,9% de NaCl por vía intraperitoneal a una concentración de 150 mg / kg de sacrificar los ratones.
  2. Coloque el ratón supina sobre una tabla quirúrgica.
  3. Pulverizar la piel de la región del pecho con 70% de etanol a los efectos de la desinfección y la humedad.
  4. cavidad torácica abierta cortando alrededor de la costilla para exponer el corazón y los pulmones, y quitar los pulmones.
  5. Retire la sangre en la cavidad del pecho suavemente con un pañuelo de papel.
  6. Agarre el corazón suavemente con unas pinzas y separar la aorta torácica mediante la reducción del tejido adiposo perivascular entre la aorta y la espina dorsal con tijeras quirúrgicas.
  7. Inmediatamente sumerja el whole tejidos en hielo frío (4 ° C) tampón de Krebs-Ringer.
  8. Retire el corazón y el arco aórtico bajo un microscopio de disección y mantener el segmento de aorta torácica en el búfer.
  9. Diseccionar la aorta libre de tejido adherente perivascular con un microscopio con tijeras quirúrgicas y fórceps.
  10. Tome el borde final de la aorta con una pinza, y arrastre de la sangre en la luz vascular enjuagando suavemente tampón Krebs-Ringer con un 26 G x 1 / 2" jeringa.
  11. Cortar los anillos de aorta limpiados en segmentos más largos de 3 mm.
    Nota: Tener en cuenta en este paso para no dañar la capa endotelial.

3. DHE y DAF-2DA tinción

  1. La transferencia de los segmentos aórticos limpiadas con una pinza a las cámaras de baño de órganos lleno con el tampón de Krebs-Ringer a 37 ° C se aireó con 95% de O2 y 5% de CO2.
    Nota: solo se puede tocar el lado de la adventicia de los anillos aórticos con fórceps y no sujetar la bLood vasos.
  2. Equilibrar las arterias en la cámara de baño de órganos para 30 min.
  3. Añadir la acetilcolina (ACh) al baño de órganos a la concentración final de 1 mM, y se incuban las arterias de 10 min.
  4. Preparar 1 ml de solución DHE / DAF-2DA (5 M de cada colorante, diluido a partir de 1000 × Stock) con tampón de Krebs-Ringer pre-calentado en 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Envolver el tubo de microcentrífuga con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
  5. Después de la estimulación, la transferencia de los anillos aórticos de baño de órganos a la solución DHE / DAF-2DA en un tubo de microcentrífuga a 37 ° C aireada con 95% O 2 y CO 2 al 5% y se incuban los anillos de aorta durante 30 minutos.
    Nota: A partir de este paso, mantener las aortas siempre en la oscuridad.
  6. La transferencia de los anillos aórticos a un nuevo tubo de microcentrífuga con tampón de Krebs-Ringer para el lavado y repita el lavado tres veces en 1 min.
  7. La transferencia de los anillos aórticos a la solución de paraformaldehído al 4% para la fijación de 30min.
  8. Preparar 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) solución (300 nM, diluido a partir de 1000 × Stock) con salina tamponada con fosfato (PBS) tampón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. CONTRATINCIÓN las aortas durante 3 min.
  9. Transferencia de las aortas de nuevo tubo de microcentrífuga con tampón de PBS para el lavado de 1 min. Repita el lavado tres veces.
    Nota: Tenga cuidado de no apretar los anillos de aorta o dañar la capa endotelial.

4. Montaje En Face

  1. Añadir una gota de medio de montaje a la diapositiva.
  2. Cortar los anillos de aorta longitudinalmente con tijeras de microcirugía con el microscopio, hacer que las aortas enrolladas plana y montarlo en face en el medio de montaje con el endotelio hacia abajo sobre el portaobjetos de vidrio. No mueva las aortas de ida y vuelta.
  3. Cubrir el portaobjetos con cubreobjetos y selle la diapositiva con esmalte de uñas.
  4. Después de secado al aire bajo la protección de la luz, utilizar las diapositivas para obtener imágenes de extremactly en cuestión de horas o almacenarlos a -20 ° C para los próximos días.

5. confocal de imágenes microscópicas

  1. Use un microscopio confocal para detectar las señales de fluorescencia. Encender la máquina y optimizar los ajustes de imagen como la ampliación, la velocidad de escaneo, resolución, Z-pila.
    1. Para este protocolo, utilizar una velocidad de barrido de 200 Hz, resolución de 1.024 x 1.024 píxeles y el tamaño de Z a paso de 0,25 micras. Excite fluorescencia de DAF-2DA con 488 nm láser de argón y detectar a 515 nm, mientras que excitar la fluorescencia de DHE en 514 nm y detectar a 605 nm de emisión.
  2. Utilice 10X aumentos para centrarse en la muestra hasta que la señal DAPI es clara con rayos ultravioleta, y luego ajustar el objetivo de 40x.
  3. Definir el rango de la capa endotelial mediante el ajuste de la posición Z en el panel de control. Las señales de los núcleos con DAPI manchadas son puntos ovalados o redondos en la capa endotelial.
  4. Escanear desde la parte superior(Capa endotelial en la frontera lumen) de la muestra a través del espesor completo de imágenes de señal de registro y endoteliales. Elija por lo menos 3 campos diferentes para el escaneo de cada muestra.

