방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

Biology

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Summary

예로서, 뮤린 ABC 수송 Bcrp1 (ABCG2)을에 실리 프로토콜은 마우스 조직에서 발현하는 유전자로 대체 프로모터 사용량을 검출하고, 리포터 분석법을 사용하여 확인 된 다른 프로모터의 기능을 평가하기 위해 제공된다.

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Natarajan, K., Xie, Y., Nakanishi, T., Moreci, R. S., Jeyasuria, P., Hussain, A., Ross, D. D. Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1. J. Vis. Exp. (111), e53827, doi:10.3791/53827 (2016).

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Abstract

일반적으로 번역되지 않은 - - 첫 번째 엑손 다른 조직에서 유전자 발현은 종종 독특한와의 mRNA의 합성 결과 다른 프로모터에 의해 제어된다. E1U, E1A, E1B 및 E1C : Bcrp1 (ABCG2)는 ABC 트랜스 포터 유방암 저항 단백질 (BCRP, ABCG2)의 쥐 orthologue는, 생산 대응하는 네 개의 대안 첫 번째 엑손에 의해 지정된 적어도 네 개의 대안 발기인이 있습니다. 여기에 실리 프로토콜은 Bcrp1에 대한 대체 발기인 사용량을 예측하기 위해 제공됩니다. 또한, 리포터 분석 방법은 다른 프로모터 리포터 작 제물을 제조하고,이 상류 식별 대안 제 엑손의 추정 프로모터의 기능을 결정하기 위해 설명된다.

Introduction

더 많은 인간 유전자의 절반 이상은 다른 발기인 (1)에 의해 조절된다. 각 대안 프로모터는 다른 대안 발기인에서와 다를 수 있습니다 조절 요소를 포함 할 수 있습니다. 하나의 조직에 사용되는 프로모터 (들) 다른 조직에서 사용되는 것과 다를 수 있습니다. 예를 들면, 소정의 신호 전달 경로의 활성화는 하나의 조직에 이용되는 유전자 대안 적 프로모터를 실행하면서도에 영향을 미치지 또는 다른 조직에서 이용되는 것과 같은 유전자에 대한 별도의 다른 프로모터를 금할 수있다.

Bcrp1 유전자의 발현은 다른 발기인이 적용됩니다. Bcrp1은 인간의 유방암 저항 단백질 (BCRP) 유전자의 쥐 orthologue입니다. BCRP는 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 트랜스 포터, 공식적으로 지정 ABCG2 2, 3입니다. 정점 세포막 단백질로서, BCRP / Bcrp1 기능 천연 및 생체이 다양한 기질을 유출하는 3,4-. (12) - 인간과 쥐에서 BCRP / Bcrp1은 매우 예컨대 태반, 뇌와 고환 2, 5 등 혈액 조직 장벽과 간 (담즙 누소관), 소장, 신장,뿐만 아니라 기관으로 약학 관련 기관 표현된다. 조혈 암 줄기 세포를 포함한 다른 줄기 세포에서 BCRP / Bcrp1 생체 이물질의 발현은 암 화학 요법 제 약물 (3)에 이들 세포의 내성을 부여 할 수있다.

정상 및 종양 세포에서 BCRP 식의 규정을 이해하는 초기 연구에서 cDNA를 종료 (5'-RACE) BCRP의 mRNA의 분석 5 '빠른 증폭 정확한 전사 개시 사이트 (13)을 결정 하였다. 뿐만 아니라 다수의 발견 전사 개시 사이트시켰다 또한 BCRP에 번역되지 않은 첫 번째 엑손, 세 가지 다른 형태가되었다가 발생했습니다. 이러한 대안 첫 번째 엑손 - E1A 지정, E1B, E1C는 - 인체 조직의 다양한 다르게 표현했다. 두 개의 추가적인 제 엑손 변이체 BCRP 13 번째 엑손을 사용하여 인간의 EST 데이터베이스의 BLAST 검색에서 발견되었다. 네 경기는 상류 E1u를 지정되었다 엑손 2에서 첫 번째 엑손> 70킬로바이트를 한 것으로 밝혀졌습니다; 네 개의 다른 경기는 E1- (13)를 지정되었다 완전히 첫 번째 엑손 부족 BCRP의 mRNA를 밝혔다. 대안 리더 엑손의 존재는 다른 프로모터 사용 (14)의 표현 인 것으로 간주된다.

