तरीके वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग और murine Bcrp1 की Transcriptional नियमन डिस्कवर के लिए

Biology

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Summary

Murine एबीसी ट्रांसपोर्टर Bcrp1 (Abcg2) एक उदाहरण के रूप में साथ में सिलिको प्रोटोकॉल माउस ऊतकों में व्यक्त जीनों में वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग पता लगाने के लिए, और रिपोर्टर assays का उपयोग पहचान वैकल्पिक प्रमोटरों की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Natarajan, K., Xie, Y., Nakanishi, T., Moreci, R. S., Jeyasuria, P., Hussain, A., Ross, D. D. Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1. J. Vis. Exp. (111), e53827, doi:10.3791/53827 (2016).

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Abstract

आम तौर पर ग़ैर-अनुवादित - - पहले एक्सॉनों विभिन्न ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति अक्सर वैकल्पिक प्रमोटरों कि अद्वितीय साथ mRNA के संश्लेषण में परिणाम द्वारा नियंत्रित किया जाता है। E1U, E1A, E1B, और E1C: Bcrp1 (Abcg2), एबीसी ट्रांसपोर्टर स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP, ABCG2) की murine orthologue, कम से कम चार वैकल्पिक प्रमोटरों कि इसी चार वैकल्पिक पहले एक्सॉनों उत्पादित द्वारा नामित कर रहे हैं। इस के साथ साथ, में सिलिको प्रोटोकॉल Bcrp1 के लिए वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग भविष्यवाणी करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। इसके अलावा, संवाददाता परख तरीकों वैकल्पिक प्रमोटरों के लिए रिपोर्टर निर्माणों का उत्पादन करने और वैकल्पिक पहले एक्सॉनों कि पहचान कर रहे हैं के अपस्ट्रीम ख्यात प्रमोटरों की कार्यक्षमता को निर्धारित करने के लिए वर्णित हैं।

Introduction

अधिक मानव जीन के आधे से अधिक विकल्प प्रमोटरों 1 द्वारा विनियमित रहे हैं। प्रत्येक विकल्प के प्रमोटर नियामक तत्व है कि अन्य वैकल्पिक प्रमोटरों में उन लोगों से अलग हो सकता है शामिल कर सकते हैं। प्रमोटर (एस) एक ऊतक में उपयोग किया एक और ऊतक में इस्तेमाल उन लोगों से भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, यह है कि एक दिया संकेतन मार्ग की सक्रियता का एक जीन एक ऊतक में उपयोग के लिए वैकल्पिक प्रमोटर को गति प्रदान कर सकते हैं, पर अभी तक कोई प्रभाव नहीं है या एक ही जीन है कि एक और ऊतकों में उपयोग किया जाता है के लिए एक अलग विकल्प प्रमोटर को दबाने के लिए संभव है।

Bcrp1 जीन की अभिव्यक्ति वैकल्पिक प्रमोटरों द्वारा संचालित है। Bcrp1 मानव स्तन कैंसर प्रतिरोध प्रोटीन (BCRP) जीन की murine orthologue है। BCRP एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर, ABCG2 2, 3 औपचारिक रूप से नामित है। एक शिखर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के रूप में, BCRP / Bcrp1 कार्यों प्राकृतिक और जीनोबायोटिक substrates की एक विस्तृत विविधता तपका 3, 4। 12 - मनुष्यों और चूहों में, BCRP / Bcrp1 अत्यधिक ऐसे जिगर (पित्त canaliculi), आंत, और गुर्दे की, साथ ही अंगों ऐसे नाल, मस्तिष्क और वृषण 2, 5 के रूप में रक्त-ऊतक बाधाओं के साथ के रूप में औषधीय प्रासंगिक अंगों में व्यक्त किया जाता है। Hematopoietic और अन्य स्टेम सेल, कैंसर स्टेम कोशिकाओं सहित, में BCRP / Bcrp1 की अभिव्यक्ति xenobiotics और कैंसर कीमोथेरेपी दवाओं 3 करने के लिए इन कोशिकाओं के प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं।