6. Análisis de Imágenes

  1. Utilice el software para abrir los datos escaneados por microscopio confocal. Elija tres imágenes consecutivas por campo para el análisis y evaluación de al menos 3 diferentes campos por muestra. Exportar las imágenes elegidas y guardarlas como archivos JPEG.
  2. Cuantificar las imágenes de DAF-2DA, DHE y DAPI con el software de procesamiento de imágenes. Para la imagen de DAPI, seleccione 'plugins' → 'Analizar' → 'contador de células' para contar el número de núcleos DAPI positivo.
    1. Para las imágenes de DAF-2DA y tinción DHE, seleccione "Analizar" → "Medir" para analizar la intensidad de las señales, y tomar el valor 'Mean' como la intensidad relativa de la señal. Presente, entonces los resultados como la relación de DAF-2DA anúcleos positivos DAPI o relación de DHE para DAPI. Para cada muestra, tomar el valor promedio de cada imagen y el campo.
  3. Dividir el resultado de cada muestra por la media del grupo de control para obtener el factor de cambio. El análisis estadístico se realizó con unpaired la prueba t de Student o ANOVA con Dunnett o post-test de Bonferroni. Dar los datos como media ± SEM. Considerar las diferencias en los valores medios como significativos valores de p <0,05 14.

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Representative Results

La obesidad es un importante factor de riesgo de enfermedad coronaria isquémica y se asocia con una disminución de la biodisponibilidad de NO endotelial, una característica de la enfermedad vascular aterosclerótica 21. eNOS-desacoplamiento ha demostrado ser un importante mecanismo de la disfunción endotelial bajo numerosas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento 22, la aterosclerosis y la obesidad 14. Por lo tanto, aquí se comparan los ratones delgados y obesos para mostrar el resultado representativo de NO y O 2 .- niveles en las aortas.

A partir de la edad de 7 semanas, los ratones macho (C57BL / 6J) se les dio acceso libre durante 14 semanas ya sea a un pienso normal (NC; contenido de energía: 10,6% de grasa, 27,6% de proteína, y 57% de carbohidratos, fibra 4,8% ) o una dieta alta en grasas (HFD, contenido de energía: 55% de grasa, 21% de proteína, y 24% de carbohidratos). Después fueron de 14 semanas de ratones HFDsacrificaron y se diseccionaron las aortas torácicas, y limpiarse de los tejidos adherentes. Antes de DAF-2DA y DHE fase de tinción, la eNOS inhibidor se añadió LN G -Nitroarginine éster metílico de (L-NAME) (1 mM) a la cámara de baño durante 1 hora para bloquear la actividad de la eNOS 14. Los resultados representativos de fluorescencia confocal se muestran en la Figura 1. El color azul en el panel superior representa el núcleo de las células endoteliales teñidas por DAPI. En el panel central, el color verde es la señal de fluorescencia de DAF-2T convertido de la DAF-2 no fluorescente por el NO, lo que significa que si la intensidad de la señal verde es mayor, hay más NO en las células. Del mismo modo, el color rojo en el panel inferior es la señal de fluorescencia de DHE oxidado por O 2 .-, por lo que la muestra que muestra un color más rojo tiene más de O 2 .- en las células.

microscopía de fluorescencia confocal reveló disminuciónd producción de NO (DAF-2DA tinción) y el aumento de O L-NAME sensible 2 .- generación (tinción DHE) en la capa endotelial aórtica de los ratones alimentados con HFD en comparación con la de los ratones alimentados con NC (Figura 1) 14, lo que sugiere la eNOS-desacoplamiento de la obesidad. Las señales se cuantificaron y se presentan en los gráficos de barras 14.