마우스에서, Bcrp1 네 다른 제 엑손 다른 마우스 조직에서 Bcrp 전사를 제어하는 프로모터 대신에 대응할 수 것이 기재되어있다; 이러한 엑손 / 발기인 E1U, E1A, E1B 및 E1C을 지정하고, 약있는 70, Bcrp1 엑손 2 5, 15 상류 58, 15, 및 5킬로바이트 E1A mRNA의 이소 형은 murin에서 지배적 인 것으로 밝혀졌다즉 조혈 줄기 세포, 심장, 폐, 비장, 뇌의 E1B 이성체가 골수 5, 15 마우스 대장, 태아 간 세포 및 적혈구 전구 세포에서 발현 된 반면. 상류 E1B로부터 프로모터 포스 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질 (p-CREB) 그 대안 고유 CREB ​​반응 요소에 의해 적어도 부분적으로 조절 마우스 장내 Bcrp1 전사를 지배하는 중요한 대안 프로모터 것으로 나타났다 Bcrp1 프로모터 (16). E1C mRNA의 이성체가 주로 성인 쥐의 간 및 신장 (5)로 표현된다. E1U 이소 형은 5 표현 지배적 인 이소 인 쥐의 고환을 제외하고 테스트 대부분의 조직에서 발견 할 수없는 것입니다. Bcrp1은 (는 말기 정자 4를 보호 수있는 정액을 운반하는 내피 세포에서) 모두 체세포 (내피 꽉 접합, 세뇨관 myoid 세포와 세르 톨리 (Sertoli) 세포)와 배아 세포에서 발견되는 쥐의 고환에 표현했다. 등록상류 E1U에서 이온 steroidogenic 인자 -1 (SF-1) 5 기능 응답 요소가 포함되어 있습니다. Bcrp1의 mRNA와 단백질은 크게 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서 Bcrp1 발현 SF-1 (5)에 의해 제어되고 있음을 시사 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 SF-1 녹아웃 생쥐의 고환에서 감소된다.

구체적 방법을 제시 프로토콜에 실리 Bcrp1 대체 엑손 제를 검출하고, 상류 식별 된 다른 제 엑손에서 추정 프로모터 루시페라아제 기반 리포터 분석법을 확립.

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Protocol

마우스 EST 데이터베이스의 BLAST 분석을 사용하여 Bcrp1의 대안 첫 번째 엑손의 실리 예측 1.

참고 :이 프로토콜을 확인하기 위해 게놈 서열에 일치하는 EST 서열을 정렬하는 방법을 다음 마우스 표현 된 시퀀스 태그 (EST) (포함 번역 시작 사이트) Bcrp1의 2 엑손하는 서열의 유사성과 EST를위한 데이터베이스를 검색하는 방법에 대해 설명 자신의 Bcrp1 엑손 (2)의 5 '말단에 마우스 Bcrp1 유전자의 상대적인 위치.