सामान्य और नवोत्पादित कोशिकाओं में BCRP अभिव्यक्ति के नियमन को समझने के लिए जल्दी काम में, 5 'सीडीएनए समाप्त होता है (5'-दौड़) BCRP mRNA के विश्लेषण के तेजी से प्रवर्धन उसका सही ट्रांसक्रिप्शनल शुरू साइट 13 निर्धारित करने के लिए किया गया था। इतना ही नहीं कई ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों पाए गए, यह भी सामना करना पड़ा पहली एक्सॉन, जो BCRP में अनुवाद नहीं किया गया है की तीन वैकल्पिक रूपों थे। इन वैकल्पिक पहले एक्सॉनों - नामित E1A, E1B, E1c - मानव ऊतकों की एक किस्म में अलग ढंग से व्यक्त किया गया। दो अतिरिक्त पहली एक्सॉन वेरिएंट BCRP 13 के दूसरे एक्सॉन का उपयोग मानव ईएसटी डेटाबेस के एक विस्फोट खोज में खोज रहे थे। चार मैचों में एक प्रथम एक्सॉन> 70 अपस्ट्रीम एक्सॉन 2 जो E1u नामित किया गया से केबी से पता चला है; चार अन्य मैचों BCRP mRNA है कि एक पहली एक्सॉन पूरी तरह से अभाव है, जो E1- 13 नामित किया गया पता चला। वैकल्पिक नेता एक्सॉनों की उपस्थिति विकल्प प्रमोटर उपयोग 14 की एक मिसाल माना जाता है।

चूहों में, चार Bcrp1 के वैकल्पिक पहले एक्सॉनों वर्णित हैं कि वैकल्पिक प्रमोटरों है कि सरकार विभिन्न माउस ऊतकों में BCRP 1 प्रतिलेखन के अनुरूप कर सकते हैं; इन एक्सॉनों / प्रमोटरों E1U, E1A, E1B और E1C नामित कर रहे हैं, और लगभग 70 स्थित हैं, Bcrp1 एक्सॉन 2 से 5, 15 से 58, 15, और 5 केबी नदी के ऊपर। E1A mRNA isoform Murin में प्रमुख होना पाया गयाई hematopoietic स्टेम कोशिकाओं, हृदय, फेफड़े, तिल्ली, और मस्तिष्क, जबकि E1B isoform अस्थि मज्जा 5, 15 में माउस आंत, भ्रूण जिगर की कोशिकाओं, और erythroid अग्रदूत कोशिकाओं में व्यक्त की गई थी। नदी के ऊपर E1B से प्रमोटर, माउस आंत में Bcrp1 प्रतिलेखन गवर्निंग प्रमुख विकल्प प्रमोटर होना दिखाया गया था विनियमित कम से कम हिस्से में, phospho-चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन (पी-CREB) और एक CREB प्रतिक्रिया तत्व है कि वैकल्पिक करने के लिए अद्वितीय द्वारा Bcrp1 प्रमोटर 16। E1C mRNA isoform मुख्य रूप से वयस्क murine जिगर और गुर्दे 5 में व्यक्त किया जाता है। E1U isoform सबसे murine वृषण, जहां यह प्रबल isoform 5 व्यक्त की है के लिए छोड़कर परीक्षण किया ऊतकों में undetectable है। Bcrp1 चूहे वृषण में व्यक्त (वीर्योत्पादक endothelium, जहां यह देर चरण spermatids 4 की रक्षा कर सकते में) दोनों दैहिक (endothelial तंग जंक्शनों, peritubular myoid कोशिकाओं, और Sertoli कोशिकाओं) और रोगाणु कोशिकाओं में पाया जाता है। regआयन अपस्ट्रीम E1U से steroidogenic कारक-1 (एफ -1) 5 के लिए एक कार्यात्मक प्रतिक्रिया तत्व शामिल हैं। Bcrp1 mRNA और प्रोटीन स्पष्ट रूप से Sertoli सेल विशिष्ट एस एफ -1 पीटा चूहों के वृषण में कम हो रहे हैं, सुझाव है कि murine Sertoli कोशिकाओं में Bcrp1 अभिव्यक्ति एस एफ -1 5 से नियंत्रित किया जाता है।

विस्तार के तरीकों प्रस्तुत प्रोटोकॉल में सिलिको Bcrp1 के वैकल्पिक पहले एक्सॉनों पता लगाने के लिए, और नदी के ऊपर विकल्प पहले एक्सॉनों पहचान से ख्यात प्रमोटरों के लिए luciferase आधारित रिपोर्टर assays स्थापित करने के लिए।

