Ein Magnet Microbead Occlusion Modell Ocular Hypertension Abhängige Glaucoma in Mäusen zu induzieren

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Summary

Hier stellen wir ein Protokoll okulärer Hypertension im murinen Auge zu induzieren, die in dem Verlust von retinalen Ganglionzellen führt, wie bei Glaukom beobachtet. Magnetische Mikrokügelchen werden in die vordere Kammer injiziert und angezogen, um den Kammerwinkel unter Verwendung eines Magneten den Abfluss von Kammerwasser zu blockieren.

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Ito, Y. A., Belforte, N., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice. J. Vis. Exp. (109), e53731, doi:10.3791/53731 (2016).

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Abstract

Die Verwendung von Tiermodellen von Glaukom war wesentlich die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Pathophysiologie dieser multifaktoriellen neurodegenerative Erkrankung zugrunde liegen. Mit dem Aufkommen von zahlreichen transgene Mauslinien, gibt es ein zunehmendes Interesse an induzierbare murine Modelle von okulärer Hypertension. Hier präsentieren wir eine Okklusion Modell des Glaukoms basiert auf der Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die Vorderkammer des Auges eines modifizierten microneedle mit einem facettierten Fase verwenden. Die magnetischen Mikrokügelchen werden mit dem Kammerwinkel zogen ein Handmagneten mit der Drainage von Kammerwasser von der Vorderkammer zu blockieren. Diese Unterbrechung in wässrigen Dynamik führt zu einer stetigen Erhöhung des intraokularen Drucks, die zum Verlust von retinalen Ganglionzellen anschließend führt, wie in menschlichen Glaukompatienten beobachtet. Das Modell Mikrobead Okklusion in diesem Manuskript präsentiert einfach ist im Vergleich zu anderen induzierbare Modelle von Glaukom und auch hochwirksam und reproduzierbar. Wichtig ist, stellten die Änderungen hier häufig gestellte Fragen zu minimieren, die häufig in Okklusion Modelle entstehen. Erstens verhindert die Verwendung eines abgeschrägten Glases microneedle Rückfluss von Mikrokügelchen und stellt sicher, daß eine minimale Schädigung während der Injektion auf die Hornhaut auftritt, damit verletzungsbedingte Effekte zu reduzieren. Zweitens sorgt die Verwendung von magnetischen Mikrokügelchen , die Fähigkeit , die meisten Perlen an den Kammerwinkel zu gewinnen, effektiv die Anzahl der Perlen , schwimmend in der vorderen Kammer zu reduzieren mit anderen Strukturen die Vermeidung von Kontakt (z. B. Iris, Linse). Schließlich ermöglicht die Verwendung eines Handmagneten Flexibilität bei der kleinen Maus Augenbehandlung effizient die magnetischen Mikrokügelchen zu lenken und zu gewährleisten, dass es wenig Rückfluss der Mikrokügelchen aus dem Auge ist, wenn die Mikronadeln entnommen wird. Zusammenfassend stellte die Mikrobead Okklusion Mausmodell hier ist ein leistungsstarkes Ermittlungsinstrument zu neurodegenerative Veränderungen untersuchen, die während der Entstehung und Progression von glau auftretenKoma.

Introduction

Das Glaukom ist eine progressive und irreversible blendend Bedingung , dass bis zum Jahr 2020 1 schätzungsweise 80 Millionen Menschen weltweit auswirken wird. In Glaukompatienten, Verlust der Sehkraft durch den selektiven Tod von retinalen Ganglienzellen (RGC) verursacht wird, die Ausgangsneuronen , die visuelle Informationen aus dem Sende Netzhaut zum Gehirn. Das Glaukom ist eine altersbedingte neurodegenerative Erkrankung mit vielen Risikofaktoren, von denen die häufigste erhöhten Augeninnendruck (IOP). Tatsächlich ist IOP die einzige veränderbare Risikofaktor bei Glaukom und aktuellen Behandlungen ausschließlich auf die Verwaltung von Augeninnendruck. Jedoch mehrere genetische, zelluläre und Umweltfaktoren beeinflussen die Entstehung und den Verlauf dieser Krankheit. Daher die verschiedenen Mechanismen zu verstehen, die letztlich zu neuronalen Tod beitragen ist wichtig wirksame Behandlungen für Glaukom zu entwickeln.

Tiermodelle von Glaukom sind wesentliche Krankheit Pathophysiologie zu studieren und zu identifizieren und zu erprobenvielversprechende Therapeutika. Die zunehmende Verfügbarkeit von transgenen Mauslinien einschließlich bedingter knockout-Stämme und Mäusen, die genetisch kodierten fluoreszierenden Tracern hat die Notwendigkeit für induzierbare Glaukom murine Modelle angetrieben. Mehrere Nagetiermodellen von Glaukom wurden im Laufe der Jahre entwickelt ( zusammengefasst in 2,3). In vielen dieser Modelle ist Glaukom durch Zerstören wässrigem Humor Dynamik induziert, in der Erhöhung des IOP führt. Occlusion Modelle, in denen Mikrokugeln oder andere Substanzen in die vordere Augenkammer injiziert werden wässrige Drainage zu blockieren, haben an Popularität gewonnen in den letzten Jahren teilweise aufgrund ihrer relativ einfachen IOP 4-14 zu erhöhen.

