자기 마이크로 비드 폐색 모델 마우스의 녹내장 안구 고혈압 종속 유도합니다

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Summary

여기서는 관찰 녹내장, 망막 신경절 세포의 손실을 초래 쥐 눈 안압을 유도 프로토콜을 제시한다. 자기 마이크로 비드는 전방에 주입과 방수의 유출을 차단하는 자석을 이용하여 홍채 각막 각도에 매료된다.

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Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).

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Abstract

녹내장의 설치류 모델의 사용은이 인성 신경 퇴행성 질환의 병태 생리의 기초 분자 메커니즘을 이해하는 것이 필수적이었다. 다수의 유전자 변형 마우스 라인의 출현으로, 안구 고혈압의 유도 쥐 모델에 대한 관심이 높아지고있다. 여기서, 우리는 각면 경사에 변형 미세 바늘을 이용하여 안구의 전방에 자성 마이크로 비드의 주사에 기초하여 녹내장 폐색 모델을 제시한다. 자기 마이크로 비드는 전방에서 방수의 배출을 차단하는 휴대용 자석을 이용하여 홍채 각막 각도에 매료된다. 인간 녹내장 환자에서 관찰되는 바와 같이해서, 망막 신경절 세포의 손실에 이르게 안압의 상승 고도 수성 역학 결과이 중단. 이 논문에 제시된 마이크로 비드 폐색 모델은 매우 다른 유도 녹내장의 모델과 간단한 비교된다효과적이고 재현. 중요한 것은, 여기에 제시된 수정은 종종 폐색 모델에서 발생하는 일반적인 문제를 최소화 할 수 있습니다. 먼저, 경 사진 유리 미세 바늘의 사용 마이크로 비드의 역류를 방지하고, 최소한의 손상, 따라서 부상과 관련된 영향을 감소 주입 중에 각막 발생하는 것을 보장한다. 둘째, 자성 마이크로 비드의 사용은 효과적으로 다른 구조와의 접촉을 회피 전방에 떠 비드 (예., 조리개, 렌즈)의 수를 줄일 홍채 각막 각에 가장 비드를 유치하는 능력을 보장한다. 효율적 자성 마이크로 비드를 지시하고, 미세 바늘이 인출 될 때 눈에서 마이크로 비드의 작은 환류가되도록하여 작은 마우스의 눈을 취급 할 때, 마지막으로, 휴대용 자석의 사용은 융통성을 허용한다. 요약하면, 여기에 제시된 마이크로 비드 폐쇄 마우스 모델은 glau의 발병과 진행 중에 발생하는 신경 퇴행성 변화를 연구하는 강력한 조사 도구입니다혼수.

Introduction

녹내장은 2020 전 세계적으로 약 80,000,000명에 영향을 미칠 것입니다 진보와 돌이킬 수없는 실명 상태이다. 녹내장 환자에서 시력 상실은 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)로부터 시각 정보를 전송 출력 뉴런의 선택적 죽음에 의해 발생 뇌에 망막. 녹내장은 가장 많이 상승 된 안압 (IOP) 인 여러 위험 인자와 노인성 퇴행성 신경 질환이다. 녹내장과 현재의 치료는 안압을 관리에만 초점에서 실제로 IOP는 만 수정 위험 인자이다. 그러나 여러 유전자 세포, 환경 요인이 질병의 발병과 진행에 영향을 미칩니다. 따라서, 궁극적으로 신경 세포 사망에 기여하는 다양한 메커니즘을 이해하는 것은 녹내장 효과적인 치료법을 개발하는 것이 필수적이다.

녹내장의 동물 모델은 질병의 병태 생리를 공부하고 파악하고 테스트하는 것이 필수적이다유망 치료제. 유 전적으로 인코딩 된 형광 트레이서를 운반 조건부 녹아웃 생쥐 균주를 포함한 트랜스 제닉 마우스 라인의 증가 여부는 유도 성 녹내장 뮤린 모델의 필요성을 추진 하였다. 녹내장의 몇몇 설치류 모델 (2,3- 검토) 수년에 걸쳐 개발되어왔다. 이 모델의 많은에서는 녹내장은 안압의 상승의 결과로, 수성 유머 역학을 방해에 의해 유도된다. 마이크로 비드 또는 다른 물질을 수성 배출을 차단하는 눈의 전방 챔버로 주입되는 폐색 모델은 부분적으로 IOP 4-14 증가 상대적 용이성 최근 인기를 얻고있다.

12 영장류에서 실시 녹내장의 마이크로 비드 폐색 모델, 토끼 84,9,11는 최근 마우스 5,6,10-에 사용하기에 적합 하였다. 이러한 연구에서, 폴리스티렌 마이크로 비드의 전방 내 주사, 단독 또는점탄성 물질과 조합은 이후 RGC 죽음 6,10으로 이어지는 안압 상승의 결과. 그러나 바늘은 홍채 각막 각도에서 마이크로 비드의 눈 빠지로부터 배출되는 환류 절차를 수행하는 동안 발생하는 일반적인 문제입니다. 이러한 단점을 최소화하기 위해서, 자석은 눈의 홍채 각막 4,9 각도 자성 마이크로 비드를 유인하기 위해 사용되어왔다.