  1. 의 Ensembl 게놈 브라우저 (17)의 검색 창에 mRNA를 참조 시퀀스 ID (NM_011920.3)를 입력하여 마우스 Bcrp1 엑손 2의 순서를 얻기를 클릭 "GO." 다음 화면에서, 전체 길이 시퀀스 (16 개의 엑손을 포함) 선택 :
    1. 다음 화면 ( "대본 기반 디스플레이")에서 "16 엑손 '을 선택합니다. 이 Bcrp1의 모든 엑손의 서열을 포함하는 화면이 표시됩니다. Bcrp1의 엑손 2 5 "읽9; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "기준 18에 도시 된 것과 유사한 것이다 얻어진 결과..
    2. "다운로드 순서"옵션을 클릭합니다. 다음 화면에서, FASTA 형식을 선택하고 다음을 클릭합니다 "미리보기." 다음 화면에서 클립 보드에 엑손 2의 미리보기 시퀀스를 복사합니다.
  2. 생명 공학 정보 (NCBI)의 웹 사이트 (20)를위한 국가 센터에 BLAST 홈페이지 (19)로 이동합니다.
    1. "마우스"게놈을 선택합니다. 쿼리 상자에 클립 보드에서 엑손 2 시퀀스를 붙여 넣습니다.
    2. 데이터베이스 드롭 다운에서 "EST를"를 선택하여 최적화 "매우 유사한 서열,"다음 선택 "BLAST를." 실행 시간은 몇 분 정도 걸릴 것입니다. 폭발 실행이 완료되면, "결과"페이지가 나타납니다.
    3. 은 "결과"페이지의 "설명"소호에서 (전체를 "ALL"다음 "다운로드"를 선택한 다음 "FASTA를 선택"드롭 다운 메뉴에서 다음 선택"순서) 계속 "A .txt 파일이 나타납니다;. 열려있는 클립 보드에 전체 파일을 복사 .txt 파일을 마우스 Bcrp1의 exon2 높은 서열 유사성을 가진 모든 EST를의 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. 하지만 관계에서의 위치는 Bcrp1 유전자에 2 엑손합니다.
      참고 : 2015 년 4 월 15 수행 분석이 Bcrp1 엑손 2. 정렬이 표 1에 나와있는 14 쥐 EST를 식별.
  3. Bcrp1 유전자에 2 엑손하는 5 '를 인 EST 서열의 위치를​​ 확인합니다. 마우스 Bcrp1 유전자는 염색체 6 인접 NC_000072.6 (: 372099104 GI)에 위치하고 있습니다.
    1. 은 "전문 폭발"부제목 아래 BLAST 홈페이지에서 선택 "BLAST (bl2seq)를 사용하여 두 개 (또는 그 이상)의 순서를 맞 춥니 다."
    2. 쿼리 상자에 클립 보드에서 텍스트 파일을 붙여 넣기와 피사체의 순서 상자에 372099104를 입력합니다. 프로그램에서 "매우 유사한 서열"최적화선택 및 실행 BLAST.
    3. 결과 창이 나타나면, 그래픽 "선형"창에서 "그래픽"을 클릭하여 정렬을 볼 수 있습니다. 오른쪽 및 왼쪽 화살표를 사용하고 Bcrp1 / ABCG2와 서열 정렬에 초점을 확대합니다.
    4. 순서 정렬을 저장 : "설명"상자에 "ALL"을 선택한 후 "다운로드"드롭 다운 메뉴에서 "테이블 (CSV)를 히트"를 선택하고 다음을 클릭합니다 "계속합니다." 이 파일은 Bcrp1 엑손 2의 서열 정렬 및 마우스 염색체 6 인접에있는 뉴클레오티드의 번호를 기준으로 Bcrp1 Exon2에 서열 유사성을 가진 모든 EST 서열의 정렬이 포함되어 있습니다. 각 전체 EST 시퀀스는 Bcrp1 엑손 2 중첩 시퀀스를 포함하여 2 엑손하는 지역 5 '및 3'에 걸쳐 여러 정렬을 생성 할 수 있습니다.
    5. 엑손 (2)의 5 '말단의 위치는 6 번 염색체에 인접 뉴클레오티드 58655638에 대응하는 바와 같이,으로 지정할+1하고는 58,655,638 각각 EST (5 ')의 부분 서열의 위치를​​ 계산한다. 14 EST를위한 결과는 표 1에 나타내었다.
      참고 : 5 '잠재적 첫 번째 엑손로 (즉,이 음의 염기 값) +1에 있습니다 EST 서열을 분석하는 데주의해야합니다. 예를 들어, 표 1 (AI647825 및 AI664571)에 도시 Bcrp1 엑손 2 정렬 EST를 두 가지의 나머지 순서는 3 2 엑손하기 '입니다.