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Protocol

1. Bcrp1 का पहला वैकल्पिक एक्सॉनों की सिलिको भविष्यवाणी में माउस ईएसटी डाटाबेस के विस्फोट के विश्लेषण का उपयोग

नोट: इस प्रोटोकॉल माउस व्यक्त अनुक्रम टैग (ईएसटी) अनुक्रम समानता के साथ ESTs Bcrp1 (जिसमें translational शुरू साइट) के 2 एक्सॉन के लिए डेटाबेस खोज और फिर कैसे कैसे पता लगाने के लिए जीनोमिक दृश्यों के लिए मिलान ईएसटी दृश्यों के लिए पंक्ति में वर्णन किया गया है उनके Bcrp1 एक्सॉन 2 के 5 'अंत करने के लिए माउस Bcrp1 जीन सापेक्ष में स्थान।

  1. , Ensembl जीनोम ब्राउज़र 17 की खोज विंडो में mRNA संदर्भ अनुक्रम आईडी (NM_011920.3) inputting द्वारा माउस Bcrp1 एक्सॉन 2 के लिए अनुक्रम प्राप्त पर क्लिक करें "जाओ।" अगले स्क्रीन में, एक पूर्ण लंबाई अनुक्रम (16 एक्सॉनों शामिल है) का चयन करें:
    1. अगले स्क्रीन ( "ट्रांसक्रिप्ट आधारित प्रदर्शन") में, "16 एक्सॉनों चयन करें।" यह एक स्क्रीन Bcrp1 के सभी एक्सॉनों के अनुक्रम युक्त प्रदर्शित करेगा। Bcrp1 की एक्सॉन 2 "पढ़ा होगा 59; -AAAGGC ... TATCAA -3 ' "प्राप्त संदर्भ 18 में दिखाया गया है उन लोगों के लिए समान हो जाएगा का परिणाम है।।
    2. "डाउनलोड अनुक्रम" विकल्प पर क्लिक करें। अगले स्क्रीन में, FASTA स्वरूप का चयन करें, और फिर क्लिक करें "पूर्वावलोकन।" अगले स्क्रीन में, क्लिपबोर्ड में एक्सॉन 2 का पूर्वावलोकन अनुक्रम की नकल।
  2. जैव प्रौद्योगिकी सूचना (एन सी बी आई) की वेबसाइट 20 के लिए राष्ट्रीय केंद्र पर विस्फोट मुखपृष्ठ 19 पर नेविगेट करें।
    1. का चयन करें "माउस" जीनोम। पेस्ट क्वेरी बॉक्स में क्लिपबोर्ड से एक्सॉन 2 अनुक्रम।
    2. , डेटाबेस लटकती से "ESTs" का चयन के लिए अनुकूलित "अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों," और फिर चुनें "विस्फोट।" भागो समय में कुछ मिनट का समय लगेगा। जब बम विस्फोट रन पूरा हो गया है, "परिणाम" पृष्ठ दिखाई देगा।
    3. "परिणाम" पेज के "विवरण" दूसरा नाम के तहत, "सभी," फिर "डाउनलोड," फिर "FASTA (पूराअनुक्रम) "लटकती में, और फिर चुनें" जारी रखें "एक .txt फ़ाइल दिखाई देगी;। खुला और क्लिपबोर्ड में पूरी फाइल कॉपी .txt फ़ाइल माउस Bcrp1 exon2 के साथ उच्च अनुक्रम समानता के साथ सभी ESTs के दृश्यों में शामिल है। लेकिन नहीं संबंध में अपनी स्थिति Bcrp1 जीन में 2 एक्सॉन के लिए।
      नोट: 15 अप्रैल, 2015 को प्रदर्शन विश्लेषण से 14 murine ESTs कि Bcrp1 एक्सॉन 2. साथ गठबंधन ये 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं की पहचान की।
  3. ईएसटी अनुक्रम है कि 5 'Bcrp1 जीन में 2 एक्सॉन के स्थान की पहचान। माउस Bcrp1 जीन गुणसूत्र 6 contig NC_000072.6 (: 372099104 सैनिक) में स्थित है।
    1. "विशिष्ट ब्लास्ट" दूसरा नाम के तहत बम विस्फोट के मुखपृष्ठ पर, का चयन "ब्लास्ट (bl2seq) का उपयोग कर दो (या अधिक) दृश्यों संरेखित करें।"
    2. क्वेरी बॉक्स में क्लिपबोर्ड से पाठ फ़ाइल पेस्ट और विषय अनुक्रम बॉक्स में 372099104 दर्ज करें। कार्यक्रम के तहत "अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों के लिए" अनुकूलनचयन, और चलाने के विस्फोट।
    3. एक बार परिणाम विंडो प्रकट होता है, रेखांकन "संरेखण" विंडो में "ग्राफिक्स" पर क्लिक करके संरेखण देखें। सही और बाएँ तीर का प्रयोग करें और Bcrp1 / Abcg2 और अनुक्रम संरेखण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ज़ूम।
    4. सहेजें अनुक्रम संरेखण: "सभी" का चयन करें "विवरण" बॉक्स में, तो "डाउनलोड" लटकती के तहत "मारो तालिका (सीएसवी)," चयन करें और फिर पर क्लिक करें "जारी है।" इस फ़ाइल में Bcrp1 एक्सॉन 2 के अनुक्रम संरेखण और Bcrp1 Exon2 के अनुक्रम समानता के साथ सभी ईएसटी दृश्यों माउस गुणसूत्र 6 contig में न्यूक्लियोटाइड की नंबरिंग के सापेक्ष के संरेखण में शामिल है। प्रत्येक को पूरा ईएसटी अनुक्रम Bcrp1 एक्सॉन 2 के साथ ओवरलैपिंग दृश्यों सहित 2 एक्सॉन के लिए क्षेत्रों 5 'और' 3 फैले कई संरेखण उत्पन्न हो सकता है।
    5. एक्सॉन 2 का 5 'अंत की स्थिति गुणसूत्र 6 contig में 58655638 न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप होगा के रूप में, के रूप में इस नामित1, और फिर 58,655,638 करने के लिए प्रत्येक ईएसटी 5 'के आंशिक दृश्यों की स्थिति की गणना। 14 ESTs के लिए परिणाम तालिका 1 में दिया जाता है।
      नोट: est दृश्यों कि 5 '+1 संभावित पहली एक्सॉनों के रूप में (यानी, एक नकारात्मक न्यूक्लियोटाइड मूल्य नहीं है) कर रहे हैं का विश्लेषण करने के लिए सावधान रहें। उदाहरण के लिए, ESTs कि Bcrp1 एक्सॉन 2 तालिका 1 (AI647825 और AI664571) में दिखाया गया के साथ गठबंधन में से दो में शेष अनुक्रम 2 एक्सॉन के लिए 3 'था।