여기에 설명 된 프로토콜 자성 마이크로 비드와 마우스 눈에 적합한 소형 자석 (도 1)를 사용하는 이전의 연구에 기초하여 9,10- 변형 절차이다. 몇 가지 중요한 변경은 마우스에서 효과적이고 재현 안압 상승을 보장하기 위해 우리의 프로토콜에 도입되었다. 첫째, 마이크로 비드의 주입은 각면 경사와 함께 신중하게 준비 유리 미세 바늘을 사용하여 수행됩니다. 다음은 미세 바늘의 결과로 부드러운 표면뿐만 아니라 날카롭게 끝은 최소한의 손상이 있음을 보장합니다그것이 각막 천공으로 가해. 미세 바늘 팁함으로써 이러한 홍채 렌즈로 손상 주변 구조의 위험을 감소 전방에 진입 할 때 유리 미세 바늘의 사용은 증가 된 제어를 초래한다. 또한, 작은 주입 병변은 각막 자체 수리를 용이하게하고 원치 않는 부상 관련 효과를 감소시킨다.

둘째, 자기 마이크로 비즈의 주입 및 휴대용 자석의 사용은 정확한 컨트롤이 작은 마우스 눈의 홍채 각막 각도로 구슬을 유치 할 수 있습니다. 이 마이크로 비드 크기가 준비 미세 구멍을 막고 중요한 것은, 한 번 주입하지 않았기 때문에 직경 4.5 μm의 사용 하였다 자성 마이크로 비즈,이 마이크로 비드 효과적으로 방수의 배출을 차단. 이 접근법은 단지 주입 된 마이크로 비드의 환류를 줄일뿐만 아니라, 마이크로 비드의 최대 개수를 효과적으로 방수 소모를 차단하는 표적 영역에 축적되도록. 작고에hermore이 전략은 또한 후방 챔버 조리개 렌즈, 예방 통로 등의 다른 구조와의 접촉을 회피 전방에 떠 비드의 수를 감소시킨다. 종합적으로, 이러한 수정은 마이크로 비드 주입 수술은 상대적으로 쉽게와 마우스의 안구 고혈압의 높은 재현성 효과적이고 지속적인 유도의 결과로 적시에 수행되어 있는지 확인합니다.

Protocol

다음 절차는 실험 동물의 사용 및 비전 및 안과 (ARVO) 연구 협회에서 안과에서 동물의 사용 및 Visual 연구를위한 정책에 대한 동물 관리에있는 캐나다 협의회의 지침을 준수 하였다.

전방 내원시 주입을위한 미세 1. 준비

  1. 풀러 통해 보로 실리케이트 유리 모세관으로부터 미세 생성
  2. 현미경 신중 미세 바늘의 선단부에 개구를 생성하기 위해 날카로운 칼날을 사용한다. 얻어진 개구는 각각 약 190 ㎛ 내지 70 ㎛의 주요 및 부축 직경을 갖는 타원 형상을 가져야한다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량 한 다음 현미경으로 배치 된 눈금자 제 취득 화상에 의해 제조 된 미세 개구의 면적을 측정한다.
  3. 마이크로 피펫의 연삭 값 시스템에서, 20 degre에서 미세 배치연삭 값 판에 전자 각도 미세 바늘 구멍이 판을 만지지 않도록. 베벨 가장자리까지 약 10 분 평평하고 매끄러운이기 때문. 프로세스에 도움을 증류수로 몇 방울을 추가한다.
  4. 끝이 날카로운 될 때까지 개방을 둘러싼 두 개의 가장자리를 베벨하는 미세 바늘을 돌립니다.
  5. 에어로졸 살포를 사용하여 미세 팁 오프닝에서 청소 모든 먼지와 물.
  6. 조심스럽게 현미경 완성 된 미세 바늘을 검사합니다. 골절 취소 미세 바늘 수술 중에 미세 바늘 파괴의 위험을 최소화합니다.
  7. 다음 멸균 평형 염 용액 (BSS)과, 에탄올로 세정하여 제 미세 멸균.

마그네틱 마이크로 비드 솔루션 2. 준비

참고 : 본 연구에 사용 된 자성 마이크로 비드는 에폭시기로 코팅된다. 같은 구슬의 응집 및 원치 않는 분자 상호 작용 같은 부작용을 방지하려면 다음 에폭시 그룹은해야합니다먼저 주입 수술을 진행하기 전에 마이크로 비드로부터 제거 될 수있다.