2. 평가 Bcrp1의 대체 발기인 기능

  1. 기자의 디자인 Bcrp1 E1U, E1A, E1B 및 E1C 프로모터에 대한 구축
    1. 에서 EST 데이터베이스를 검색 얻은 E1U의 시퀀스를 이용하여, +1로 E1U의 제 5 '뉴클레오티드를 나타낸다.
    2. 세균 인공 염색체 (BAC)의 상류 Bcrp1 / ABCG2 유전자 서열과 순서를 적어도 1백킬로바이트 포함 마우스 염색체 6의 복제를 얻Bcrp1 / ABCG2 유전자 (재료 및 장비의 목록 참조).
      1. 이러한 루시퍼 라제 리포터 플라스미드 pGL3-기본으로 적합한 기자 벡터를 식별합니다.
      2. 기자 벡터의 여러 복제 사이트를 확인합니다. KpnI으로, SacI로, Mlu1, 된 NheI,를 SmaI, XhoI에, BglII에 및 HindIII로 배향 '3'5에서 pGL3-기본 벡터의 다중 클로닝 부위에서 제한 효소 부위이다.
        참고 : 소화 사이트의 순서는 제한 효소를 생산하는 회사의 제품 카탈로그에서 사용할 수 있습니다.
      3. E1U 엑손의 모든 소화 사이트와 E1U는 DNA5 같은 소프트웨어 프로그램을 사용 '을 2킬로바이트 영역 (5)을 확인합니다. E1U 또는 2킬로바이트 상류 지역에서 발견되지 않은 pGL3-기본 다중 클로닝 부위에 적어도 두 개의 소화 사이트를 식별합니다.
        참고 : 확인하기 위해 역방향 프라이머 위해 선택된 하나의 상류 인 정방향 프라이머에 대한 여러 복제 사이트 제한 사이트를 선택해야하는 삽입 줘야난 올바른 방향으로합니다.
    3. 앞으로 준비 및 상업 유전자 / 프라이머 합성 서비스 나 프라이머 선택 소프트웨어 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 선택된 pGL3-기본 다중 클로닝 부위의 제한 효소 사이트에 대한 시퀀스를 포함하는 PCR 용 프라이머 역. E1U 순서와 E1U 시퀀스 내에서 역방향 프라이머에서 ~ 2킬로바이트 상류에 위치하는 정방향 프라이머를 선택합니다. 저자들에 사용 된 프라이머 '전작 순방향 프라이머에서의 SacI 부위 및 역방향 프라이머의 된 NheI 부위를 포함하고, 상기 제 5 +64 약 -1,906의 게놈 영역을 증폭'로 지정 E1U의 뉴클레오티드 + 1 (위의 단계 2.1.1 참조), 참조 (16)에 제공됩니다.
      1. PCR은 0.01 BAC의 μg의 1이 프라이머를 사용하여 E1U 게놈 영역을 증폭하고, PCR 마스터 믹스에 변성 높은 충실도 Taq 중합 효소를 (재료 및 장비의 목록 참조) 포함(30) 72 ℃ (2 분)에서 확장자 초 후 PCR의 35 내지 40 사이클 및 어닐링에 사용되는 프라이머의 용융 특성에 기초하여 용해 온도가 95 ° C.
        주 : 고성능 Taq 중합 효소의 사용은 높은 GC 함량이 시퀀싱 프로모터 영역에 대해 필수적이다. 예 주형 인 BAC 큰 게놈 DNA 단편을 사용하는 경우, 게놈 DNA의 2 차 구조가 곤란 PCR 프라이머가 결합 할 수 있도록 할 수있다. 이런 문제가 발생하면 긴 게놈 DNA 템플릿의 PCR 반응 전에 초음파에 의해 부드럽게 전단 경우 더 PCR 결과를 얻을 수있다.
      2. 0.8 % TAE 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 1 킬로바이트 DNA 래더에 대해 비교하여, 증폭 된 PCR 산물의 길이를 확인한다.
    4. 얻어진 PCR 생성물 및 pGL3-기본 벡터 다이제스트 제한을 사용하여 전방에 도입 된 제한 효소 부위에 특이적인 엔도 뉴 클레아 제 및 기능에 따라 역방향 프라이머제한 효소 소화가 공급 tructions.
      1. 키트 프로토콜 (21) 다음과 같은 상업 SV 젤과 PCR 클린 업 시스템 키트 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 소화 반응을 정화.
        1. 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 미가공 벡터에 대해 비교하여 벡터의 소화 및 선형화 확인 후 절단하고 절단 벡터 DNA 밴드를 정제. 정제 된 PCR 제품의 농도와 UV 분광법을 (재료 및 장비의 목록 참조)를 사용하여 정제 벡터를 측정한다.
    5. 정제를 결찰하여 E1U 기자 구문을 준비, 제한 효소는 소화 PCR 제품 및 pGL3-기본 반딧불이 루시퍼 라제 리포터 벡터 (리포터 분석 키트에 포함, 재료 목록 및 장비를 참조) 삽입에 : 11, 21, 31의 벡터 비율, 이에 E1U 연구 제조 키트 지시 (22)에 따라, "T4 DNA 리가 퀵 라이 게이션 키트"를 사용하여pGL3-E1U 이름 eporter 구조.
      1. 클론 적 조교 복제 키트 pGL3-E1U 다음 지침을 확장하는 박테리아를 변환하는 pGL3-E1U 플라스미드를 사용 (재료 및 장비의 목록 참조).
      2. 서열 분석에 의해 삽입의 방향과 충실도를 확인합니다.
    6. 준비 기자 E1U에 관해서는 비슷한 방법을 사용 E1A, E1B 및 E1C에 대한 구성한다. 섹션 2.1.5.2에서와 같이 염기 서열에 의한 삽입의 충실도를 확인합니다.
      참고 : E1A, E1B 및 E1C의 프로모터 삽입이 있어야 할 약 -1,875 / + 10, -1,847 / + 60 및 E1A, E1B의 (+1로 지정) 처음 5 '뉴클레오티드에 -1,904 / + 83 기준, 각각 또는 E1C.
  2. 리포터 분석 방법
    참고 : 기자 분석의 일반적인 전략 : 유전자의 추정 프로모터 (5 '업스트림 영역 것은)는 "reporte를 포함하는 빈"기자 "벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입다중 클로닝 부위로부터 하류 R 유전자 "(예를 들어, 개똥 벌레 루시퍼 라제). 벡터이어서 관심의 유전자를 발현 진핵 세포 내로 형질 감염된다. 활성화해야 이들 세포에서 관심있는 유전자의 발현을 촉진 트랜스 - 작용 인자 형질 리포터 벡터의 프로모터, 용이하게 발광 분석법으로 정량 할 수 반딧불이 루시퍼 라제의 발현을 일으키는.
    1. 리포터 분석에 사용하기위한 적절한 세포주를 선택한다.
      주 : E1U 다른 프로모터 리포터 구조물의 활성을 평가하기 위해, 즉 E1U 프로모터의 제어하에 Bcrp1 발현 세포로 형질 구축 할 필요가있다. TM4 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포 라인 (재료 목록 및 장비를 참조)는 Bcrp1 단백질을 표현하고 Bcrp1의 mRNA는 E1U뿐만 아니라 E1A, E1B 및 E1C 5를 포함. 음성 대조군으로, Bcrp1 단백질 또는 mRNA를 표현하지 않는 세포주를 사용하는 것이 좋습니다.
    2. TM4 가전 문화200,000 세포의 초기 밀도 / 웰의 1에서 24 웰 플레이트에서 LLS : 햄 F12 배지와 1.2 g / L 중탄산 나트륨을 가진 둘 베코 변형 이글 배지 1 혼합물은 15 mM의 HEPES 5 % 말 혈청, 2.5 % 이전 5 바와 같이 37 ° C, 5 % CO 2에서 소 태아 혈청, 페니실린 (100 IU / ㎖) 및 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖).
    3. 여섯 시간 배양 세포를 배치 한 후, 빈 pGL3-기본 벡터 0.2 μg의과 또는 -1,906 / + 64 E1U 또는 -1,875 / + 10 E1A 또는 -1,847 / + 60 E1B를 포함 pGL3 벡터 0.2 μg의와 세포를 형질 또는 -1,904 / + 83 E1C Bcrp 1 삭제 상업 DNA 형질 전환 키트 제조 업체의 프로토콜 23을 사용하여, 내부 통제 등의 pRL-TK (A 레 닐라 루시퍼 라제 발현 벡터)의 4 NG와 함께 구성 (재료 및 장비의 목록 참조) .
    4. 30 시간 다음과 같은 형질의 cultur에서 성장 미디어를 제거혼성 세포를 형질. PBS 200 μl를 한 번 세포를 세척 한 후 세척 용액을 제거.
      1. 개똥 벌레 및 레 닐라 측정 루시퍼 라제 활성은 제조자의 프로토콜 (24)에 따른 상업용 키트를 사용.
    5. 내부 (레 닐라 루시퍼 라제) 제어부에 의해 분할 된 반딧불 루시퍼 라제 활성의 비율로 각 튜브에 대한 활성을 발현; 각 리포터의 활성은 1의 값을 특정하는 빈 pGL3 기본 벡터로 형질 감염된 세포의 상대적인 구성으로 전체적인 결과는 일반적으로 표현된다.