2. Bcrp1 का मूल्यांकन वैकल्पिक प्रमोटर समारोह

  1. पत्रकार की डिजाइन Bcrp1 E1U, E1A, E1B और E1C प्रमोटरों के लिए constructs
    1. E1U के अनुक्रम खोज ईएसटी डेटाबेस से प्राप्त का उपयोग करना, +1 के रूप में E1U के पहले 5 'न्यूक्लियोटाइड नामित।
    2. एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) माउस गुणसूत्र 6 कि Bcrp1 / Abcg2 जीन अनुक्रम और अनुक्रम में कम से कम 100 केबी के अपस्ट्रीम में शामिल है के क्लोन प्राप्तBcrp1 / Abcg2 जीन (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची)।
      1. ऐसे luciferase संवाददाता प्लाज्मिड pGL3-बेसिक के रूप में एक उपयुक्त रिपोर्टर वेक्टर पहचानें।
      2. रिपोर्टर वेक्टर में कई क्लोनिंग साइटों का निर्धारण करते हैं। KpnI, SACI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII और HindIII उन्मुखीकरण '3' के लिए pGL3-बेसिक वेक्टर के कई क्लोनिंग साइट में प्रतिबंध endonuclease साइटों, 5 में हैं।
        नोट: पाचन साइटों के अनुक्रम कंपनियों है कि प्रतिबंध एंजाइमों के उत्पादन के उत्पाद सूची से उपलब्ध है।
      3. E1U एक्सॉन में सभी पाचन साइटों और 2 KB क्षेत्र 5 E1U ऐसे DNA5 के रूप में सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करने का 'पहचानें। pGL3-बेसिक कई क्लोनिंग साइट है कि E1U या 2 KB अपस्ट्रीम क्षेत्र में नहीं पाए जाते हैं में कम से कम दो पाचन साइटों को पहचानें।
        नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए आगे प्राइमर है कि रिवर्स प्राइमर के लिए चुने हुए एक के ऊपर है के लिए एक कई क्लोनिंग साइट प्रतिबंध साइट का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें कि डालने Wilएल उचित ओरिएंटेशन में किया जाना है।
    3. आगे तैयार है और है कि वाणिज्यिक जीन / प्राइमर संश्लेषण सेवाओं या प्राइमर का चयन सॉफ्टवेयर (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची) का उपयोग कर चुना pGL3-बुनियादी कई क्लोनिंग साइट प्रतिबंध endonuclease साइटों के लिए दृश्यों को शामिल पीसीआर के लिए प्राइमरों रिवर्स। एक आगे ~ 2 KB नदी के ऊपर स्थित E1U अनुक्रम और E1U अनुक्रम के भीतर एक रिवर्स प्राइमर से प्राइमर का चयन करें। लेखकों में इस्तेमाल प्राइमरों 'पिछले काम आगे प्राइमर में एक SACI साइट है, और रिवर्स प्राइमर में एक NheI साइट में शामिल किया है, और पहले 5 के साथ +64 करने के लिए लगभग -1906 से जीनोमिक क्षेत्र प्रवर्धित' के रूप में निर्दिष्ट E1U के न्यूक्लियोटाइड + 1 (ऊपर चरण 2.1.1 देखें), और संदर्भ 16 में प्रदान की जाती हैं।
      1. पीसीआर इन प्राइमरों का उपयोग, 0.01 बीएसी की 1 के लिए माइक्रोग्राम E1U जीनोमिक क्षेत्र बढ़ाना, और पीसीआर मास्टर मिश्रण पर denaturing के साथ उच्च निष्ठा Taq पीसीआर (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची) युक्त72 डिग्री सेल्सियस (2 मिनट) पर 30 सेकंड है, तो 35 से 40 पीसीआर के चक्र, विस्तार के साथ, और annealing और इस्तेमाल प्राइमरों के पिघलने विशेषताओं के आधार पर पिघलने तापमान के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
