A磁条微珠缺血模型,以诱导小鼠高眼压,青光眼相关

* These authors contributed equally
Medicine
 

Summary

在这里,我们提出了一个协议,以诱发高眼压在小鼠眼睛中青光眼观察到,导致视网膜神经节细胞的损失。磁微珠被注入到前房并使用磁体来阻止房水的流出吸引到虹膜角膜角。

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Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).

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Abstract

使用青光眼的啮齿动物模型一直必须了解背后这种多因素的神经变性疾病的病理生理学的分子机制。与许多转基因小鼠系的出现,有在高眼压诱导小鼠模型越来越大的兴趣。这里,我们提出基于使用改性微针具有刻面斜角喷射磁微珠的进入眼睛的前房青光眼的闭塞模型。磁微珠被吸引到使用手持磁体阻止房水从前房排水的虹膜角膜角。这种破坏在眼内压,这随后导致视网膜神经节细胞的损失,如在人类青光眼患者中观察到的稳定的标高含水动力学的结果。在这个手稿提出的微珠闭塞模型比较简单青光眼等可诱导模型,也高度有效和可重复性。重要的是,这里提出的修改最小化,往往发生在闭塞模型的常见问题。首先,使用一个斜面玻璃微针的防止微珠的回流,并确保在注射过程中发生的角膜损伤最小,从而减少损伤相关的影响。第二,利用磁微珠的确保吸引大多数珠粒的虹膜角膜角,从而有效地减少了珠漂浮在前房避免与其他结构的接触( 例如 ,虹膜,透镜)的数目的能力。最后,使用手持磁体允许灵活性处理小鼠眼有效地引导磁微珠并确保有从眼睛微珠的小回流时该微针被撤回时。总之,这里提出的微珠闭塞小鼠模型是一个功能强大的调查工具,研究glau的发作和进展过程中发生的神经变性昏迷。

Introduction

青光眼是一种渐进的和不可逆的致盲条件下,将在2020年1影响全世界估计有8000万人。在青光眼患者,视力丧失是由视网膜神经节细胞(RGC),从传递视觉信息的输出神经元选择性死亡引起的视网膜到大脑。青光眼是年龄相关的神经变性疾病的许多危险因素,其中最常见的是升高的眼内压(IOP)。事实上,眼压是唯一可改变的危险因素和青光眼的治疗目前只专注于管理眼压。然而,多个基因,细胞,和环境因素影响这种疾病的发作和进展。因此,了解,最终有助于神经元死亡的各种机制是开发用于治疗青光眼的有效治疗是至关重要的。

青光眼的动物模型是研究疾病的病理生理学,并确定和试验的基本要求有前途的治疗。转基因小鼠线,包括条件性敲除品系小鼠携带的基因编码荧光示踪剂的日益普及,推动了可诱导小鼠模型青光眼的需要。青光眼的几个啮齿动物模型已经发展了很多年(以2,3综述)。在许多这样的车型,青光眼是通过破坏房水动力学,导致眼压的升高所致。闭塞模型,其中微珠或其他物质被注入到眼睛的前房阻止水排水,近年来部分由于其相对容易增加眼压4-14得到普及。

青光眼的微珠闭塞模型,首次在灵长类动物中12进行,兔8,和老鼠4,9,11,最近被改编为小鼠5,6,10使用。在这些研究中,聚苯乙烯微珠的房内注射,单独使用或以用粘弹性材料组合,导致IOP升高导致随后的RGC死亡6,10。然而,当针从虹膜角膜角微珠的眼睛和撞出抽出回流是在操作过程中出现的常见问题。为了尽量减少这些缺点,磁铁已用于吸引磁微珠到眼睛4,9的虹膜角膜角。