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Representative Results

리더 엑손의 분석에 의해 마우스 고환에서 Bcrp 다른 프로모터 활용의 식별

NCBI의 EST 데이터베이스 프로토콜 1에서 설명 된 단계 (2015 에이프릴) 프로브되었을 때, EST를 게놈에서의 위치와 함께, 하나의 mRNA를 표 1에 나타낸다 Bcrp의 엑손 (2)의 5 '말단으로 연속적인 것으로 나타났다 엑손 E1U (표 1)에 대응하는 mRNA를 엑손 2 ~ 70킬로바이트 상류 게놈 DNA의 서열을 갖는다 Bcrp 1 2 엑손에 인접 인 C57BL / 6J 마우스 정소 유래의 2 원 EST의 시작 DNA 상대. 마찬가지로, E1A, E1B 및 E1C에 해당하는 EST를 검출되었다. 참고로 E1C에 해당하는 두 개의 EST를 또한 E1C의 5 '말단에 접합 E1B를 포함한다는 것입니다. 이러한 예측 첫 번째 엑손의 위치에마우스 염색체 6에 Bcrp1 엑손 2의 관계는 그림 1과 같다.

Bcrp 다른 프로모터 기능의 평가

E1U, E1A에 해당하는 일반적인 루시 페라 제 분석 결과, TM4 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포 (2.2 절 참조)에 형질 E1B 및 E1C 프로모터 루시 페라 제 기자의 구조는 그림 2A에 표시됩니다.

이전의 연구에서, SF-1 응답 요소는 E1U 프로모터 5에있을 것으로 예상했다. 이 추정 SF-1 반응 요소가 마우스 정소에서 Bcrp1 전사의 조절에 관여하는 경우 E1U 프로모터 리포터 구조체에 해당 응답 요소 (이전 용지 (5)에 설명) 다음, 돌연변이 그 구조에 의해 생성 된 루시퍼 라제 활성을 줄일 로 형질 전환 된 때TM4 세포. 전형적인 실험의 결과는도 2b에 도시되어있다. 돌연변이 구조도 (이전의 용지 (5)에 기재되어 있음) SF-1의 강제 식 세포 빈 pGL3-기본 벡터의 것과 유사한 활성을, 미 돌연변이 구조보다 낮은 루시페라아제 활성을 나타내고있다. SF-1의 강제 발현 돌연변이 하나의 그 미 돌연변이 구조의 활성을 증가 아니지만.