        नोट: उच्च निष्ठा Taq पीसीआर के उपयोग के उच्च जीसी सामग्री है कि अनुक्रमण प्रमोटर क्षेत्रों के लिए आवश्यक है। ऐसे टेम्पलेट के रूप में एक बीएसी के रूप में बड़े जीनोमिक डीएनए टुकड़े का उपयोग करते हैं, जीनोमिक डीएनए के माध्यमिक संरचना यह मुश्किल पीसीआर प्राइमरों बाध्य करने के लिए कर सकते हैं। इस समस्या पैदा होती है, तो बेहतर परिणाम पीसीआर अगर लंबे समय जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट पीसीआर प्रतिक्रिया से पहले sonication द्वारा धीरे sheared है प्राप्त किया जा सकता है।
      2. 0.8% TAE agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर एक 1 केबी डीएनए सीढ़ी के खिलाफ की तुलना द्वारा प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद की लंबाई की जाँच करें।
    4. पीसीआर उत्पाद प्राप्त की और pGL3-बेसिक वेक्टर डाइजेस्ट, प्रतिबंध का उपयोग कर प्रतिबंध पाचन आगे में पेश किया साइटों के लिए विशिष्ट endonucleases और भारतीय नौसेना पोत के अनुसार प्राइमरों रिवर्सप्रतिबंध पाचन एंजाइमों के साथ आपूर्ति tructions।
      1. वाणिज्यिक एसवी जेल और पीसीआर क्लीन अप सिस्टम किट (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची), किट प्रोटोकॉल 21 के बाद का उपयोग कर पाचन प्रतिक्रियाओं शुद्ध।
        1. , काटा हुआ वेक्टर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर के खिलाफ तुलना करके पाचन और वेक्टर के linearization सत्यापित करें तो कट और पचा वेक्टर डीएनए बैंड शुद्ध। शुद्ध पीसीआर उत्पाद की एकाग्रता और शुद्ध वेक्टर यूवी स्पेक्ट्रोमेट्री (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची) का उपयोग उपाय।
    5. शुद्ध ligating द्वारा E1U संवाददाता का निर्माण तैयार करें, प्रतिबंध एंजाइम पचा पीसीआर उत्पाद और pGL3-बेसिक जुगनू luciferase संवाददाता वेक्टर (संवाददाता परख किट में निहित, सामग्री की सूची और उपकरण देखें) डालने पर: 11, 21 और 31 के अनुपात में वेक्टर, "टी -4 डीएनए ligase त्वरित बंधाव किट" का उपयोग किट निर्देश 22 के अनुसार, जिससे E1U आर उत्पादनeporter निर्माण, pGL3-E1U नाम दिया है।
      1. बैक्टीरिया को बदलने के लिए pGL3-E1U प्लाज्मिड प्रयोग clonally टीए क्लोनिंग किट में pGL3-E1U निम्नलिखित निर्देशों का विस्तार करने के लिए (सामग्री और उपकरणों की सूची देखें)।
      2. अनुक्रम विश्लेषण द्वारा उन्मुखीकरण और डालने की निष्ठा की पुष्टि करें।
    6. तैयार संवाददाता E1U के लिए के रूप में इसी पद्धति का उपयोग E1A, E1B और E1C के लिए निर्माण करती है। खंड 2.1.5.2 में के रूप में अनुक्रमण द्वारा सम्मिलित की निष्ठा की पुष्टि करें।
      नोट: E1A, E1B और E1C के लिए प्रमोटर सम्मिलित होना चाहिए लगभग -1875 / + 10, -1847 / 60, और -1904 / + 83 E1A, E1B के पहले 5 'न्यूक्लियोटाइड (+1 के रूप में नामित) के सापेक्ष, या E1C, क्रमशः।
  2. संवाददाता परख तरीकों