Das Mikrobead Okklusionsmodell des Glaukoms, zuerst bei Primaten 12 durchgeführt, Kaninchen 8 und Ratten 4,9,11, wurde für den Einsatz in Mäusen 5,6,10 kürzlich angepasst. In diesen Studien, die intracameral Injektion von Polystyrol-Mikrokügelchen, die allein oder inKombination mit einem viskoelastischen Material, führte IOP Erhebung zum anschließenden RGC Tod 6,10 führt. Jedoch Reflux, wenn die Nadel aus dem Auge und Verdrängen von Mikrokugeln aus dem Kammerwinkel sind häufige Probleme entnommen wird, die während des Verfahrens entstehen. Um diese Nachteile zu minimieren, wurden Magnete verwendet , um die magnetischen Mikrokügelchen zu dem Kammerwinkel des Auges 4,9 zu gewinnen.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine modifizierte Prozedur basierend auf früheren Studien 9,10 magnetische Mikrobeads und einem Handmagneten zur Maus Auge (Abbildung 1) , die geeignet verwendet. Einige wichtige Änderungen wurden in unserem Protokoll zur Gewährleistung einer effektiven und reproduzierbaren IOP Anstieg bei Mäusen eingeführt. Zunächst wird die Injektion von Mikrokügelchen getan, um eine sorgfältig vorbereitete Glas microneedle mit einem facettierten Fase verwenden. Die resultierenden glatten Flächen der Mikronadel sowie deren geschärfte Spitze stellt sicher, daß eine minimale Schädigung istzugefügt, da sie die Hornhaut durchsticht. Die Verwendung dieses Glas microneedle ergibt auch eine erhöhte Kontrolle, wenn die Mikronadeln Spitze die vordere Kammer eintritt, wodurch das Risiko der Beschädigung der Nähe Strukturen wie die Iris reduziert und die Linse. Darüber hinaus erleichtert die winzige Injektions Läsion der Hornhaut Selbstreparatur und reduziert unerwünschte verletzungsbedingte Effekte.

Zweitens ist die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen und die Verwendung eines Handmagneten ermöglicht eine präzise Steuerung der Wülste an den Kammerwinkel im kleinen Maus Auge anziehen. Magnetische Mikrokügelchen, die 4,5 & mgr; m im Durchmesser sind verwendet wurden, weil diese Mikrobead Größe nicht vorbereitet microneedle Öffnung hat verstopfen und wichtig ist, einmal injiziert, diese Mikrokügelchen blockiert wirksam die Entwässerung von wässrigen Humor. Dieser Ansatz reduziert nicht nur Rückfluss der injizierten Mikrokügelchen, sondern gewährleistet auch, dass eine maximale Anzahl von Mikrokügelchen in dem Zielbereich ansammelt effektiv Humor aqueus Drainage zu blockieren. Furthermore Diese Strategie reduziert auch die Zahl der Raupen in der Vorderkammer mit anderen Strukturen, wie beispielsweise der Iris und der Linse und verhindert Durchgang zur hinteren Kammer Vermeidung von Kontakt schweben. Gemeinsam sorgen diese Modifikationen, dass die Mikrokügelchens Injektionsoperation relativ einfach und in einer angemessenen Weise in einer in hohem Maße reproduzierbar, wirksam resultierende durchgeführt wird, und nachhaltige Induktion von okulärer Hypertension bei Mäusen.

Protocol

Das folgende Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für die Verwendung von Versuchstieren und die Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und visuelle Forschung von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) durchgeführt.

1. Herstellung des Microneedle für Anterior intrakamerale Injection

  1. Mit einem Abzieher erzeugen, eine microneedle aus einem Borosilicatglas Kapillare
  2. Unter einem Mikroskop, mit einem scharfen Messer vorsichtig mit einer Öffnung an der Spitze der Mikronadeln zu schaffen. Die resultierende Öffnung sollte eine elliptische Form mit einer Haupt- und Nebenachsendurchmesser von etwa 190 & mgr; m und 70 & mgr; m bzw. haben. Man misst die Fläche der vorbereiteten microneedle Öffnung durch erste Erfassung von Bildern mit einem Lineal unter der durch Quantifizierung gefolgt Mikroskop gelegt unter Verwendung von Bildanalysesoftware.
  3. In der Mikropipette Fasen System, legen Sie die microneedle bei einer 20 degree Winkel in Bezug auf die Fasen Platte, so dass die Mikronadeln Öffnung der Platte berührt. Bevel für etwa 10 Minuten, bis die Kanten sind flach und glatt. Fügen Sie ein paar Tropfen destilliertes Wasser in den Prozess zu unterstützen.
  4. Drehen Sie den microneedle die beiden Ränder rund um die Öffnung zu Fase, bis die Spitze scharf ist.
  5. Reinigen Sie alle Schmutz und Wasser von der microneedle Spitzenöffnung mit Hilfe eines Aerosol-duster.
  6. Sorgfältig prüfen das fertige microneedle unter dem Mikroskop. Discard Mikronadeln mit Frakturen das Risiko des microneedle Brechen während der Operation zu minimieren.
  7. Sterilisieren Sie die Mikronadeln, indem man zuerst mit Ethanol gespült, dann mit steriler ausgewogener Salzlösung (BSS).

2. Herstellung der Lösung Magnetic Microbead

Anmerkung: Die magnetischen Mikrokügelchen in dieser Studie verwendet werden, mit Epoxidgruppen beschichtet. Um nachteilige Effekte, wie ein Verklumpen der Kügelchen und unerwünschte molekulare Wechselwirkungen zu verhindern, diese Epoxidgruppen müssenzunächst aus den Mikrokügelchen entfernt werden, bevor mit der Injektionsoperation fortgefahren wird.