此处所描述的协议是基于以前的研究9,10使用磁微珠和手持磁体适于鼠标眼( 图1)的改性方法。一些重要的修改已经在我们的协议被引入,以确保在小鼠有效和可重复的眼压升高。首先,微珠的注入用精心准备的玻璃微针与刻面斜角完成。微针的所得光滑的表面以及其锋利的尖端可确保最小的损害是造成它刺穿角膜。使用这种玻璃微针还导致增加的控制时,微型针尖端进入前房,从而减少有害附近结构的风险,如虹膜和晶状体。另外,微小的注射病变促进角膜自我修复,并减少不必要的损伤相关的影响。

第二,磁微珠的注射和使用手持磁体允许精确控制,以吸引小珠的虹膜角膜角的小鼠眼。磁微珠是4.5微米的直径被使用,因为这种微珠大小没有堵塞制备微针开口和重要的是,一旦注射,这些微珠有效阻止房水的排出。这种方法不仅降低了注射微珠回流下,也确保了微珠的最大数量的目标区域累积到有效阻挡房水引流。 Furthermore,这种策略也减少了珠漂浮在前房避免与其他结构,如虹膜​​和晶状体,并后房防止通道接触的数目。总的来说,这些修改确保微珠注入手术相对容易和在导致高眼压在小鼠中高度重现,有效和持久的感应及时执行。

Protocol

下面的程序是符合加拿大议会关于动物饲养对实验动物的使用以及在视觉与眼科(ARVO)眼科使用动物及视觉研究从研究协会声明的指导方针进行。

1.微针的制备前房内注射

  1. 带拉出器,生成从硼硅玻璃毛细管的微针
  2. 在显微镜下,用锋利的刀片,以精心打造的微针尖端的开口。所得开口应具有约190微米和70微米的长轴和短轴直径为椭圆形,分别。测量所制备的微针开口由第一获取图像与显微镜利用图像分析软件,随后通过定量下置于一个标尺的面积。
  3. 在微量斜边系统,将微针在20 degre相对角度E要斜切板,使微针开口接触到板。斜角为大约10分钟,直到边缘是平的,光滑的。加蒸馏水几滴在过程中提供帮助。
  4. 旋转微针斜角围绕开口,直到提示是尖锐的两条边。
  5. 清洁所有碎片和水使用喷雾剂掸子微针末端开口。
  6. 仔细检查在显微镜下完成的微针。骨折丢弃微针在手术过程中,以尽量减少微针断裂的风险。
  7. 用乙醇漂洗,然后用无菌平衡盐溶液(BSS)消毒微针。

2.磁性微珠溶液的制备

注意:在此研究中使用的磁微珠涂覆有环氧基。为了防止任何不利的影响,如珠粒结块和不需要的分子间的相互作用,这些环氧基必须首先从微珠与注射手术操作前除去。

  1. 从磁珠环氧基团的去除
    1. 制备的0.02M氢氧化钠(NaOH,MW39.997克/摩尔)在10倍的Tris缓冲液中的溶液(MW121.14克/摩尔)。
    2. 轻轻涡旋磁微珠溶液的股票(直径4.5微米,4×10 8珠/ ml)的,直到珠粒均匀悬浮在溶液中。
    3. 迅速吸取1毫升磁珠溶液到50ml的0.02M NaOH的10×Tris缓冲液。
    4. 旋转在RT 24小时,从珠除去环氧基。
    5. 用磁铁固定到管的底部收集珠。水平定向管,以确保所有的珠被吸引到磁铁。旋转在室温额外的4小时。
    6. 随着微管,小心地取出上清而不干扰珠沉淀。
    7. 轻轻涡旋沉淀在50毫升10X的TRIS缓冲区,直到珠以及暂停。
    8. 重复步骤2.1.4至2.1.6。
  2. 浓度和在无菌平衡盐溶液磁微珠的重悬

注意:有必要集中在无菌平衡盐溶液(BSS)磁珠溶液的库存达到1.6×10 6珠/微升的最终浓度,使2.4×10 6珠可在注射入前房1.5微升,这是适合于小鼠眼的最终体积。