  1. 자석 구슬에서 에폭시 그룹의 제거
    1. 배 트리스 완충액, 0.02 M 수산화 나트륨 (NaOH로, MW 39.997 g / 몰)의 용액 (MW 121.14 g / 몰)을 준비한다.
    2. 부드럽게 자성 마이크로 비드 용액 재고 와동 (4.5 μm의 직경, 4 × 10 8 비드 / ㎖) 비드 균일 용액에 현탁 될 때까지.
    3. 배 빠르게 트리스 완충액에 0.02 M NaOH를 50 ㎖에 자성 비드 용액 1 ㎖를 피펫.
    4. 구슬에서 에폭시 그룹을 제거하기 위해 RT에서 24 시간 동안 회전합니다.
    5. 상기 튜브의 하단에 자석을 고정하여 비드를 모은다. 모든 구슬이 자석에 매료되도록 수평 관의 방향. 실온에서 추가로 4 시간 동안 회전합니다.
    6. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다.
    7. 부드럽게 배 T 50ml에 펠릿 와동구슬이 잘 일시 중단 될 때까지 RIS 버퍼.
    8. 반복 2.1.6에 2.1.4 단계를 반복합니다.
  2. 농도 및 무균 균형 소금 솔루션에서 자기 마이크로 비드의 재 부유

주 : 2.4 × 106 비드 A의 전방 챔버로 주입 될 수 있도록 1.6 × 106 비즈 / μL의 최종 농도에 도달하기 위해 멸균 평형 염액 자석 구슬 용액 재고 집중할 필요 작은 마우스의 눈에 적합한 1.5 μL의 최종 부피.

  1. 부드럽게 2 분 동안 텍싱에 의해 매우 순수 실험실 수준의 물 5ml에 구슬을 씻으십시오.
  2. 자석과 상기 튜브의 저부로 흡인하여 비드를 모은다.
  3. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 물을 제거합니다.
  4. 반복 2.2.1 2.2.3에 세 번 이상 반복합니다.
  5. 층류 후드에서 pipettin하여 BSS 500 μL와 비드 세척상하 g. 층류 후드에서 무균 조건에서이 섹션의 나머지 단계를 수행합니다.
  6. 자석과 상기 튜브의 저부로 흡인하여 비드를 모은다.
  7. 마이크로 피펫으로 조심스럽게 구슬의 펠렛을 방해하지 않고 BSS를 제거합니다.
  8. 반복 2.2.5 2.2.7에 세 번 이상 반복합니다.
  9. 상하 BSS 250 μL의 구슬을 피펫 팅에 의해 재현 탁.
  10. 비드 솔루션은 잘 균질화 있는지 확인합니다. 그 후, 빠르게 멸균 0.5 ㎖의 튜브에 현탁액 25 μL 나누어지는. 재고 비드 용액의 최종 농도는 1.6 × 106 비즈 / μL이다.
  11. 4 ℃에서 보관하십시오.

안구 고혈압의 3. 유도

참고 : 3 절은 두 사람의 작업입니다. 특정 조치가 특정 사용자에 의해 수행되는 경우, 해당 사용자가 식별된다. 사람이이 R 인 동안 일반적 이용시 1 현미경으로 마우스를 처리마이크로 실린 펌프를 조작하기위한 잖소. 수술의 총 지속 시간보다 10 분이어야한다 (3.17-3.9 단계).