  1. Das Entfernen von Epoxy - Gruppen von Magnetic Beads
    1. Eine Lösung aus 0,02 M Natriumhydroxid (NaOH, MW 39,997 g / mol) in Tris-Puffer 10x (MW 121,14 g / mol).
    2. Vorsichtig vortexen den Bestand an Magnet Mikrobead - Lösung (4,5 & mgr; m Durchmesser, 4 x 10 8 Perlen / ml) , bis die Kügelchen gleichmäßig in Lösung suspendiert sind.
    3. pipettieren schnell 1 ml Magnet-Bead-Lösung in 50 ml 0,02 M NaOH in 10x Tris-Puffer.
    4. Drehen Sie 24 Stunden lang bei RT die Epoxygruppen von den Kügelchen zu entfernen.
    5. Sammle die Perlen durch einen Magneten an der Unterseite des Rohres zu sichern. Orientieren des Rohrs horizontal, um sicherzustellen, dass alle Kügelchen mit dem Magneten angezogen werden. Drehen für weitere 4 h bei RT.
    6. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet von Perlen zu stören.
    7. verwirbeln vorsichtig das Pellet in 50 ml 10x Tris puffern, bis die Perlen gut aufgehängt sind.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.4 bis 2.1.6.
  2. Konzentration und Resuspension der magnetischen Microbeads in Sterile Balanced Salt Solution

Anmerkung: Es ist notwendig , den Bestand an Magnetkügelchen Lösung in sterile balancierter Salzlösung (BSS) zu konzentrieren , um eine Endkonzentration von 1,6 x 10 6 Kügelchen / & mgr; l zu erreichen , so daß 2,4 x 10 6 Perlen können in eine in die vordere Kammer injiziert werden , Endvolumen von 1,5 & mgr; l, das für die kleine Maus Auge geeignet ist.

  1. Waschen Sie die Perlen in 5 ml ultrareinem Wasser in Laborqualität durch sanftes Vortexen für 2 min.
  2. Sammle die Perlen durch sie an den Boden des Röhrchens mit einem Magneten anzieht.
  3. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig das Wasser, ohne das Pellet von Perlen zu stören.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.3 drei weitere Male.
  5. In einer Laminar-Flow-Haube, waschen Sie die Perlen mit 500 ul BSS durch pipetting nach oben und unten. Führen Sie die verbleibenden Schritte in diesem Abschnitt unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube.
  6. Sammle die Perlen durch sie an den Boden des Röhrchens mit einem Magneten anzieht.
  7. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig die BSS, ohne das Pellet von Perlen zu stören.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.5 bis 2.2.7 drei weitere Male.
  9. Resuspendieren durch die Perlen Pipettieren nach oben und unten in 250 ul BSS.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Beadlösung gut homogenisiert. Dann Aliquotierung schnell 25 ul der Suspension in sterile 0,5 ml-Röhrchen. Die endgültige Konzentration der Vorrats Beadlösung beträgt 1,6 x 10 6 Perlen / ul.
  11. Lagerung bei 4 ° C.

3. Induktion von Ocular Hypertension

Hinweis: Abschnitt 3 ist ein Zwei-Personen-Betrieb. In dem Fall, dass eine bestimmte Aktion ist von einer bestimmten Person durchgeführt werden, wird die entsprechende Person identifiziert. Im Allgemeinen Person 1 behandelt die Maus unter dem Mikroskop, während Person 2 ist responsible die Mikrodosierspritzenpumpe zur Manipulation. Die Gesamtdauer des chirurgischen Eingriffs sein sollte weniger als 10 min (Schritte von 3,9 bis 3,17).