    नोट: संवाददाता assays के सामान्य रणनीति: एक जीन की ख्यात प्रमोटर (5 'अपस्ट्रीम क्षेत्र) एक खाली "रिपोर्टर" वेक्टर है कि एक "reporte होता है की कई क्लोनिंग साइट में डाला जाता हैआर जीन "(जैसे, जुगनू luciferase) नीचे की ओर कई क्लोनिंग साइट से। वेक्टर तो कोशिकाओं है कि ब्याज की जीन एक्सप्रेस में ट्रांसफ़ेक्ट है। पार अभिनय कारक है कि इन कोशिकाओं में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देने को सक्रिय करना चाहिए ट्रांसफ़ेक्ट रिपोर्टर वेक्टर में प्रमोटर, जुगनू luciferase, जो आसानी से एक luminescence परख के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की अभिव्यक्ति के कारण।
    1. संवाददाता परख के लिए उपयोग करने के लिए उचित सेल लाइन का चयन करें।
      नोट: E1U विकल्प प्रमोटर संवाददाता का निर्माण की गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए, यह transfect करने के लिए है कि कोशिकाओं है कि E1U प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Bcrp1 एक्सप्रेस में निर्माण आवश्यक है। TM4 murine Sertoli सेल लाइन (देखें सामग्री की सूची और उपकरण) Bcrp1 प्रोटीन व्यक्त किया और Bcrp1 mRNA E1U, साथ ही E1A, E1B, और E1C 5 से युक्त। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक सेल लाइन है कि Bcrp1 प्रोटीन या mRNA व्यक्त नहीं करता प्रयोग करने पर विचार।
    2. संस्कृति TM4 सीई200,000 कोशिकाओं का एक प्रारंभिक घनत्व / में अच्छी तरह से एक 1 पर 24 अच्छी तरह प्लेटें में lls: हाम F12 मध्यम और Dulbecco संशोधित ईगल 1.2 ग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ मध्यम के 1 मिश्रण, 15 मिमी HEPES 5% घोड़े सीरम के साथ पूरक, 2.5% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन (100 आइयू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल), 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में, जैसा कि पहले 5 में वर्णित है।
    3. छह घंटे संस्कृति में कोशिकाओं रखने के बाद, खाली pGL3-बुनियादी वेक्टर के 0.2 माइक्रोग्राम प्रति के साथ या 0.2 माइक्रोग्राम -1906 / + 64 E1U या -1875 / + 10 E1A या -1847 / 60 E1B युक्त pGL3 वेक्टर के साथ कोशिकाओं transfect या -1904 / + 83 E1C BCRP 1 विलोपन पीआरएल-टी (एक Renilla luciferase व्यक्त वेक्टर) आंतरिक नियंत्रण के रूप में की 4 एनजी के साथ-साथ निर्माण, एक वाणिज्यिक डीएनए अभिकर्मक किट और निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर 23 (सामग्री और उपकरणों की सूची देखें) ।
    4. 30 घंटा के निम्नलिखित अभिकर्मक, संस्कृतियों से विकास मीडिया को दूरएड ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं। पीबीएस के 200 μl के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, फिर धो समाधान निकालने।
      1. जुगनू उपाय और Renilla luciferase गतिविधि निर्माता के प्रोटोकॉल 24 के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का उपयोग।
    5. जुगनू luciferase गतिविधि आंतरिक (Renilla luciferase) के नियंत्रण से विभाजित के अनुपात के रूप में प्रत्येक ट्यूब के लिए गतिविधि व्यक्त; समग्र परिणाम आम तौर पर व्यक्त कर रहे हैं के रूप में प्रत्येक रिपोर्टर की गतिविधि को खाली pGL3 बुनियादी वेक्टर, जो 1 के एक मूल्य दिया जाता है साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की है कि रिश्तेदार का निर्माण।