Figura 1
Figura 1. eNOS-desacoplamiento de la obesidad. Microscópica confocal en la detección de rostros de NO y O 2 .- por DAF-2DA y tinción DHE, respectivamente. n = 5; *** p <0,005 vs Carolina del Norte; ††† p <0,005 vs grupo HFD. Barra de escala = 0,1 mm. (Los datos fueron de referencia 14) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Detección de NO o O 2 .- con tintes fluorescentes se utiliza con frecuencia en muchos estudios en cultivos de células endoteliales y también en criosecciones de tejido 23. Aquí hemos extendido este método a los vasos sanguíneos de vida intacta, es decir, en la detección de rostros de NO y O 2 .- niveles en la capa endotelial con DAF-2DA y DHE, respectivamente, que sea eficaz, relativamente simple y intuitiva. En comparación con el método en el cryosections vasculares, este método muestra fondo inferior y es más cuantitativo, ya que las fibras elásticas de los medios de comunicación de una arteria particularmente la aorta en el cryosections dan muy fuertes señales de autofluorescencia, que podría interferir con el NO o O 2 específico. - las señales generadas en las células endoteliales. Por otra parte, O específico 2 .- generación de NADPH oxidasa u otras enzimas en las células del músculo liso medial también podrían interferircon las señales en las células endoteliales en la sección vascular, que representa la desventaja del método con cryosections vasculares. En contraste, el método de tinción en la cara detecta señales específicamente de la capa endotelial de un segmento de vaso sanguíneo intacta y por lo tanto da análisis más preciso. Una máquina para la preparación de criostato sección criogénica es también una inversión costosa. En comparación con otros métodos bioquímicos, la principal limitación de este método es menos cuantitativo, pero es una buena opción para la comparación relativa entre muestras. Además, el requisito de un microscopio confocal, que es caro también puede ser una limitación de este método. El sistema de cámara de múltiples órganos es conveniente y si esto no está disponible en el laboratorio, se puede establecer fácilmente un sistema con baño de agua y tubos que están conectados a un tanque de gas de carbono con sistema de regulación, de modo que los vasos sanguíneos en los tubos están mantenido a 37 ° C y se aireó con 95% de O2 y 5% de CO

Hay varios pasos críticos que uno tiene que prestar atención. Asegúrese de que el tejido perivascular se limpia para un fácil montaje. Los coágulos de sangre en la luz vascular deben ser eliminados de distancia, ya que pueden causar señales artificiales e interferir con las señales de fluorescencia. Durante todo el procedimiento de preparación de los vasos sanguíneos, incubación, lavado, corte y montaje, hay que ser extremadamente cuidadoso para no dañar la capa endotelial de los vasos sanguíneos. No permita que el vaso sanguíneo seco durante todo el procedimiento de preparación. DHE y DAF-2DA son ambas sondas fluorescentes, por lo que a partir de la etapa de tinción de las aortas deben ser siempre protegidos de la exposición a la luz. Antes de la fijación paso las células endoteliales de aortas deben estar vivos, por lo que las aortas deben mantenerse siempre en el tampón de Krebs-Ringer aireada con 95% de O2 y 5% de CO2. Las imágenes de las muestras deben tomarse tan pronto como sea posible después de la preparación. la fluorescenciaseñal NCE será más débil en unos pocos días, incluso con la protección de medio de montaje, lo que puede afectar a la precisión de los resultados. El método puede no ser aplicable para los vasos sanguíneos con la pared vascular demasiado grueso.

Este método permite la imaginación simultánea de NO y O 2 .- producción en la capa endotelial de los vasos sanguíneos intactos, si se han añadido los dos colorantes a los vasos sanguíneos juntos. También se puede utilizar este método para evaluar los efectos farmacológicos de los fármacos sobre el NO y O 2 .- producción in vitro en los vasos sanguíneos aislados. Para este propósito, la aorta limpiado se corta generalmente en dos partes, una es para el control y el otro es para el tratamiento de drogas, y el fármaco debe añadirse al tampón de incubación después de equilibrio antes de DAF-2DA y DHE tinción paso. Es particularmente útil, si se utiliza este método junto con otro método, por ejemplo, con el análisis de las respuestas vasomotoras de sangre aislado vessels, una función fisiológica de las células endoteliales puede ser confirmada. Este método será también adecuado para el análisis de cualquier función endotelial (dis) en los vasos sanguíneos intactos de modelos de enfermedad y los mecanismos subyacentes.

En resumen, presentamos un protocolo sencillo para detectar simultáneamente NO y O 2 .- producción en la capa endotelial de los vasos sanguíneos intactos con un microscopio confocal de fluorescencia. Se muestra cómo este método ha funcionado con éxito en el modelo de ratón de la obesidad. Este método es una técnica útil en la investigación de NO endotelial y O 2 .- producción bajo muchas condiciones de enfermedad vascular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dihydroethidium (DHE) Invitrogen D 1168 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA) Calbiochem 251505 dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1,000x stock, stored at -20 °C
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D 1306 dissolve with water to 300 µmol/L as 1,000x stock, stored at 4 °C
Mounting medium Vector labor. (reactolab) H-1000
Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) Sigma-aldrich N5751
Pentobarbital Sigma-aldrich P3636
Multi-Myograph System  Danish Myo Technology A/S Model 610M
Microscope Nikon SMZ800
Confocal microscope  Leica  DM6000 
Image processing software National Institute of Health (NIH) Image J 
Surgical scissors  S&T AG SDC-11
Microsurgical scissors  F.S.T 15000-01
Forceps S&T AG JF-5
Coverslip round diameter 15 mm VWR 631-1579
Tips 1 ml VWR RFL-1200c 
Tips 200 μl VWR 613.0659
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml Eppendorf  30120086
Acetylcholine chloride Sigma-aldrich A-6625

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