  1. 通过2分钟轻轻涡旋洗珠在5ml超纯水实验室级水。
  2. 通过吸引他们与磁铁的管底部收集珠。
  3. 随着微管,小心地取出水,无干扰的珠沉淀。
  4. 重复步骤2.2.1至2.2.3三次。
  5. 在层流罩,洗珠用500μlBSS由pipettin克上下。执行在层流罩无菌条件下,本节剩下的步骤。
  6. 通过吸引他们与磁铁的管底部收集珠。
  7. 随着微管,小心地取出BSS不干扰珠子的沉淀。
  8. 重复步骤2.2.5至2.2.7三次。
  9. 通过上,在250微升BSS的上下吹吸珠悬浮。
  10. 确保该珠子溶液是良好均化。然后,迅速分装25微升悬浮液进入无菌0.5毫升管。股票珠溶液的最终浓度为1.6×10 6珠/微升。
  11. 保存在4℃。

3.高眼压的诱导

注:第3节是两个人的操作。在一个特定的操作是由一个特定的人执行的情况下,适当的人被识别。一般情况下,1人负责处理在显微镜下鼠标,而人2为responsible用于操纵微量注射泵。手术过程的总持续时间应少于10分钟(步骤3.9至3.17)。

  1. 在成年C57BL / 6小鼠进行的程序。家鼠与获得食物和水随意的标准环境。在本文中,使用3和4.5个月的年龄之间的雌性C57BL / 6小鼠。然而,该协议可以适应男性和不同年龄的小鼠,以及其它小鼠品系,包括转基因和基因敲除小鼠。
  2. 使用校准反弹眼压计测量麻醉和微珠注射前清醒小鼠基线眼压。应用角膜盐酸丙美卡因一滴。
    1. 按住两耳之间的皮肤轻轻地抑制鼠标。放置在台式鼠标,使得动物的舒适和眼睛是可访问的。持张力计垂直于角膜表面,并采取至少三组连续10次读数每眼,得到眼压平均水平。眼压清醒小鼠的测量最好绕过IOP麻醉相关的影响。可替代地,眼压可以在anesthetised小鼠步骤3.4之后测量。
  3. 制备的20毫克/毫升氯胺酮,2毫克/毫升赛拉嗪,和0.4毫克/毫升乙酰丙嗪组成的库存鼠标鸡尾酒麻醉混合物。
  4. 由鸡尾酒混合物(1微升/ g体重的)的腹腔内给药诱发小鼠麻醉。利用可注射的麻醉剂鸡尾酒优于气体麻醉剂( 例如,异氟烷),因为它允许灵活处理鼠标头时作为动物是未连接到吸入面罩。此外,可注射的麻醉剂需要较长的恢复期确保微珠在虹膜角膜角沉降而不撞出回进入前房。
  5. 辖0.05毫克每公斤体重丁丙诺啡皮下公斤。
  6. 治疗眼睛有托EYË下降诱发瞳孔扩大。由于鼠前房的小尺寸,瞳孔必须散瞳在注射过程中很容易地显现微针的定位和进步。
  7. 在对侧眼(未操作)适用外用药膏,以避免在操作过程中的角膜的干燥。
  8. 附加一个干净的微针的微量注射泵的喷射组件。每次操作后,更换微针,避免交叉污染的动物。
  9. 人1:anesthetised鼠标传送到操作平台。在显微镜下,确保瞳孔充分散瞳和眼部肌肉放松,这样就没有眼球运动。没有眼睛运动的注射过程中确保稳定。轻轻擦拭使用吸水擦拭眼周托吡卡胺滴眼液。
  10. 人2:通过上下吹打混匀磁微珠溶液。
  11. 使用微量注射泵,立即加载MICRoneedle 1.5微升均质磁微珠溶液(2.4×10 6珠)的(在第1制备)。确保气泡在微针的尖端不存在。微针被加载后,开展尽快步骤3.12 3.13使磁性微珠溶液保持在均匀的悬浮液。
  12. 在45°角的装微针,前方相对放置在角膜缘定位。人1:支持使用塑料镊子的眼睛。确保微针和塑料镊子之间的角度是大约90°。
  13. 人2:随着装微针,使微针的尖端进入前房轻轻穿刺角膜。确保装入微针保持在相对于45°角的角膜缘穿刺期间。避免镜头或虹膜任何接触。确保微针不进入后房。人1:继续支持眼睛使用塑料镊子。
  14. 人1:无移动鼠标头,放置磁铁眼睛旁边,相对的微针尖端,以吸引磁珠进入前房,并尽量减少与角膜的内表面的珠接触。人2:使用微量注射泵,注射1.5微升磁珠溶液进入前房。微珠溶液注入历时15至30秒的。人1:继续注射的整个持续时间期间保持所述磁体相对的微针尖端。
  15. 人2:一旦珠的全部体积已经注入,慢慢撤出从眼睛的微针。人1:为了避免微珠回流,继续保持旁边的眼磁铁另外30至60秒,以吸引朝向前房磁珠。
  16. 人1:使用磁铁,吸引珠的虹膜角膜角。确保珠形成一个均匀分布的环围绕前房的周长。在此步骤中,避免吸引小珠的角膜,因为他们必须坚持在接触角膜的内表面上的倾向。
  17. 治疗所操作的眼用抗生素滴眼剂以减少感染的风险。
  18. 让鼠标在隔热垫恢复,直到完全清醒(〜3至4小时)。将鼠标,使得操作眼朝上。这种定位将防止注入的珠粒积累由引力角膜的内表面上。此外,该位置将减少感染的操作眼将不会与任何被褥和/或可以存在于所述笼的其它材料接触的可能性。在动物遇险显示任何征兆的情况下,需要额外的管理剂量丁丙诺啡。
  19. 允许小鼠从程序取眼压测量之前恢复至少2天。在3.2中所述测量眼压。莫尼器眼压至少每周一次或更频繁,如需要的话,并在一天的同一时间,以减少昼夜相关的波动。
  20. 眼压测量,使用对侧眼从操作鼠标作为内部对照。另外,使用来自完好,无操作或假手术小鼠为幼稚控制测量。