  1. Führen Verfahren in adult C57BL / 6-Mäusen. Hausmäuse in einer Standardumgebung mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum. In diesem Papier, weibliche C57BL / 6-Mäuse zwischen 3 und 4,5 Monate alt verwenden. Allerdings kann dieses Protokoll zu Männern und Mäusen unterschiedlichen Alters sowie andere Mausstämme, einschließlich transgenen und Knockout-Mäusen angepasst werden.
  2. Messen Sie Baseline-IOP in wach Mäuse vor der Anästhesie und Mikrobead Injektion eines geeichten Rebound-Tonometer verwendet wird. Einen Tropfen Proparacainhydrochlorid auf der Hornhaut.
    1. Sie vorsichtig die Maus zurückhalten, indem Sie die Haut zwischen den Ohren zu halten. Platzieren Sie die Maus auf dem Tisch Modell, so dass das Tier angenehm ist und die Augen sind zugänglich. Halten Sie die Tonometer senkrecht zur Hornhautoberfläche und nehmen mindestens drei Sätze von zehn aufeinander folgenden Messungen pro Auge eine zu erhaltenIOP-Durchschnitt. Die Messung des IOP in wach Mäuse bevorzugt Anästhesie-bedingte Auswirkungen auf die IOP zu umgehen. Alternativ kann IOP nach dem Schritt 3.4 in anästhesierten Mäusen gemessen werden.
  3. Bereiten Sie einen Vorrat Maus Cocktail Anästhesie Mischung aus 20 mg / ml Ketamin, 2 mg / ml Xylazin und 0,4 mg / ml Acepromazin.
  4. Induzieren Anästhesie in der Maus durch intraperitoneale Verabreichung des Cocktailmischung (1 & mgr; l / g Körpergewicht). Die Verwendung eines Injektionsanästhesie Cocktail wird bevorzugt über Gas Anästhetika (zB Isofluran) , weil es Flexibilität erlaubt es, wenn die Mauskopf Handhabung , wenn das Tier nicht zu einer Inhalationsmaske verbunden ist. Darüber hinaus sorgt die längere Erholungsphase mit einem injizierbaren Betäubung erforderlich, dass Mikrokügelchen im Kammerwinkel absetzen, ohne in die vordere Kammer Verdrängen zurück.
  5. Verabreichen 0,05 mg pro kg Körpergewicht von Buprenorphin subkutan.
  6. Behandeln Sie das Auge mit einem Tropicamid eye fallen Pupillenerweiterung zu induzieren. Aufgrund der geringen Größe der murine Vorderkammer, muss der Schüler leicht erweitert werden, um die Positionierung und Vorschieben des microneedle während der Injektion zu visualisieren.
  7. Bewerben topische Salbe auf die gegenüberliegende Auge (un-betrieben) Trocknen der Hornhaut während des Verfahrens zu vermeiden.
  8. Bringen Sie einen sauberen microneedle an die Einpritzeinheit der Mikrodosierspritzenpumpe. Ersetzen Sie die microneedle nach jeder Operation Quer Tier Kontamination zu vermeiden.
  9. Person 1: Übertragen Sie die anästhesiert Maus auf die Betriebssystem-Plattform. Unter dem Mikroskop, sicherzustellen, dass die Pupille vollständig aufgeweitet wird, und dass die Augenmuskeln entspannt sind, so daß kein Augenbewegung ist. Das Fehlen von Augenbewegungen sorgt für Stabilität während der Injektion. die Tropicamid Augentropfen aus dem Auge mit absorbierenden Tupfer vorsichtig abwischen.
  10. Person 2: Mischen Sie die magnetische Mikrobead Lösung durch Pipettieren von oben und unten.
  11. die Mikrodosierspritzenpumpe verwenden, legen Sie sofort die MICRoneedle (hergestellt in Abschnitt 1) mit 1,5 ul der homogenisierten magnetischen Mikrobead - Lösung (2,4 x 10 6 Perlen). Stellen Sie sicher, dass Luftblasen an der Spitze der Mikronadel fehlen. Nachdem der microneedle geladen wird, führen Sie die Schritte 3,12-3,13 so schnell wie möglich, so dass die magnetische Mikrobead Lösung in einer homogenen Suspension bleibt.
  12. Positionieren Sie den geladenen microneedle in einem Winkel von 45 °, angeordnet nach vorne in Bezug auf den Limbus. Person 1: Unterstützung der Augen Kunststoff Pinzette. Stellen Sie sicher, dass der Winkel zwischen der Mikronadeln und die Kunststoff-Pinzette etwa 90 ° ist.
  13. Person 2: Mit dem microneedle geladen, sanft die Hornhaut durchstechen, so dass die Spitze der Mikronadeln in die Vorderkammer eintritt. Stellen Sie sicher, dass die geladene microneedle bei einer während der Einstich zum Limbus Winkel von 45 ° bleibt. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Linse oder der Iris. Stellen Sie sicher, dass die Mikronadeln nicht die hintere Kammer gelangt. Person 1: weiterhin das Auge zu unterstützenmit Kunststoff-Pinzette.
  14. Person 1: Ohne die Maus Kopf zu bewegen, platzieren Sie den Magneten neben dem Auge, gegenüber dem microneedle Spitze, die magnetischen Kügelchen in die vordere Kammer zu gewinnen und zu minimieren Kontakt der Kügelchen mit der inneren Oberfläche der Hornhaut. Person 2: Verwenden der Mikrodosierspritzenpumpe, injizieren 1,5 ul der magnetischen Kügelchen Lösung in die vordere Kammer. Die Mikrokügelchen-Lösung wird über einen Zeitraum von 15 bis 30 sec eingespritzt. Person 1: Fortsetzung der Magnet gegenüber der microneedle Spitze während der gesamten Dauer der Injektion zu halten.
  15. Person 2: Sobald das volle Volumen der Kugeln eingespritzt worden ist, zurückziehen langsam die Mikronadeln aus dem Auge. Person 1: Rückfluss der Mikrokügelchen zu vermeiden, weiterhin die magnetischen Kügelchen in Richtung der Vorderkammer zu gewinnen, indem der Magnet neben dem Auge für eine zusätzliche 30 bis 60 sec hält.
  16. Person 1: Mit Hilfe des Magneten, ziehen die Perlen an den Kammerwinkel. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen eine gleichmäßig verteilte Ring bildenum den Umfang der vorderen Kammer. Während dieses Schritts zu vermeiden Perlen auf die Hornhaut anzuziehen, da sie eine Tendenz, kleben an der Innenfläche der Hornhaut bei Kontakt haben.
  17. Behandeln Sie das operierte Auge mit einem Antibiotikum Augentropfen das Risiko einer Infektion zu minimieren.
  18. Lassen Sie die Maus auf einem Heizkissen zu erholen, bis sie vollständig wach (~ 3 bis 4 h). Platzieren Sie die Maus, so dass das operierte Auge nach oben zeigt. Diese Positionierung wird Anhäufung der injizierten beads an die innere Oberfläche der Hornhaut durch Schwerkraft verhindern. Darüber hinaus wird in dieser Position das Potenzial für eine Infektion verringern, wie das operierte Auge nicht in Kontakt mit jedem Betten sein und / oder anderen Materialien, die in dem Käfig vorhanden sein können. Im Falle, dass ein Tier Anzeichen von Not zeigt, zu verwalten zusätzliche Dosen von Buprenorphin nach Bedarf.
  19. Lassen Mäuse aus dem Verfahren für mindestens 2 Tage zu erholen, bevor IOP Messungen. Messen Sie IOP wie in 3.2 beschrieben. Monitor IOP mindestens einmal pro Woche oder öfter, je nach Bedarf, und zur gleichen Zeit des Tages circadian bedingten Schwankungen zu minimieren.
  20. Für IOP-Messungen, verwenden Sie das andere Auge aus der operierten Maus als interne Kontrolle. Alternativ dazu können Sie Messungen von intakten, nicht betätigten oder scheinoperierten Mäusen als naive Kontrollen.