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Representative Results

नेता एक्सॉनों के विश्लेषण के द्वारा माउस वृषण में BCRP 1 विकल्प प्रमोटर उपयोग की पहचान

जब एन सी बी आई पर ईएसटी डेटाबेस की जांच की गई थी (अप्रैल 2015) कदम प्रोटोकॉल 1 में उल्लिखित का उपयोग कर, ESTs पाया कि BCRP में एक्सॉन 2 के 5 'अंत के साथ सटे थे 1 mRNA तालिका 1 में दिखाया जाता है, जीनोमिक में अपनी स्थिति के साथ-साथ एक्सॉन 2. एक ईएसटी C57BL / 6J माउस वृषण कि BCRP 1 में 2 एक्सॉन को mRNA एक्सॉन 2 से जीनोमिक डीएनए 70 केबी अपस्ट्रीम में दृश्यों है सन्निहित है, E1U (तालिका 1) के लिए इसी से व्युत्पन्न की शुरुआत करने के लिए डीएनए रिश्तेदार। इसी तरह, E1A, E1B, और E1C करने के लिए इसी ESTs पाया गया। टिप्पणी की है कि E1C को इसी दो ESTs भी E1C के 5 'अंत करने के लिए spliced ​​E1B निहित है। इन भविष्यवाणी की पहली एक्सॉनों के स्थानमाउस गुणसूत्र 6 पर Bcrp1 एक्सॉन 2 के संबंध चित्र 1 में दिखाया गया है।

BCRP 1 विकल्प प्रमोटर समारोह का मूल्यांकन

E1U, E1A करने के लिए इसी विशिष्ट luciferase परख परिणाम, E1B और E1C प्रमोटर-luciferase संवाददाता निर्माणों TM4 murine Sertoli कोशिकाओं (धारा 2.2 देखें) में ट्रांसफ़ेक्ट चित्रा 2A में दिखाया जाता है।

पिछले काम में, एक एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व E1U प्रमोटर 5 में होने की भविष्यवाणी की थी। इस ख्यात एस एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व माउस वृषण में Bcrp1 प्रतिलेखन के विनियमन में शामिल है, तो उत्परिवर्तन E1U प्रमोटर संवाददाता का निर्माण में उस प्रतिक्रिया तत्व की (पिछले कागज 5 में वर्णित) luciferase गतिविधि है कि निर्माण के द्वारा उत्पादित कम हो जाएगा जब में ट्रांसफ़ेक्टTM4 कोशिकाओं। एक ठेठ प्रयोग के परिणाम चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है। उत्परिवर्तित निर्माण, संयुक्त राष्ट्र के उत्परिवर्तित निर्माण की तुलना में कम luciferase गतिविधि से पता चलता गतिविधि खाली pGL3-बुनियादी वेक्टर के बराबर के साथ एस एफ -1 के लागू अभिव्यक्ति (पिछले एक कागज 5 में वर्णित) के साथ कोशिकाओं में भी। एफ -1 के लागू अभिव्यक्ति संयुक्त राष्ट्र के उत्परिवर्तित निर्माण की गतिविधि बढ़ जाती है, लेकिन नहीं उत्परिवर्तित एक का है।

आकृति 1
चित्रा 1। Murine गुणसूत्र 6. ये संरेखण एक dbEST बम विस्फोट खोजें अप्रैल में प्रदर्शन में पहचान की गई साथ Bcrp1 एक्सॉन से 2 अनुक्रम पहचान के साथ ESTs के जीनोमिक संरेखण के आरेख, 2015 को चार अलग संरेखण, पाए गए Bcrp1 करने के लिए वैकल्पिक पहले एक्सॉनों E1U, E1A इसी E1B, और E1C। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन 5 से reproduced है।