4.视网膜评估神经节细胞索玛和轴突生存

  1. 灌注通过的0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)然后立即冰冷的4%多聚甲醛(PFA)心脏内注射进行眼压的小鼠。
  2. 灌注完好,非手术小鼠为4.1,并且使用它们作为未受伤的控制。不推荐使用从手术小鼠对侧眼睛,因为受伤后的变化对侧眼睛已经报15,16,可以混淆数据解释,以评估RGC存活。另外,使用假手术的眼睛注射10.5微升的BSS作为对照。
  3. 使用microscissors,精心裁剪结缔组织眼部周围,将其从眼窝隔离。通过在视神经乳头的水平切割其分离从眼视神经。
  4. 使用地下30针,使一个孔中的角膜,以允许固定剂溶液到眼睛中的渗透。将眼睛在4%PFA,在4℃孵育1小时额外的固定。
  5. 放置视神经在含有2%的PFA和在0.1M二甲胂酸钠2.5%戊二醛溶液(MW 214克/摩尔)和孵育O / N,在4℃再固定。

5. RGC索玛密度对量化平置式视网膜

注意 :以下过程是由纳达尔,尼古拉斯[17]的协议适配,并概述使用对脑特异性同源盒/ POU域蛋白3A(Brn3a)对视网膜平板支架的抗体视网膜神经节细胞的量化。替代甲基用于标记的RGC ODS也可以使用包括与针对具有多个剪接(RBPMS)或逆行标记用荧光金或的DiI RNA结合蛋白的抗体免疫组织化学。