  1. 성인 C57BL / 6 마​​우스에서 절차를 수행합니다. 음식과 물을 광고 무제한에 액세스 할 수있는 표준 환경에서 하우스 마우스. 본 논문에서는 3 세 4.5 개월 사이에 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 유전자 녹아웃 마우스를 비롯한 남성 및 다양한 연령대의 마우스뿐만 아니라 다른 마우스 균주에 적용 할 수있다.
  2. 교정 리바운드 안압계를 사용하여 이전에 마취 및 마이크로 비드 주입에 깨어 마우스에서 기준 안압을 측정합니다. 각막에 proparacaine 염산염 한 방울을 적용합니다.
    1. 조심스럽게 귀 사이의 피부를 잡고 마우스를 억제. 동물이 편안하고 눈에 액세스 할 수 있도록 벤치 탑에 마우스를 놓습니다. 각막 표면에 수직 안압계를 잡고과를 얻기 위해 눈 당 열 연속 판독 적어도 3 세트 걸릴IOP의 평균. 깨어 마우스에서 안압의 측정은 IOP에 마취 관련 효과를 우회하는 것이 바람직하다. 또한, IOP 단계 3.4 이후 anesthetised 마우스에서 측정 할 수있다.
  3. 20 ㎎ / ㎖ 케타민, 2 ㎎ / ㎖ 자일 라진, 0.4 ㎎ / ㎖ 아세 프로 마진으로 구성된 주식 마우스 칵테일 마취 혼합물을 준비합니다.
  4. 칵테일 혼합 (체중의 1 μL / g)의 복강 내 투여에 의해 마우스의 마취를 유도한다. 동물은 흡입 마스크에 접속되지 않는 마우스 헤드를 운반 할 때 유연성을 허용하기 때문에 주사 마취 칵테일의 사용은 (예를 들면, 이소 플루 란) 가스 마취제를 통해 바람직하다. 또한, 주사​​ 마취 필요한 긴 회복 기간은 마이크로 비드 전방에 다시 빠지 않고 홍채 각막 각도 정착 것을 보장한다.
  5. 부 프레 노르 핀의 피하에 체중 kg 당 0.05 mg의 투여.
  6. tropicamide의 EY으로 눈을 치료전자 동공 팽창을 유도 놓습니다. 뮤린 인해 전방의 작은 크기, 퓨필 쉽게 주입시 미세 바늘의 위치 및 전진을 시각화 넓혀진되어야한다.
  7. 절차를 수행하는 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 반대편 눈 (미 작동)에 국소 연고를 적용합니다.
  8. 마이크로 실린 펌프의 주입 어셈블리에 깨끗한 미세 바늘을 연결합니다. 크로스 동물의 오염을 방지하기 위해 모든 작업 후 미세 바늘을 교체합니다.
  9. 사람 1 : 운영 플랫폼에 anesthetised 마우스를 전송합니다. 현미경, 동공이 완전히 팽창 된 것이 더 안구 운동이 없도록 안구 근육 이완 것을 보장한다. 안구 운동의 부재는 사출 동안 안정성을 보장한다. 부드럽게 흡수 면봉을 사용하여 눈의 tropicamide 눈 방울을 닦아냅니다.
  10. 사람 2 :로 pipetting 아래로 자기 마이크로 비드 솔루션을 섞는다.
  11. 마이크로 실린 펌프를 사용하여 즉시 MICR로드oneedle 균질 자성 마이크로 비드 용액 (2.4 × 10 6 구슬)의 1.5 μL와 (섹션 1에서 제조). 그 기포가 미세 바늘의 끝에 존재되도록. 미세 바늘이로드 된 후 수행 자성 마이크로 비드 용액이 균질 한 현탁액을 유지하도록 가능한 한 빨리 3.12 3.13 단계.
  12. 윤부에 전방의 상대 위치를 45 ° 각도로로드 된 미세 바늘을 배치합니다. 이용시 1 : 플라스틱 집게를 사용하여 눈을 지원한다. 미세 바늘 및 플라스틱 집게 사이의 각도는 약 90 ° 있는지 확인하십시오.
  13. 이용시 2 : 미세 바늘의 선단이 전방에 진입하도록 적재 미세으로 부드럽게 각막 천공. 로드 된 미세 바늘이 찔린 동안 윤부에 45 °의 각도로 남아 있는지 확인합니다. 렌즈 나 조리개와의 접촉을 피하십시오. 미세 바늘이 후방 챔버를 입력하지 않도록하십시오. 이용시 1 : 눈을 계속 지원플라스틱 집게를 사용.
  14. 이용시 1 : 마우스 헤드를 이동하지 않고, 전방에 자성 비드를 끌어 각막의 내면 비드의 접촉을 최소화하기 위해, 대향하는 미세 바늘 팁 눈 옆의 자석을 배치했다. 이용시 2 : 마이크로 실린 펌프를 사용하여이 전방으로 자성 비드 용액 1.5 μL를 주입. 마이크로 비드 용액을 15 내지 30 초에 걸쳐 주입한다. 사람 1 : 주입의 전체 기간 동안 미세 팁에 자석 반대를 계속 누르고 있습니다.
  15. 이용시 2 비드의 전체 부피가 주입되면 천천히 눈에서 미세 철회. 사람 1 : 마이크로 비드의 역류를 방지하기 위해, 추가로 30 ~ 60 초 동안 옆에 눈에 자석을 잡고 전방을 향해 자기 구슬을 유치하는 것을 계속한다.
  16. 이용시 1 : 자석을 이용은 홍채 각막 각도 구슬을 끈다. 구슬이 균일하게 분포 고리를 형성하는지 확인전방의 둘레 주위에. 이 단계 동안, 그들이 접촉시 각막의 내면에 부착되는 경향을 갖지으로 각막 비드 유치 피한다.
  17. 감염의 위험을 최소화하기 위해 항생제 점안하여 안구 동작을 처리한다.
  18. 마우스 (~ 3-4 시간) 잠에서 깨어 때까지 열 패드를 복구 할 수 있습니다. 조작 된 눈이 위쪽으로 향하도록 마우스를 놓습니다. 이 위치는 중력에 의한 각막의 내면에 주입 된 비드 축적을 방지 할 것이다. 또한,이 위치는 조작 눈 임의 침구 및 / 또는 케이지에 존재할 수있는 다른 물질과 접촉하지 않으므로 감염의 가능성을 감소한다. 필요에 따라 동물이 고통의 흔적을 표시하는 경우, 부 프레 노르 핀의 추가 용량을 관리 할 수​​ 있습니다.
  19. 마우스 안압 측정을하기 전에 적어도 2 일 동안의 절차를 복구 할 수 있습니다. 3.2에 설명 된대로 안압을 측정합니다. 모니토 IOP 적어도 일주일에 한번 또는 필요한만큼 자주, 그리고 하루 동시에 주기성 관련 변동을 최소화한다.
  20. 안압 측정을 위해 내부 통제로 운영 마우스에서 반대편 눈을 사용합니다. 또한, 손상, 비 조작 또는 가짜로 작동하는 마우스와 같은 순진한 컨트롤에서 측정 값을 사용합니다.