4. Bewertung von retinaler Ganglionzellen Soma und Axon Überleben

  1. Perfundieren zu okulärer Hypertension durch intrakardiale Injektion von 0,1 M Phosphatpufferlösung unterworfen Mäuse (PBS) unmittelbar eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA), gefolgt von.
  2. Perfuse intakt, nicht operierten Mäuse wie in 4.1 und benutzen sie als unversehrten Kontrollen beschrieben. Die Verwendung von kontralateralen Augen aus betrieben Mäuse nicht zu beurteilen RGC Überleben zu empfehlen , da Änderungen in kontralateralen Augen nach der Verletzung wurden 15,16 berichtet worden und kann die Interpretation der Daten durcheinander bringen. Alternativ Verwendung scheinoperierten Augen injiziert 10,5 & mgr; l BSS als Kontrollen.
  3. Mit Mikroscheren, schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe um das Auge aus der Augenhöhle zu isolieren. Trennen Sie den Sehnerv aus dem Auge, indem sie es auf der Ebene des Sehnervenkopfes zu schneiden.
  4. Unter Verwendung einer 30 G-Nadel, ein Loch in der Cornea Eindringen der Fixierungslösung in das Auge zu ermöglichen. Legen Sie das Auge in 4% PFA und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C für eine zusätzliche Fixierung.
  5. Platzieren Sie den Sehnerv in einer Lösung, die 2% PFA und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat (MW: 214 g / mol) und Inkubation O / N bei 4 ° C für eine zusätzliche Fixierung.

5. Quantifizierung von RGC Soma Dichte auf Flach montiert Retinae

Hinweis: Das folgende Verfahren aus einem Protokoll , das von Nadal-Nicolas et al angepasst ist 17 ​​und beschreibt die Quantifizierung von RGCs einen Antikörper gegen das gehirnspezifische homeobox / POE - Domain Protein 3A (Brn3a) auf die retinale Flach Halterungen verwenden.. Alternative Meththoden zur Markierung von RGCs kann auch mit einem Antikörper gegen RNA-bindendes Protein mit mehreren Spleißen (RBPMS) oder retrograden Markierung mit Fluorogold oder DiI einschließlich Immunhistochemie verwendet werden.

  1. Unter einem Binokular, entfernen Sie den vorderen Teil des Auges durch einen Schnitt entlang der gesamten Limbus zu machen, bis die Hornhaut leicht ablöst. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. lösen Sie vorsichtig die Netzhaut aus dem Auge durch Schnitte entlang der Ora serrata und Sehnerv zu machen.
  2. Bereiten Sie eine retinale Flachmontage durch vier kleine Schnitte in gleichem Abstand von der Peripherie der Retina zum Sehnerv hin macht deutlich die vier Quadranten der Netzhaut zu beschreiben. Mit Hilfe einer kleinen Bürste, entfernen Sie alle verbleibenden glasigen von der Netzhaut. Die Entfernung von so viel Glaskörper wie möglich ist entscheidend für eine saubere und starke immunhistochemischen Signal zu erhalten.
  3. übertragen Sie vorsichtig die Netzhaut zu einer 48-Well-Flachboden-Kulturplatte mit 0,5% Triton X-100 in PBS, das so, dass die Netzhautfreischwebend. Stellen Sie sicher, dass die Ganglienzellschicht nach oben zeigt.
  4. Legen Sie die Kulturplatte bei -70 ° C für 15 min. Nach den Netzhäuten, weiter Permeabilisierung durch Waschen zweimal in frischem 2% Triton X-100 in PBS aufgetaut.
  5. Verdünne die Brn3a Antikörper 0,3-0,5 & mgr; g / ml mit PBS 2% Triton X-100 und 2% normalem Eselserum enthält. Inkubieren Sie die Netzhaut in der Brn3a primären Antikörperlösung durch O / N bei 4 ° C sanft schütteln. Die Retinas sollte jederzeit vollständig in 150 bis 200 ul Lösung eingetaucht werden.
  6. Verdünnen Sie die Esel-Anti-Ziegen-IgG-Sekundär-Antikörper zu 2 ug / ml mit PBS 2% Triton X-100 enthält, und Inkubation der Retina in dieser Lösung für 2 Stunden bei RT unter leichtem Schütteln. Die Netzhaut sollte jederzeit vollständig in der Antikörperlösung eingetaucht werden. Decken Sie die Kulturplatte mit Aluminiumfolie für die verbleibenden Schritte zu Photobleichens verhindern.
  7. Mit einem Pinsel, transferieren es vorsichtig auf die Netzhaut zu einer Folie, so dass das Gewebe so flach wie pos liegtwortlich. Luft trocknen lassen für 10 Minuten. Montieren Sie mit anti-fade Eindeckmediums.
  8. Überprüfen Sie die Netzhautflach Halterungen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Quantifizieren Sie die Anzahl der Brn3a positive RGCs in drei nicht überlappende Bereiche pro retinalen Quadranten , wie beschrieben. 18

6. Quantifizierung der RGC Axone auf Optic Nerve Querschnitte

  1. Sammeln Sie den Sehnerv aus Schritt 4.5 und Inkubation in 2% Osmiumtetroxid (OsO 4, MW 254,23 g / mol) für 2 Stunden.
    Achtung: Aufgrund seiner hohen Toxizität, Osmiumtetroxid sollte mit geeigneten Laborkleidung in einem Abzug gehandhabt werden.
  2. Entwässern den Sehnerv durch in steigenden Konzentrationen von Ethanol eingetaucht (50%, 70%, 90%, 95% und 100%) für 15 min jeweils.
  3. Bereiten Sie das Epoxidharz mit dem folgenden Rezept: 15,72 ml Embed-812, 6,45 ml Dodecenylbernsteinsäureanhydrid, 7,83 ml nadic Methyl Anhydrid, 0,45 ml DMP-30.
  4. den Sehnerv in Lösungen Sequenziell brüten zusammengesetztder folgenden Verhältnisse von Epoxidharz zu Propylenoxid (MW 58,08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0,75: 0,25 und 1: 0. Der Sehnerv ist in jeder Lösung bei RT für eine O / N Zeitraum inkubiert.
  5. Sehnerven für weitere 48 h in 100% Epoxidharz (letzter Schritt von 6,4) bei 60 ° C inkubieren eingebettet.
  6. Generieren Semidünn Sehnerv Querschnitte (0,75 & mgr; m) mit einem Mikrotom.
  7. Stain Sehnerv Querschnitte mit 1% Toluidinblau.
  8. Quantifizieren der RGC Axone in fünf nicht-überlappende Bereiche jedes Sehnerv Abschnitt beschrieben 19.