  1. 在解剖显微镜下,用直至角膜分离容易制作切口沿着整个角膜缘移除眼睛的前部。取下角膜和晶状体。通过使沿锯齿缘和视神经削减仔细分离从眼睛的视网膜上。
  2. 通过对视神经清楚地界定这四个象限的视网膜对视网膜的边缘使四个小切口等距准备视网膜平山。用小刷子,轻轻地从视网膜删除任何剩余的玻璃体。尽可能去除尽可能多的玻璃体是获得清洁力强的免疫组织化学信号的关键。
  3. 仔细视网膜传送到含有0.5%的Triton X-100的PBS 48孔平底培养板中,以使视网膜是自由浮动。确保神经节细胞层朝上。
  4. 放置在-70℃下将培养板15分钟。在PBS中洗涤解冻视网膜,进一步通透两次在新鲜的2%的Triton X-100之后。
  5. 稀释Brn3a抗体0.3 - 0.5微克/毫升含2%的Triton X-100和2%正常驴血清的PBS。通过在4℃下轻轻摇动O / N孵育在Brn3a初级抗体溶液中的视网膜。视网膜应在任何时候都充分浸渍在150至200微升的溶液。
  6. 稀释的驴抗山羊IgG二级抗体为2微克/毫升含2%的Triton X-100的PBS孵育视网膜在该溶液中2小时在RT轻轻摇动。视网膜应充分浸渍于在所有时间该抗体溶液。用铝箔覆盖的其余步骤,以防止光漂白的培养板。
  7. 用刷子,视网膜仔细转移到幻灯片,使得组织位于平如POSsible。空气干燥10分钟。安装使用防褪色的安装介质。
  8. 检查在荧光显微镜下视网膜平板坐骑。如所述量化每视网膜象限三个非重叠区域Brn3a阳性RGC的数目。18

6.研资局轴突的量化对视神经横断面

  1. 收集来自步骤4.5视神经和在2%四氧化锇2小时孵育(OSO 4,MW254.23克/摩尔)。
    注意:由于其高毒性,四氧化锇应与合适的实验室装在通风橱处理。
  2. 通过在每个15分钟增加的乙醇浓度(50%,70%,90%,95%和100%),浸渍脱水视神经。
  3. 使用下列配方制备的环氧树脂:15.72毫升嵌入-812,6.45毫升十二碳烯基琥珀酸酐,7.83毫升纳迪克甲基酸酐,0.45毫升DMP-30。
  4. 依次在孵化解决方案组成的视神经0:1,1:1,0.75:0.25和1:环氧树脂的下列比率环氧丙烷(分子量58.08克/摩尔)的0。视神经在RT每个解决方案为O / N期培养。
  5. 孵育嵌入在60℃下100%环氧树脂(从6.4最后步骤)另外48小时视神经。
  6. 使用切片机生成半薄视神经截面(0.75微米)。
  7. 染色用1%甲苯胺蓝视神经横截面。
  8. 量化RGC轴突在每个视神经节描述19五个非重叠区域。

Representative Results

磁微珠的注入在该协议描述成年小鼠的前房导致眼压的一个强大的和可再现的高程。一个星期后的程序,眼压从10±0.6毫米汞柱(平均值±SEM),对侧眼的平均眼压基线高血压眼睛增加,19±0.5毫米汞柱(学生t检验; *** P <0.001, N = 12, 表1,图2)。眼压此后稳定,并在为至少6周,在本研究检查了最长的时间点上的平均为20毫米汞柱的仍然升高。平均峰值眼压微珠注入眼睛2,3和6周手术后为25毫米汞柱。绝大多数治疗的小鼠的发展持续高眼压,因此该协议不需要微珠第二次注射。

为了评估该模型RGC损失的时间过程,RGC躯体均首先通过与Brn3a,特定RGC标记物17免疫染色定量。 Brn3a阳性细胞的数目上的平面安装的视网膜的眼内高压诱导后在1,2,3和6周定量。虽然微珠注射后早在第1周时检测到显著IOP升高,是在第2周的程序( 图3)的内观察到RGC胞体的无显著损失。实质性RGC死亡(22%),然而,在第3周明显(2,430±67的RGC / mm 2时,平均±SEM,N = 12)和6周(2350±74的RGC / mm 2中,n = 10)后感应的高眼压症,与从非手术小鼠(3,141±49的RGC / mm 2中,n = 23)(ANOVA,p <0.001)完整对照眼。