4. 평가 망막의 신경절 세포 소마와 축삭 생존

  1. 즉시 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)이어서 0.1 M 인산 완충 용액 (PBS)의 intracardial 주사 안압 실시 쥐 관류.
  2. 4.1에 기재된 바와 같이 본래 비 작동 쥐를 관류하고 손상되지 않은 대조군으로 사용할. 운영 마우스의 반대편 눈의 사용은 부상 다음 반대편 눈의 변화가 15, 16을보고되었습니다 및 데이터 해석을 혼동 할 수 있기 때문에 RGC 생존을 평가하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 사용 가짜 운영의 눈은 1 주입컨트롤과 같은 BSS의 0.5 μL.
  3. microscissors를 사용하여 조심스럽게 눈 소켓에서 분리하는 눈 주위의 결합 조직을 잘라. 시신경 헤드의 레벨을 절단하여 눈의 시신경을 분리한다.
  4. 30 G 바늘을 사용하여, 눈에 정착 제 용액의 침투를 허용하는 막에 구멍을 만든다. 4 % PFA에 눈을두고 추가 고정 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
  5. (MW : 214g / mol)의 2 % PFA 0.1 M 나트륨 cacodylate에서 2.5 %의 글루 타르 알데히드를 함유 한 용액에 시신경을 놓고 추가 고정 4 ℃에서 O / N을 품어.

5. RGC 소마 농도의 정량화 평면 탑재 망막

. 다음 절차는 나달 - 니콜라스 (17)에 의해 프로토콜에서 적응되어 망막 평면 마운트에 뇌의 특정 호 메오 박스 / POU 도메인 단백질 3A (Brn3a)에 대한 항체를 이용하여 망막 신경절 세포의 정량을 간략하게 설명합니다. 대체 메트라벨 망막 신경절 세포에 대한 ODS는 Fluorogold 또는 DII 여러 스 플라이 싱 (RBPMS) 또​​는 역행 표시와 RNA 결합 단백질에 대한 항체와 면역 조직 화학을 포함하여 사용할 수 있습니다.

  1. 해부 현미경 각막 쉽게 분리 될 때까지 전체 윤부 따라 절개함으로써 눈의 앞쪽 부분을 제거한다. 각막과 렌즈를 제거합니다. 조심스럽게 오라 세라와 시신경을 따라 절개함으로써 눈의 망막을 분리합니다.
  2. 분명 네 망막 사분면을 묘사하는 시신경으로 망막의 주변부에서 4 개의 작은 등거리 절개를하여 망막 평면 마운트를 준비합니다. 작은 브러시를 사용하여 부드럽게 망막에 남아있는 유리체를 제거합니다. 가급적 유리체의 제거는 깨끗하고 강한 면역 신호를 얻기 위해 중요하다.
  3. 망막이되도록 조심스럽게 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 48 웰 평면 바닥 배양 판 망막 전송자유 부동. 신경절 세포 층이 위쪽으로 향하게되어 있는지 확인합니다.
  4. 15 분 동안 -70 ℃에서 배양 접시를 놓습니다. 신선한 PBS 2 % 트리톤 X-100으로 두 번 세척하여 망막, 상기 Permeabilize 하시려면 해동 후.
  5. PBS 2 % 트리톤 X-100, 2 % 정상 당나귀 혈청을 함유하는 용액으로 0.5 μg의 / - 0.3로 Brn3a 항체 희석. 부드럽게 4 ° C에서 O / N을 흔들어 Brn3a 차 항체 용액에 망막을 품어. 망막은 완전히 항상 액의 150 ~ 200 μL에 몰두해야한다.
  6. PBS 2 % 트리톤 X-100을 함유하는 용액으로 2 μg의 /에 당나귀 항 - 염소 IgG를 이차 항체를 희석하고 온화한 진탕하에 실온에서 2 시간 동안이 용액에 망막 배양한다. 망막 완전히 시점의 항체 용액에 침지한다. 광표백되지 않도록 나머지 단계를 알루미늄 호일로 배양 플레이트를 커버.
  7. 조직은 POS로 평평하게 놓여 있도록 브러시를 사용하여 조심스럽게 슬라이드에 망막을 전송sible. 10 분 동안 공기 건조. 안티 - 페이드 장착 매체를 이용하여 마운트합니다.
  8. 형광 현미경으로 망막 평면 마운트를 검사합니다. 설명에 따라 망막 사분면 당 세 개의 비 중첩 영역에서 Brn3a 긍정적 인 망막 신경절 세포의 수를 정량화. (18)