Representative Results

Die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die vordere Kammer der erwachsenen Mäuse in diesem Protokoll beschrieben ergab eine robuste und reproduzierbare Erhöhung des IOP. Eine Woche nach dem Verfahren, erhöhte IOP von 10 ± 0,6 mm Hg (Mittelwert ± SEM), die durchschnittliche IOP Baseline in kontralateralen Augen, auf 19 ± 0,5 mm Hg bei hypertensiven Augen (Student-t - Test; *** p <0,001, n = 12, Tabelle 1, Abbildung 2). IOP stabilisiert danach und blieb für mindestens 6 Wochen bei einem Durchschnitt von 20 mm Hg erhöht, die längste Zeit-Punkt in dieser Studie untersucht. Die durchschnittliche Spitzen IOP in Mikrokügelchens injizierten Augen bei 2, 3 und 6 Wochen nach der Operation betrug 25 mm Hg. Die überwiegende Mehrheit der behandelten Mäuse entwickelten anhaltend hohen IOP deshalb ist dieses Protokoll nicht eine zweite Injektion von Mikrokügelchen erfordern.

Um den Zeitverlauf der RGC Verlust in diesem Modell, RGC soma beurteilen warenzuerst durch Immunfärbung mit Brn3a, einem RGC-spezifischer Marker 17 quantifiziert. Die Anzahl der Brn3a-positiven Zellen wurde in 1 auf Flachmontierte Retinae quantifiziert, 2, 3 und 6 Wochen nach Induktion von okulärer Hypertension. Obwohl eine signifikante IOP Erhebung bereits nach 1 Woche Mikrobead Injektion kein signifikanter Verlust an RGC soma erkannt wurde , wurde in den ersten 2 Wochen nach dem Verfahren (Abbildung 3) beobachtet. Erhebliche RGC Tod (22%), war jedoch evident bei 3 Wochen (2.430 ± 67 RGCs / mm 2, Mittelwert ± SEM, n = 12) und 6 Wochen (2.350 ± 74 RGCs / mm 2, n = 10) post- Induktion von erhöhtem Augeninnendruck, im Vergleich zu intakten Kontroll Augen von un-betriebenen Mäuse (3141 ± 49 RGCs / mm 2, n = 23) (ANOVA, p <0,001).

Dysfunktion und Degeneration von RGC Axone ist ein Kardinal Merkmal des Glaukoms. Daher wurde axonalen Verlust nach 3 und 6 Wochen nach der Injektion untersucht, indem MikrokügelchensQuantifizierung von RGC Axone in Sehnerv Querschnitte gefärbt mit Toluidinblau (Abbildung 4). Ein wesentlicher Verlust von RGC Axone (25%) wurde nach 3 Wochen beobachtet (28.401 ± 702 Axone / Nerv, ± SEM bedeuten, n = 5) und 6 Wochen (29.426 ± 948 Axone / Nerv, n = 6) nach der Injektion von Mikrokügelchen im Vergleich zu intakten Sehnerven aus nicht operierten Augen (39.467 ± 137 Axone / Nerv, n = 4) (ANOVA, p <0,001). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Injektion von magnetischen Mikrokügelchen in die Maus Vorderkammer zu reproduzierbaren führt und anhalt IOP Erhebung, die in RGC Soma und Axon-Degeneration führt.

Zeit nach OHT Chirurgie N Die mittlere IOP (mmHg) ± SEM Peak IOP (mmHg)
Kontralaterale Glaukom Difference Kontralaterale Glaukom
1 Woche 12 10 ± 0,4 19 ± 0,5 9 ± 0,6 12 ± 0,4 22 ± 0,6
2 Wochen 13 11 ± 0,5 20 ± 0,8 9 ± 0,5 12 ± 0,9 25 ± 0,7
3 Wochen 10 11 ± 0,8 20 ± 0,7 10 ± 0,9 13 ± 0,2 25 ± 0,9
6 Wochen 12 12 ± 0,5 20 ± 0,6 9 ± 0,7 13 ± 0,5 24 ± 0,6

Tabelle 1. Höhe des intraokularen Drucks im Murine Magnetic Microbead Occlusiauf Modell. In wach weibliche C57 BL / 6 - Mäuse wurde IOP mit einem kalibrierten Rebound Tonometer gemessen. Operierten Augen zeigten eine Zunahme der IOP entdeckt nach einer Woche nach der Operation, die für mindestens sechs Wochen nach dem Eingriff erhöht blieb.