研资局轴突功能障碍和变性是青光眼的一个重要特征。因此,轴突损失在3和6周微珠注射后观察在用甲苯胺蓝( 图4)染色视神经截面RGC轴突的定量。 3周观察RGC轴突的大幅亏损(25%)(28401±702轴突/神经,平均值±SEM,N = 5)和6周(29426±948轴突/神经,N = 6)微球注射后与从非手术的眼睛完好视神经(39,467±137轴突/神经,N = 4)(ANOVA,p <0.001)。总的来说,这些数据表明,注射磁微珠的入小鼠前房导致可重复的和持续的高眼压,其导致RGC胞体和轴突变性。

OHT手术后时间 ñ 平均眼压(毫米汞柱)±SEM 峰值眼压(毫米汞柱)
对侧青光眼迪fference 对侧青光眼
1周 12 10±0.4 19±0.5 9±0.6 12±0.4 22±0.6
2周 13 11±0.5 20±0.8 9±0.5 12±0.9 25±0.7
3周 10 11±0.8 20±0.7 10±0.9 13±0.2 25±0.9
6周 12 12±0.5 20±0.6 9±0.7 13±0.5 24±0.6

表1.鼠磁微珠Occlusi眼压升高在模型。在清醒的女性C57 BL / 6小鼠,眼压使用校准反弹眼压计测量。操作眼睛显示1周手术后检测眼压增加,这一程序后至少六周仍然升高。

图1
图1.工作流青光眼的鼠磁微珠缺血模型涉及的步骤的。期间之前进行的所有过程一步一步的轮廓,并且在手术后。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.眼内压升高在小鼠磁微珠缺血模型,在清醒雌性C57 BL / 6小鼠,眼压使用校准反弹眼压计测定的。微珠注入眼睛的眼压1周后的外科手术(ANOVA,P <0.001)的显著升高。 IOPS的仍然显著为相对至少6周(ANOVA,P <0.001)提升到注入小鼠的对侧眼。 (完整:N = 12;第1周:N = 12,2周:N = 13,2周:N = 10 6周:N = 12)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.在小鼠磁微珠闭塞模型。RGC视网膜神经节细胞死亡通过在完整控制视网膜(A)和3周和6周青光眼视网膜使用Brn3a平面安装的视网膜免疫染色微珠注射后可视化以诱导高眼压症(OHT)(B,C)。比例尺:20μm左右。 (D)的定量分析证实微珠注入在3和6周导致显著RGC索玛损失相比,控制的眼睛后的程序。在完整的,非青光眼C57 / BL6小鼠的RGC体细胞的密度被示为参考(白色条,100%存活)。值表示为平均值±SEM(完整:N = 23;第1周:N = 6,2周:N = 6,3周:每组12 6周:每组10只,ANOVA,*** P < 0.001)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.轴突变性中的鼠磁微珠闭塞模型。RGC轴突由视神经截面染色用甲苯胺蓝在可视化微珠注射后的完整控制(A)和青光眼视网膜在3和6周,诱导高眼压症(OHT)(B,C)。比例尺:10μm以下。 (D)的定量分析证实微珠注入在3和6周导致显著RGC轴突损失相比,控制的眼睛后的程序。在完整的,非青光眼C57 / BL6小鼠的RGC轴突的密度被示为参考(白色条,100%存活)。值表示为平均值±SEM(完整:N = 4;3周:N = 5 6周:N = 6,方差分析,*** P <0.001)。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

这里介绍的视频技术提供关于如何执行磁珠的房内注射,有效和可重复诱发眼压升高小鼠详细的一步一步的指示。在持续眼压增加,不需要额外的注射和促进第3周高眼压induction.Elevated眼压内检测RGC胞体和轴突损失这个过程的结果是在人类发展青光眼的主要危险因素。因此,这是一个有价值的鼠眼压依赖性青光眼具有用于广泛的应用中潜在模式。