그림 1
그림 1. 쥐의 염색체 6.이 정렬 4 월에 수행 dbEST의 BLAST 검색에서 확인되었다와 Bcrp1 엑손 2 서열 동일성을 가진 EST를의 게놈 배열의 다이어그램, 2015 개의 별개의 정렬이 다른 첫 번째 엑손 E1U, E1A를 Bcrp1에 해당하는, 발견 E1B 및 E1C. 이 수치는 이전 발행 5에서 재생된다.

그림 2
그림 2. BALB / C 세르 톨리 (Sertoli) 세포 유래 TM4 세포에서 (A) 리포터 Bcrp1 발기인에 대한 분석 E1U, E1A, E1B 및 E1C. 데이터는 다른 날에 일 평균과 세 가지의 실험 표준 편차를, 절에 나와 2. 데이터를 설명하는 방법을하는 사용, 레 닐라 루시퍼의 정규화 반딧불 루시 페라 제의 발광으로 표현된다. 별표는 t -test의 (P <0.01)를 사용하여 빈 pGL3 벡터 제어에서 상당한 차이를 나타낸다. 이 수치는 이전 발행 5에서 재생된다. Bcrp1 E1U 재에서 SF-1 응답 요소의 돌연변이의 (B) 효과포터는 루시 페라 제 활동을 구성. Bcrp1 기자 (UN 돌연변이 돌연변이 나)와 TM4 세포로 형질 전환 된 추정 SF-1 결합 영역으로 구성한다 (SF-1 형질) 및 (형질 벡터)에 도시 된 SF-1. 데이터의 강제 발현없이 평균이다 3 가지의 실험, 다른 일에 수행; 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 실험에 대한 개별 분석은 중복으로 수행되었다. T 개의 -test를 사용 E1U 프로모터 구조물에 비해 통계적으로 유의 한 차이 (B)됨을 의미한다 (P <상기 도면에서, (A)는 (P <0.05)를 t -test를 이용하여 빈 벡터 pGL3 제어에서 상당한 차이를 나타낸다 0.05). 이 그림은 이전의 출판물 5에서 재생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


1. Bcrp1 25 -28의 두 번째 엑손의 순서에 대해 마우스 EST 데이터베이스의 폭발 검색 할 수 있습니다. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

제시된 방법과 대표적인 결과의 대부분은 2013 5 년에 출판되었다 ​​"마우스 고환에서 B의 crp1 전사 상류 steroidogenic 요소-1에 의해 규제 소설 첫 번째 엑손 (E1U)의 프로모터에 의해 제어된다"라는 이전 작업에 설명되어 있습니다 . 여기에 도시 된 대표적인 결과에 더하여, 이전의 논문은 5'-RACE PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하여 대안적인 제 엑손 활용 추정치를 제공 하였다. 또한, 인 실리코 상류 E1U 중 프로모터의 추정 SF-1 반응 요소의 인식을 수행하고, 염색질 면역 (칩) 분석은 SF-1은 추정 SF-1 반응 요소에 결합 된 것을 증명 하였다. 기능 연구는 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서, Bcrp 전사가 E1U 프로모터의 SF-1 응답 요소를 통해 SF-1에 의해 제어되는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능성 연구에 의해 TRA TM4 셀 SF-1의 상향 조절을 포함nsfection 또는 Bcrp 1 E1U의 mRNA의 강화 된 표현의 결과 히스톤 디 아세틸 라제 억제제 (vorinostat), 및 기자 분석에서 Bcrp 1 E1U 프로모터의 Bcrp 1 단백질의 증가뿐만 아니라 활동의 사용에 의해. 마지막으로,이 연구는 성인 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 특정 SF-1 녹아웃 마우스의 고환에, Bcrp 1 E1U의 mRNA의 발현은 총 Bcrp 1의 mRNA 및 Bcrp1 단백질이 현저 5 감소 하였다는 증거를 제공했다. 같은 연구는 신장, 간, 고환, 뇌, 심장, 폐, 근육 및 비장을 비롯한 5 뮤린 조직의 다양한 이성체 Bcrp1 mRNA의 발현 패턴을보고 하였다.