시신경 교차 섹션에 RGC 축삭의 6 정량화

  1. 4.5 단계에서 시신경을 수집하고 2 시간 동안 2 %의 산화 오스뮴에 (OSO 4, MW 254.23 g / 몰)을 품어.
    주의 : 높은 독성으로 인해, 산화 오스뮴은 적절한 실험실 복장과​​ 흄 후드에서 처리되어야한다.
  2. 15 분마다 (50 %, 70 %, 90 %, 95 % 및 100 %), 에탄올의 농도를 증가시키는 침지하여 시신경 탈수.
  3. 다음의 레서피를 이용하여 에폭시 수지를 제조 : 15.72 mL를 매입 (812), 도데 세닐 무수 숙신산 6.45 ㎖, 7.83 ml의 메틸 나드 산 무수물, 0.45 mL의 DMP-30.
  4. 순차적으로 구성된 솔루션의 시신경을 배양0 : 1, 1 : 1, 0.75 : 0.25 내지 1 : 다음의 프로필렌 옥사이드로 에폭시 수지의 비율 (MW 58.08 g / mol)을 0. 시신경은 O / N 기간 RT 각 용액에 배양한다.
  5. 추가로 48 시간 동안 60 ℃에서 100 %, 에폭시 수지 (6.4 마지막 단계)에 매립 시신경 부화.
  6. 마이크로톰을 이용하여 반 얇은 시신경의 단면 (0.75 μm의)를 생성합니다.
  7. 1 % 톨루이딘 블루와 시신경의 단면을 얼룩.
  8. 설명 (19) 각 시신경 섹션의 다섯 겹치지 않는 영역에서 RGC 축삭을 정량화.

Representative Results

이 프로토콜에 설명 된 성인 쥐의 전방에 자기 마이크로 비즈의 주입은 안압의 강력하고 재현 상승의 결과. *** p <0.001, 1 주일 절차 후, IOP는 학생의 t -test (고혈압 눈 19, 10 ± 0.6 mmHg로 (평균 ± SEM), 반대편 눈의 평균 기준 IOP에서 ± 0.5 mmHg로 증가 N = 12, 표 1,도 2). IOP는 이후 안정화 최소 6 주 본 연구에서 조사 된 가장 긴 시간 포인트 20 mmHg에서의 평균 상승 남아 있었다. 수술 후 2, 3 및 6 주째 마이크로 비드 주입 눈의 평균 피크 IOP 25 mmHg로 하였다. 처리 된 마우스의 대부분은 따라서이 프로토콜은 마이크로 비드의 제 주입하지 않아도 지속적인 높은 IOP를 개발했다.

이 모델 RGC 손실의 시간 코스를 평가하기 RGC 소마이었다첫 번째 Brn3a하는 RGC 특정 마커 (17) 면역 염색에 의해 정량화. Brn3a 양성 세포의 수는 안압의 유도 후 1, 2, 3, 6 주에 장착 망막 평면에서 정량 하였다. 중요한 안압 상승이 빠르면 1과 주 마이크로 비드 주입 후 검출되었지만, RGC의 소마의 유의 한 감소는 절차 (그림 3)의 첫 2 주 이내에 관찰되지 않았다. 상당한 RGC 사망 (22 %)이, 그러나 (평균 2430 ± 67 망막 신경절 세포 / mm 2 ± SEM, N = 12) 삼주에 분명했다 6 주 (2,350 ± 74 망막 신경절 세포 / mm 2 N = 10) 포스트 취소 운영 마우스 (3141 ± 49 망막 신경절 세포 / mm 2, N = 23) (ANOVA, p <0.001)에서 그대로 제어 눈에 비해 안압 증의 유도.

RGC 축삭의 기능 장애 및 변성은 녹내장의 추기경 기능입​​니다. 따라서, 축삭 손실 마이크로 비드를 주사 한 후 3, 6 주에 관찰 하였다톨루이딘 블루 (그림 4)로 염색 시신경의 단면에서 RGC 축삭의 정량화. RGC 축삭의 상당한 손실 (25 %) 3- 주에 관찰되었다 (SEM 평균 ± 28401 ± 702 축삭 / 신경, N = 5) 6 주 (29,426 ± 948 축삭 / 신경 N = 6) 마이크로 비드 주입 후 (39,467 ± 137 축삭 / 신경 N = 4) 미 작동 눈에서 그대로 시신경 비교 (ANOVA, p <0.001). 종합적으로,이 데이터는 마우스 전방에 자기 마이크로 비드의 주입 재현에 이르게하고 RGC의 소마와 축삭 변성을 초래 안압 상승을 지속 것을 보여줍니다.