Abbildung 1
Abbildung 1. Workflow der einzelnen Schritte in der Murine Magnetic Microbead Occlusion Modell des Glaukoms. Schritt- für -Schritt Umriss aller vor durchgeführten Aktionen , während und nach der Operation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Erhöhung des intraokularen Drucks im Murine Magnetic Microbead Occlusion Modell. In wachweibliche C57 BL / 6-Mäuse wurde IOP gemessen mit einem kalibrierten Rebound Tonometer verwendet wird. Die IOPs von Mikrobead injizierten Augen wurden nach einer Woche nach der Operation (ANOVA, p <0,001) signifikant erhöht. Die IOPs blieb deutlich für mindestens 6 Wochen (ANOVA, p <0,001), bezogen auf das gegenüberliegende Auge von injizierten Mäusen erhöht. (Intact: n = 12; 1 Woche: n = 12, 2 Wochen: n = 13, 3 Wochen: n = 10, 6 Wochen: n = 12). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. retinaler Ganglionzellen Tod im murinen Magnetic Microbead Occlusion Modell. RGCs wurden durch Immunfärbung von flach montierten Retinae in intakten Kontrollnetzhäuten mit Brn3a sichtbar gemacht (A) und glaukomatösen Netzhäuten nach 3 und 6 Wochen nach der Injektion Mikrobead zu induzierenOkulare Hypertension (OHT) (B, C). Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. (D) Quantitative Analyse bestätigt , dass Mikrokügelchens Injektions führte zu einer signifikanten RGC soma Verlust bei 3 und 6 Wochen nach dem Eingriff im Vergleich Augen zu steuern. Die Dichte des RGC soma in intakter, nicht-glaukomatöse C57 / BL6-Mäusen wird als Referenz (weiße Balken, 100% Überlebensrate) gezeigt. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM (Intact ausgedrückt: n = 23; 1 Woche: n = 6, 2 Wochen: n = 6, 3 Wochen: n = 12, 6 Wochen: n = 10, ANOVA, *** p < 0,001). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. axonale Degeneration in den Murine Magnetic Microbead Occlusion Modell. RGC Axone wurden durch Färbung der Sehnerv Querschnitte mit Toluidinblau visualisiertintakte Kontrolle (A) und glaukomatösen Retinae nach 3 und 6 Wochen nach der Injektion Mikrokügelchens zu okulärer Hypertension (OHT) (B, C) ​​zu induzieren. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. (D) Quantitative Analyse bestätigt , dass Mikrokügelchens Injektions führte zu einer signifikanten RGC Axon Verlust bei 3 und 6 Wochen nach dem Eingriff im Vergleich Augen zu steuern. Die Dichte der RGC Axone in intakter, nicht-glaukomatöse C57 / BL6-Mäusen wird als Referenz (weiße Balken, 100% Überlebensrate) gezeigt. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt (Intact: n = 4, 3 Wochen: n = 5, 6 Wochen: n = 6, ANOVA, *** p <0,001). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Discussion

Die Video-Technik, die hier vorgestellt liefert detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie intrakamerale Injektion von magnetischen Mikrokügelchen durchzuführen, um effektiv und reproduzierbar IOP Erhebung in Mäusen zu induzieren. Dieses Verfahren führt zu anhaltenden IOP erhöhen, dass keine zusätzlichen Injektionen erfordert und fördert nachweisbar RGC soma und Axon Verlust innerhalb der ersten 3 Wochen der okulare Hypertension induction.Elevated IOP ist ein wichtiger Risikofaktor für Glaukom beim Menschen zu entwickeln. Daher ist dies eine wertvolle murine okulärer Hypertension abhängigen Glaukom-Modell, das für eine Vielzahl von Anwendungen Potential.

Ein gemeinsamer Nachteil, der mit der Injektion von Mikrokugeln in die vordere Kammer betrifft Reflux durch die Injektionsstelle zu Wulst, wenn die Nadel zurückgezogen wird, was resultiert oft in nur eine teilweise Behinderung der wässrigen Abfluss und eine erhöhte Variabilität. Um dieses Problem zu beheben, wurden mehrere wichtige Änderungen umgesetzt. Firs t, die sorgfältige Vorbereitung eines sauberen, scharfen Glas microneedle mit einem facettierten Fase ist für die erfolgreiche Injektion der Mikrokügelchen von wesentlicher Bedeutung. Ein richtig vorbereitet microneedle ermöglicht kontrollierte und glatte Durchdringung der Hornhaut mit minimaler Anwendung von Druck auf die empfindliche Augenoberfläche. Die kleine Hornhauteinstich verhindert Rückfluss von Mikrokügelchen. Zusätzlich reduziert das feine microneedle die Gefahr einer Beschädigung der Nähe Strukturen wie der Iris und der Linse, die in nicht-Krankheit verbundenen Entzündungen führen könnte. Zum anderen ist die Anwendung eines Handmagneten strategischen Augenbereiche während und nach der Injektion ein weiterer kritischer Aspekt dieser Technik. Während der Injektion wird der Magnet verwendet, um die magnetischen Mikrokügelchen in die Vorderkammer verhindert Rückfluss der Mikrokügelchen zu ziehen, wenn die Mikronadeln entnommen wird. Nach der Injektion wird der Magnet dann verwendet, um die Mikrokügelchen zu dem Kammerwinkel zu lenken wässrigen Abflusses zu blockieren.

Zelt "> Ein weiteres Problem , das häufig in Mikrobead Okklusion Modelle angetroffen wird , ist , dass wiederholte Injektionen Wulst oft notwendig sind , aufrechterhalten 10,11 Erhebung IOP zu erzielen. Dies könnte das Ergebnis von Mikrokügelchen aus dem Kammerwinkel mit der Zeit. Die Kombination aus einem Handheld - Magnet Verdrängen sein, wie oben beschrieben, und die Positionierung der Maus postoperativ verbessert erheblich das Ergebnis dar. die Verwendung von injizierbaren Anästhetika, die während des Verfahrens um den Kopf zu bewegen und erfordern eine längere postoperativen Erholungsphase Flexibilität ermöglichen, begünstigt wird. Platzierung der Maus mit dem operierten Auge trägt an der Kammerwinkel auf die Abwicklung von Mikrokugeln nach oben für ein paar Stunden nach der Operation gegenüber, und verringert das Risiko von Rücken in die vordere Kammer verdrängen.

Sicherstellung, dass die Anzahl der injizierten beads relativ stabil ist, ist ein weiterer wichtiger Schritt interTier Variationen zu minimieren. Da die Mikrokügelchen an der b absetzenottom des Rohres, ist es notwendig, vollständig die Mikrobead Lösung zu homogenisieren und das entsprechende Volumen in die Mikronadeln in angemessener Zeit zurückziehen. Injektion von weniger Perlen in die vordere Kammer zu einer unvollständigen Blockade der Kammerwasserabflussstrukturen führen kann, was wahrscheinlich zu einer schlechten oder variable IOP Höhe zu führen. Zu beachten ist, obwohl der eigentliche Zweck der Mikrobead Injektion ist IOP zu erhöhen, ist Vorsicht geboten, wenn IOP-Messungen wach Mäuse sind höher als die Spitzenwerte in dieser Studie berichtet (~ 25 mmHg). Extrem hohe IOPs das Risiko für einen ischämischen Schaden erhöhen und auch Schmerzen für das Tier verursachen können. Die Erhöhung des IOP sollte als eine von vielen Faktoren in Betracht gezogen werden, um den Erfolg der Operation zu beurteilen. Als solches sollte das Ergebnis des Verfahrens auf der Grundlage mehrerer Parameter, einschließlich Elevations IOP, RGC soma Tod und Verlust axon gemessen werden.