모델로 Bcrp 하나의 조직 - 특이 적 조절을 이용하여 - - 여기에 설명 된 프로토콜의 차이를 결정하는 임의의 유전자의 전사의 복잡성을 해명하기 용이 한 실험 프레임 워크를 제공한다다양한 조직 또는 세포 아형의 식입니다. 에 실리 평가에 기술 된 프로토콜 단계에서 얻은 결과는 시간에 따른 소프트웨어 및 변경 될 수 있습니다 사용되는 데이터베이스를 수용하는 다양한 웹 사이트 이후 수 있음을 강조해야합니다. 여기에 제시된에 실리 방법은 EST 데이터 세트에있는 모든 인간 유전자의 약 18 %가 대체 발기인을 사용하는 것으로 추정 이전에 29 일보고 한 EST 데이터베이스 (dbEST)를 검색 이용한다. 에 "올리고 캡"방법을 사용하여 사람의 조직에서 cDNA를의 180 만 5'- 말단 시퀀스를 생성하기 위해 - - 다른 연구자가 있기 때문에 dbEST이 다른 첫 번째 엑손을 과소 평가 할 수 있습니다 검색 인간의 유전자와 추정에 대한 추정 전사 시작 사이트를 식별 할 수 있었다 연구 인간 나온 RefSeq 유전자의 52 %는 아마도 다른 발기인 1에 의해 규제되었다. 흥미롭게도, 후자 연구 발견 그가장이었다 고환과 뇌 추정 대안 발기인을 활용 한 조직; 또한, 그들은 전달 경로 신호에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 조직 특이 적 대안 발기인 1을 채택 할 가능성 것을 발견했다. 언급 한 단점에도 불구하고, dbEST은 최소한의 노력으로 여러 조직에서의 특정 유전자의 5 'UTR 사용량 거친 개요를 제공 분석한다.

dbEST 분석이 다른 첫 번째 엑손 사용에 용이 한 엿볼을 제공하지만, 우리는 매우 조사에서 조직 또는 세포 라인에서 첫 번째 엑손 사용을 확인하기 위해 cDNA를 종료 (5'-RACE) 분석 5 '빠른 증폭을 수행하는 것이 좋습니다. 상업 키트 (재료 및 장비의 목록 참조) 제조업체에서 제공하는 상세하고 간단한 절차, 5'-RACE 사용할 수 있습니다. 다소 시간 소모적이지만, 5'-RACE 실험은 실제 존재를 평가뿐만 아니라 제 대안 예들의 시퀀스를 제공한다관심의 mRNA의 기능; 또한, 복수의 전사 개시 부위의 존재는도 13을 검출 할 수있다. 충분한 표현을 보장하기 위해, 적어도 15-25 클론의 염기 서열이 필요합니다. 시퀀싱 전에 5 'RACE 제품에서 오염 벡터의 염기 서열을 제거하는 것이 필수적이다. 이렇게하지 ​​않으면 BLAST 분석은 마우스 게놈 서열 정렬을 검출하도록 완전히 실패 할 수있다. 제 엑손 사용량이 확립되면, 5'-RACE 결과는 다른 제 엑손 후속 정량 RT-PCR 분석을 검증하는데 사용될 수있다. 일반적으로, 저자의 이전 작업 5'RACE 의해 회수 제 엑손 mRNA의 클론의 비율과 동일한 조직 또는 세포 라인 (5)로부터 소정의 다른 제 엑손 위해 회수 PCR 생성물의 비율과 상관 관계가 있다는 것을 발견했다. 또한, 상관 관계는 다른 Bcrp1 발기인에 대한 루시 페라 제 프로모터 구조의 활동 사이에서 발견 된차 특정 셀 라인 (5)에 대응하는 대안 첫 번째 엑손의 발현.

전체 기관을 사용하는 경우 조직 특이 적 대안 촉진제 사용에 대한 검색에서, 하나는있는 대안 발기인 / 첫 번째 엑손 등의 경우 선의 요소, 혈관, 간질, 같은 기관의 조직 이질성을 반영된다는 점에 유의해야합니다 예를 들어, 고환 체세포 (간질, 버팀, myoid 및 내피) 세포 및 종자 (반수체) 세포뿐만 아니라 혈관의 혼합이다. 조직 - 특이 제 엑손 발현을 조사하기 위해, 기관의 특정 조직을 분리 할 필요가있다.

다른 방법은 다른 프로모터의 사용 및 관리를 식별하기위한보고되었다; 그러나 이러한 차세대 시퀀싱을 필요 정보학 제조 많은 양의 데이터를 분석 할 수있는 컴퓨팅. 이러한 방법은 전체 transcriptosome 시퀀싱 (RNA의 서열), 그리고 칩 - 서열을 포함이러한 프로모터 (30)에 우선적으로 결합 H3K4me3, 같은 히스톤. 이러한 방법은 포커스가 몇 가지 특정 유전자의 발현 및 조직에있을 때, 디 노보 수행 고가 일 수 있지만, 기존의 데이터 마이닝은보다 실용적인 방법 일 수있다.