OHT 수술 후 시간 IOP (mmHg로) ± SEM을 의미 피크 IOP (mmHg로)
반대측 녹내장 디fference 반대측 녹내장
일주 (12) 10 ± 0.4 19 ± 0.5 9 ± 0.6 12 ± 0.4 22 ± 0.6
이주 (13) 11 ± 0.5 20 ± 0.8 9 ± 0.5 12 ± 0.9 25 ± 0.7
3 주 (10) 11 ± 0.8 20 ± 0.7 10 ± 0.9 13 ± 0.2 25 ± 0.9
육주 (12) 12 ± 0.5 20 ± 0.6 9 ± 0.7 13 ± 0.5 24 ± 0.6

쥐 자성 마이크로 비드 Occlusi에서 안구 내 압력 표 1. 상승모델. 웨이크 암컷 C57 BL / 6 마우스는 IOP는 보정 리바운드 안압계를 이용하여 측정 하였다. 운영의 눈은 시술 후 적어도 6 주 동안 상승 남아 일주일 후 수술에서 검출 안압의 증가를 표시.

그림 1
녹내장의 쥐 자성 마이크로 비드 폐색 모델에 포함 된 단계의 그림 1. 워크 플로우.시 이전에 수행 된 모든 절차를 단계별 개요 및 수술 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
쥐 자성 마이크로 비드 폐색 모델에서 안구 내 압력 그림 2. 증가. 깨어에서암컷 C57 BL / 6 마​​우스는 IOP는 보정 리바운드 안압계를 이용하여 측정 하였다. 마이크로 비드 주입 눈의 안압이 크게 일주일 후 수술 (ANOVA, p <0.001)에서 상승했다. 안압은 원주 크게 이상 육주 (ANOVA, p <0.001)에 대해 주입 마우스의 반대편 눈에 상대적으로 상승 남아 있었다. (본래 : N = 12, 일주 : N = 12 : 2 주 N = 13 3 주 : N = 10 6 주 : N = 12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
쥐 자성 마이크로 비드 폐색 모델입니다. 망막 신경절 세포의 그림 3. 망막 신경절 세포의 죽음을 유도하기 위해 마이크로 비드 주입 후 3 6 주에서 그대로 제어 망막 (A) 및 녹내장 망막에 ​​Brn3a를 사용하여 평면 탑재 망막의 면역 염색에 의해 가시화되었다고 안압 증 (OHT) (B, C). 스케일 바 : 20 μm의. (D) 정량 분석 절차가 눈을 대조군에 비해 후 마이크로 비드 분사 3, 6 주에 상당한 RGC 소마 손실을 초래 함을 확인 하였다. 본래 비 녹내장 C57 / BL6 마우스의 RGC 소마의 농도를 기준 (흰색 바, 100 % 생존율)로 도시된다. 2 주 N = 6 : N = 6 3 주 : N = 12 6 주 : N = 10, ANOVA, *** p <을; 값은 SEM (본래 평균 ±로 표현 일주 N = 23 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
쥐 자성 마이크로 비드 폐색 모델입니다. RGC 축삭 그림 4. 축삭 변성은 톨루이딘 블루에서와 시신경 단면의 염색에 의해 가시화되었다마이크로 비드 주입 후 3, 6 주째 본래 제어부 (A) 및 녹내장 성 망막 안압 (OHT) (B, C)를 유도한다. 스케일 바 : 10 μm의. (D) 정량 분석 절차가 눈을 대조군에 비해 후 마이크로 비드 분사 3, 6 주에 상당한 RGC 축삭 손실을 초래 함을 확인 하였다. 본래 비 녹내장 C57 / BL6 마우스의 RGC 축삭의 농도를 기준 (흰색 바, 100 % 생존율)로 도시된다. 값은 SEM ± 평균으로 표현된다 (비 손상 : N = 4; 삼주 : N = 5 6 주 : N = 6, ANOVA는, *** p <0.001). 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼을 .

Discussion

여기에 제시된 비디오 기술은 효과적이고 재현성 마우스에서 안압 상승을 유도하는 자기 마이크로 비즈의 전방 내 주입을 수행하는 방법에 대한 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 추가 주사를 필요로 안구 고혈압 induction.Elevated IOP의 처음 3 주 이내에 검출 RGC의 소마와 축삭 손실을 촉진하지 않는 지속적인 안압 상승이 프로 시저의 결과는 인간의 녹내장 개발을위한 주요 위험 요인이다. 따라서, 이것은 광범위한 응용 가능성이있는 유용한 뮤린 안압 녹내장 의존 모델이다.

전방으로 마이크로 비드의 주입과 연관된 공통적 인 단점은 주사 바늘이 인출 될 때 종종 수성 유출 및 증가 된 변동성의 부분 폐쇄를 초래하는, 주사 부위를 통해 환류 비드에 관한 것이다. 이 문제를 해결하기 위해 몇 가지 중요한 변경이 구현되었다. 전나무 t하는 각면 경사 깨끗하고 날카로운 유리 미세 바늘의주의 준비는 마이크로 비드의 성공적인 주입을 위해 필수적이다. 제대로 준비 미세 바늘은 민감한 안구 표면에 압력의 최소한의 응용 프로그램과 각막의 제어 된 부드러운 침투 할 수 있습니다. 작은 각막 천공는 마이크로 비즈의 역류를 방지 할 수 있습니다. 또한, 미세한 미세 비 염증 관련 질환을 초래할 수있다 이러한 홍채 렌즈 등의 손상 주변 구조의 위험을 감소시킨다. 둘째, 동안 및 주입 후 전략 안구 영역에 소형 자석의 응용이 기술의 또 다른 중요한 측면이다. 주입하는 동안, 자석은 미세 바늘이 철회 될 때 마이크로 비드의 전방 방지 환류 자기 마이크로 비드를 그리는 데 사용됩니다. 주입 후에, 자석은 방수 유출을 차단하는 홍채 각막 각도에 마이크로 비드를 지시하기 위해 사용된다.