与微珠的注射有关进入前房的共同缺点涉及通过注射点对珠粒回流下当针被撤回,这经常导致在含水流出并增加变异仅部分阻塞。为了解决这个问题,一些重要的修改得到落实。杉杉 T,具有多面斜角干净,锋利的玻璃微针的精心准备是微珠的成功注入必不可少。一个正确编写微针能随压力最小的应用细腻的眼球表面的角膜受控流畅渗透。小角膜穿刺防止微球的回流。此外,细微针减少破坏性附近结构如虹膜和晶状体,这可能导致在非疾病相关的炎症的风险。其次,中,注射后手持磁铁战略眼部领域的应用是这项技术的另一个重要方面。在注射过程中,磁体用于当微针缩回到磁微珠绘制到微珠前房防止回流。注射后,磁体然后用于引导微珠的虹膜角膜角到方框房水外流。

帐篷“>在微珠闭塞模型中经常遇到的另一个问题是,重复珠注射常常有必要实现持续IOP升高10,11。这可能是微珠从虹膜角膜角撞出随时间。手持磁体的组合的结果,如上所述,和鼠标的定位手术后大大提高的结果。使用注射麻醉剂,这允许灵活地在操作过程中移动至头部和需要较长的手术后的恢复期,是有利的。的放置鼠标与操作眼朝上为外科手术后的几个小时有助于在虹膜角膜角的结算微珠和减小撞出回进入前房的风险。

确保注入小珠的数量是相对一致的是最小化的动物间变异另一个关键步骤。由于微珠定居在Bottom管,有必要充分均质化微珠溶液和撤回适当体积进入微针及时。少珠粒喷射进入前房可能导致房水排水结构的不完全堵塞,这可能导致较差的或可变的IOP升高。值得注意的是,虽然微珠注入的最终目的是提高眼压,应谨慎时从清醒小鼠眼压测量比在这项研究中(〜25毫米汞柱)报告峰值更高服用。极高的IOP增加缺血损伤的风险,并且还可能引起疼痛的动物。眼压的高度应被视为许多因素,以评估手术的成功之一。因此,该过程的结果应当基于若干参数,包括高眼压,RGC体躯死亡,轴突损失来衡量。

虽然这里所描述的协议,导致成功的最微珠LY沉降以角度,该模型的一个潜在的局限性是,那些仍然在前房漂珠可能与通过角膜活视网膜成像,以及需要的光的有效通道电或行为测定干扰。另一个重要的方面来考虑,当利用该微珠闭塞模型是高眼压和随后RGC变性的程度与所​​操作的鼠标[4]的年龄和遗传背景而变化。因此,就需要为每个特定的转基因小鼠品系和/或年龄范围被确定IOP升高的程度和RGC变性的时间轴。

这种模式的一个特点是微珠注射,并显著RGC死亡后的前三个星期在RGC死亡的逐渐丧失高眼压的结果是在手术后3周检测。因此,这种模式使的发生在该D早期和/或微妙的变化检查isease,之前公开的RGC胞体和轴突的损失。在RGC死亡一显著增加并不高眼压诱导后3和6周的观察。尽管成功3和6周之间25%的和持续的高眼压在这些时间点 - 事实上,RGC胞体和轴突损失在〜22保持稳定。可能需要持续的眼压持续时间较长的额外RGC损失C57BL发生/ 6小鼠,这似乎相比其他小鼠品系要到RGC的损害更耐。5其他修改,这里介绍的协议,其中包括珠大小的调整和额外的注射剂,可能需要以研究在稍后的时间点的RGC损失。因此,我们的协议是理想的集中在适度的RGC神经退行性这是有关发生和早期发展在人类青光眼早期相关的病理生理变化的研究。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1,000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 ml Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 ml PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25

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References

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