여기에 제시된 프로모터 활성을 추정에 대한 분석은 반딧불 루시 페라 제 유전자의 상류 여러 복제 영역을 포함하는 pGL3-기본 벡터를 사용한다. 발기인 활동은 상업적 루미 (재료 및 장비의 목록 참조) 발광 측정에 의해, 보조 인자의 추가 및 발광 기판 후, 쉽게 정량화 반딧불 루시 페라 제의 생산에 의해 측정된다. 관련 pGL4 벡터가 안정적으로 형질 감염된 세포의 생산을 가능하게 선별 마커 (예, 네오 마이신, 하이 그로 마이신, 퓨로 마이신)를 포함 할 수있다. 이 논문에 주어진 프로토콜은 일시적인 형질을 사용한다. PROMOT에 대한 일반적 기자 분석어 활성은 세포 수의 변화 및 형질 전환의 효율을 제어하기 위해, 구조적 레 닐라 (바다 팬지) 루시 페라 제 (의 pRL-TK)를 발현하는 벡터로 공동 형질을 사용하여 수행됩니다. 특정 유전자의 프로모터 분석을 확립에 중요한 단계는 관심의 유전자가 기자 구조와 형질 전환 된 세포주에서 발현되어 있는지 확인하는 것입니다. 다른 프로모터의 사용은 존재하는 경우 두 번째로, 이는 형질 전환 세포주에서 발현되는 첫 번째 엑손의 대안에 대응하는 프로모터 구조체를 사용하는 것이 중요하다. 예를 들어, 단독 E1B 프로모터의 제어하에 Bcrp1 발현하는 세포로 형질 전환 된 E1U 프로모터 구조에 대한 발광을 볼 것으로 예상하지 않는다. 대안 적으로, 음성 대조군으로는 리포터 유전자 형질 또는 관심 mRNA의 이성체는 반딧불이 루시퍼 라제의 NO 생성 초래한다 발현하지 않는 세포주에 구축.

는 C대체 발기인 사용의 onsequences는 같은 단백질의 생산, 서로 다른 단백질 29의 다른 N 말단, 또는 생산과 단백질의 생산을 포함한다. 여러 Bcrp1 / BCRP의 경우 (조직 - 또는 세포 형 특이 적) 프로모터 같은 단백질의 생성을 제어한다. 유사한 패턴은 CYP19 (아로마) 유전자 29, 31 존재한다. 여기에 제시된 프로토콜은 하나의 조직 또는 세포 라인에 대한 관심의 단백질의 전사 제어의 복잡한 메커니즘을 해독하는 데 사용할 수있는 기본적인 단계를 제공합니다.

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Disclosures

더글러스 D. 로스와 메릴랜드 대학, 볼티모어 인간 BCRP에 대한 특허권을 보유.

Acknowledgments

이 작품은 더글러스 D. 로스와 재향 군인 담당 부서에서 아리프 후세인에 대한 공로 검토 포상에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kit Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies AM1700 5'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kit Life Technologies K450001 This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kit New England Biolabs M2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase Sigma-Aldrich/Roche 3553400001/RMB-4738284001  Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagent Roche 6366236001
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1910 Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprep Qiagen 27104 For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vector part of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vector Promega E1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vector Promega E2241
Bacterial artificial chromosome BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA RP23-285A12 and RP24-314E24 http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol Life Technologies 15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALS Denville Scientific V9012
SOFTWARE:
Ensembl software Ensembl project http://Ensembl.org  The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast software NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software Simgene http://simgene.com/Primer3 Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cells ATCC, Manassas, Virginia CRL-1715™
INSTRUMENTS:
Luminometer Turner Biosystems TD-20/20 This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometers Thermo Scientific, Inc. NanoDrop 2000 Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA DU 800

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References

  1. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16, (1), 55-65 (2006).
  2. Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (26), 15665-15670 (1998).
  3. Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83, (8), 1084-1103 (2012).
  4. Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15, (4), 455-460 (2013).
  5. Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829, (12), 1288-1299 (2013).
  6. Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61, (8), 3458-3464 (2001).
  7. Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235, (1), 84-92 (2006).
  8. Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13, (16), 2059-2063 (2002).
  9. Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33, (4), 524-529 (2005).
  10. Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29, (1-40), 5463-5475 (2009).
  11. Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (25), 10338-10342 (2009).
  12. Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73, (2), 220-225 (2008).
  13. Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66, (10), 5007-5011 (2006).
  14. Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10, (4), 453-460 (1996).
  15. Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281, (40), 29625-29632 (2006).
  16. Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809, (7), 295-305 (2011).
  17. Ensembl Genome Browser. http://Ensembl.org (2015).
  18. Transcript-based Display from Ensembl. http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
  19. Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
  20. National Center for Biotechnology Information (NCBI). http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
  21. Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. (2009).
  22. New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. (2014).
  23. Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). (2010).
  24. Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. (2009).
  25. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309, (5740), 1559-1563 (2005).
  26. VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12, (12), 1999-2003 (2002).
  27. Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6, (9), 791-806 (1996).
  28. Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420, (6915), 563-573 (2002).
  29. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
  30. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, (10), 669-680 (2009).
  31. Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).

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