텐트 "> 종종 마이크로 비드 폐색 모델에서 발생하는 또 다른 문제는, 반복되는 비드 주사는 종종 안압 상승 10, 11.이 함께 시간. 홍채 각막 각도에서 휴대용 자석의 조합을 빠지 마이크로 비드의 결과 일 수도 지속 달성하기 위해 필요한 것입니다 전술 한 마우스의 위치 설정 포스트 - 동작 가능 크게 결과를 향상시킨다. 유연성 긴 수술 후 회복 기간 과정 동안 헤드를 이동하고 필요할 수 있도록 주 사용 마취제의 사용을 같이 선호된다. 게재의 조작 된 눈 수술 후 두 시간 동안 위쪽으로 향하도록 마우스는 홍채 각막 각도에서 마이크로 비드의 정착에 기여하고 전방에 다시 빠지의 위험을 감소시킨다.

주입 된 비드의 개수가 상대적으로 일관성이 있음을 보장하는 것은 동물 간 변동을 최소화하는 또 다른 중요한 단계이다. 마이크로 비드는 B에 정착 때문에ottom 튜브, 그것을 완전히 마이크로 비드 용액을 균질화하고 적시에 미세 바늘에 적절한 양을 인출 할 필요가있다. 전방에 적은 구슬의 주입 불량이나 변수 안압 상승을 초래할 가능성이 수성 유머 배수 구조물의 완전 차단, 될 수 있습니다. 마이크로 비드 분사의 궁극적 인 목적은 안압을 상승시킬 수 있지만 깨어 마우스에서 안압 측정이 연구 (~ 25 mmHg로)에보고 된 피크 값보다 높은 경우 참고로,주의를 기울여야합니다. 매우 높은 안압 허혈성 손상의 위험을 증가시키고, 또한 동물에게 통증을 야기 할 수있다. IOP의 높이가 수술의 성공 여부를 평가하기 위해 여러 요인 중 하나로서 간주되어야한다. 이와 같이, 절차의 결과는 안압 상승, RGC의 소마의 죽음과 축삭 손실 등 여러 가지 매개 변수를 기반으로 계측한다.

여기에 설명 된 프로토콜은 대부분의 마이크로 비드 성공적인 결과이지만LY 각도에 정착,이 모델의 잠재적 인 제한은 전방에 떠있는 상태로 그 구슬이 각막을 통해 실시간 망막 영상뿐만 아니라 빛의 효과적인 통과를 요구하는 전기 생리 또는 행동 분석을 방해 할 수 있다는 것입니다. 이 마이크로 비드 폐색 모델을 사용하면 안압 상승 이후 RGC 변성의 정도가 운영하는 마우스 [4]의 연령과 유전 적 배경에 따라 변화한다는 것입니다 때 또 다른 중요한 측면은 고려. 따라서, 안압 상승의 정도와 RGC 변성의 타임 라인은 각각의 특정 유전자 변형 마우스 라인 및 / 또는 연령 범위를 결정해야합니다.

이 모델의 특징은 마이크로 비드 주입, 상당한 RGC 죽음 후 첫 삼주 동안 RGC 죽음의 점진적 손실 상승 된 안압 결과는 시술 후 삼주에서 검출된다는 점이다. 따라서,이 모델이 D에서 발생 초기 및 / 또는 미묘한 변화의 시험을 가능하게isease는 이전 RGC의 소마와 축삭 손실을 명백한합니다. RGC 사멸의 상당한 증가는 안압의 유도 후 3 6 주 사이에서 관찰되지 않았다. 성공에도 불구하고 3 6 주 사이에 25 %이 시점에서 안압 상승을 지속 - 사실, RGC의 소마와 축삭 손실 ~ 22에서 안정적으로 유지. 지속적인 안압의 이상 기간은 C57BL 다른 마우스 균주에 비해 RGC 손상에 대한 저항력 것으로 보인다 / 6 마우스를 발생하는 추가 RGC 손실을 요구할 수있다. (5) 추가 수정 사항을 여기에 제시된 프로토콜, 구슬 크기의 조정을 포함하여 추가 주사는 나중에 지점에서 RGC 손실을 연구해야 할 수도 있습니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 인간의 녹내장의 발병 초기 ​​진행에 관련된 겸손 RGC의 신경 퇴행과 상관 관계 초기 병태 생리 학적 변화에 초점을 맞춘 연구에 이상적이다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1,000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 ml Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 ml PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25

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References

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