Obwohl das hier beschriebene Protokoll führt in den meisten Mikrokügelchen erfolgreichly im Winkel Absetzen, ist eine mögliche Einschränkung dieses Modells, dass diese Kügelchen, die mit Live-Netzhaut-Imaging durch die Hornhaut stören könnten, sowie elektro oder Verhaltenstests in der vorderen Kammer bleiben schwebend, die eine effektive Durchgang von Licht erfordern. Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Nutzung dieses Modells Mikrobead Okklusion ist, dass das Ausmaß der IOP Elevation und anschließende RGC Degeneration variiert mit dem Alter und dem genetischen Hintergrund des operierten Maus [4]. Daher müssen das Ausmaß der IOP Erhebung und die Chronologie der RGC-Degeneration für jede spezifische transgene Mauslinie und / oder Altersbereich ermittelt werden.

Ein Merkmal dieses Modells ist, dass erhöhte IOP führt zum allmählichen Verlust der RGC Tod während der ersten drei Wochen nach der Injektion Mikrokügelchens und signifikante RGC-Absterbens bei 3 Wochen nach dem Verfahren festgestellt wird. Daher ermöglicht dieses Modell die Prüfung der frühen und / oder subtile Veränderungen, die in diesem d auftretenisease vor RGC soma und Axon Verlust zu manifester. Ein signifikanter Anstieg der RGC Tod wurde nicht zwischen 3 und 6 Wochen nach Induktion von okulärer Hypertension beobachtet. Tatsächlich RGC Soma und Axon Verlust blieb stabil bei ~ 22-25% zwischen 3 und 6 Wochen trotz erfolgreichen und anhalt IOP Elevations zu diesen Zeitpunkten. Eine längere Dauer der anhaltenden IOP können für zusätzliche RGC Verlust auftritt in C57BL / 6 - Mäusen, die im Vergleich zu anderen Mausstämmen zu RGC Beschädigung sein beständiger erscheinen erforderlich. 5 Zusätzliche Modifikationen des Protokolls hier vorgestellten, einschließlich Anpassung der Perlgröße und zusätzliche Injektionen erforderlich sein, zu späteren Zeitpunkten zu studieren RGC Verlust. Daher ist unser Protokoll für Studien ideal auf frühe pathophysiologischen Veränderungen konzentriert, die mit bescheidenen RGC Neurodegeneration korrelieren, die zu Beginn relevant sind und frühen Progression in der menschlichen Glaukom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Puller Narishige PC-10
Thin Wall Glass Capillaries World Precision Instruments TW150F-4 Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm
Stereo Microscope Zeiss MZ9.5 Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.
Footswitch Linemaster T-91-SE
Stainless Steel Blade Feather No. 11
Microelectrode Beveler Science Products BV-10
Aerosol Duster Fisher 23-022-523
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Tris Base Fisher Scientific BP152-1
Vortex Fisher Scientific 12-812
Dynabeads M-450 Epoxy Life Technologies 14011 Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C.
Mini-Tube Rotators Fisher Scientific 05-450-127
3 Handheld Magnets Geomag 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.
25 ml serological pipet Costar 4489
Pipet Drummond 4-000-101
Biological Containment Hood Biostad 377355
Balanced salt solution (BSS) Alcon 0065-0800-25
P1,000 Micropipet Gilson F123602
Microtube 1.5 ml Sarstedt 72.690
P200 Micropipet Gilson F123601
0.2 ml PCR tube Sarstedt 72737.002
Ketamine Controlled substance
Xylazine Bayer Healthcare
Acepromazine Vetoquinol
U-100 Insulin Syringe Becton Dickinson and Company 329461
Balance Ohaus CS 200
Buprenorphine Controlled substance
Tropicamide ophthalmic solution Alcon 0998-0355-15 1% Mydriacyl
Manual Microsyringe Pump with Digital Display World Precision Instruments DMP
Manual Micromanipulator World Precision Instruments M3301R
Platform Fisher Scientific 14-673-52 8 x 8 inch
Absorbent swabs Kettenbach 30601
P20 Micropipet Gilson F123600
Plastic forcep Euroband 1001 Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye
Fluoroquinolone ophthalmic solution Alcon Vigamox
Heating pad Sunbeam E12107-834
Tonometer iCare TV02 TONOLAB rebound tonometer 
Paraformaldehyde, Para Fisher Scientific T353-500
Dissection tools
Small brush
Glutaraldehyde solution Sigma-Aldrich G7651
Sodium Cacodylate, tryhydrate Canemco and Marivec 124-65-2
Brn-3a antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-31984
Tissue Culture Plate, 48 well Falcon 353078
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Life Technologies A-11058
Aluminum foil
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Slow fade Gold antifade reagent Life Technologies S36936
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5E
Osmium tetroxide 2% aqueous solution Electron Microscopy Sciences 3294949
Embed-812 Electron Microscopy Sciences 14900
Dodecenyl succinic anhydride Electron Microscopy Sciences 13710
Nadic methyl anhydride Electron Microscopy Sciences 19000
DMP-30 Electron Microscopy Sciences 13600
Propylene oxide Sigma-Aldrich 110205-1L
Embedding mold-Dykstra Electron Microscopy Sciences 70907
Porter-Blum ultra-microtome Sorvall MT-2
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) Fisher-Scientific T161-25

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References

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