चित्र 2
चित्रा 2। Bcrp1 प्रमोटरों के लिए (ए) संवाददाता परख E1U, E1A, E1B, और BALB / ग Sertoli सेल व्युत्पन्न TM4 कोशिकाओं में E1C। डाटा, जुगनू luciferase की luminescence Renilla luciferase की है कि सामान्य रूप में व्यक्त कर रहे हैं खंड में वर्णित 2. दिखाया गया डेटा तरीकों मतलब है और तीन अलग-अलग प्रयोगों के मानक विचलन, अलग अलग दिनों पर किया प्रयोग कर रहे हैं। तारांकन खाली pGL3 वेक्टर टी -Test (पी <0.01) का उपयोग नियंत्रण से एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन 5 से reproduced है। (बी) Bcrp1 E1U पुनः में एस एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व का उत्परिवर्तन का प्रभावकुली luciferase गतिविधि पर निर्माण। Bcrp1 संवाददाता ख्यात एस एफ -1 बाध्यकारी क्षेत्र के साथ constructs (उत्परिवर्तित या संयुक्त राष्ट्र उत्परिवर्तित) के साथ TM4 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट थे (एफ -1 ट्रांसफ़ेक्ट) और (ट्रांसफ़ेक्ट वेक्टर) दिखाया एस एफ 1. डेटा के लागू अभिव्यक्ति बिना मतलब हैं 3 अलग प्रयोगों के, अलग अलग दिनों पर किया; त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक प्रयोग के लिए, व्यक्तिगत assays के दो प्रतियों में किया गया। (बी) के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का प्रतीक E1U प्रमोटर टी -Test का उपयोग कर निर्माण की तुलना में (पी <; चित्र में, (ए) (पी <0.05) टी -Test का उपयोग कर खाली वेक्टर pGL3 नियंत्रण से एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है 0.05)। यह आंकड़ा पिछले एक प्रकाशन 5 से reproduced है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


तालिका 1। Bcrp1 25 -28 के दूसरे एक्सॉन के अनुक्रम के खिलाफ माउस ईएसटी डेटाबेस के ब्लास्ट खोज। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तरीकों और प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत की बहुमत पिछले काम का हकदार है जो 2013 5 में प्रकाशित किया गया था "माउस वृषण में बी crp1 प्रतिलेखन एक उपन्यास पहली एक्सॉन (E1U) steroidogenic कारक -1 द्वारा विनियमित, नदी के ऊपर एक प्रमोटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है" में वर्णित । यहाँ दर्शाया प्रतिनिधि परिणामों के अलावा, पिछले पेपर वैकल्पिक पहले एक्सॉन 5'-दौड़ पीसीआर और आरटी पीसीआर पद्धति का उपयोग कर उपयोग का अनुमान प्रदान की है। इसके अलावा, में सिलिको प्रमोटर E1U से अपस्ट्रीम में एक ख्यात एस एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व की पहचान से पूरा किया गया था, और chromatin immunoprecipitation (चिप) assays दिखा दिया है कि एफ -1 ख्यात एस एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व के लिए बाध्य। कार्यात्मक अध्ययन से पता चला है कि murine Sertoli कोशिकाओं में, BCRP 1 प्रतिलेखन E1U प्रमोटर में एस एफ -1 प्रतिक्रिया तत्व के माध्यम से एस एफ -1 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ये कार्यात्मक अध्ययन टीआरए द्वारा TM4 कोशिकाओं में एस एफ -1 की upregulation शामिलnsfection या एक हिस्टोन deacetylase अवरोध (vorinostat), जो BCRP 1 E1U mRNA की अभिव्यक्ति बढ़ाया में हुई, और एक पत्रकार परख में BCRP 1 प्रोटीन में वृद्धि के साथ-साथ BCRP 1 E1U प्रमोटर की गतिविधि के उपयोग के द्वारा। अंत में, इन अध्ययनों सबूत है कि वयस्क Sertoli सेल विशिष्ट एस एफ -1 पीटा चूहों से वृषण में, BCRP 1 E1U mRNA की अभिव्यक्ति, कुल BCRP 1 mRNA, और Bcrp1 प्रोटीन स्पष्ट रूप से कम हो रहे थे 5 प्रदान की है। एक ही काम भी गुर्दे, जिगर, वृषण, मस्तिष्क, हृदय, फेफड़े, मांसपेशियों, और तिल्ली 5 सहित murine ऊतकों की एक किस्म में Bcrp1 mRNA isoforms की अभिव्यक्ति पैटर्न की सूचना दी।

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है - एक मॉडल के रूप में BCRP 1 के ऊतक विशेष विनियमन का उपयोग कर - किसी भी जीन के transcriptional जटिलता को जानने के लिए अपने अंतर निर्धारित करने के लिए एक सतही प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करते हैंविभिन्न ऊतकों या सेलुलर उपप्रकारों में अभिव्यक्ति। यह जोर दिया जाना चाहिए में सिलिको मूल्यांकन के लिए वर्णित प्रोटोकॉल कदम से प्राप्त परिणामों के समय पर निर्भर विभिन्न वेबसाइटों है कि सॉफ्टवेयर और इस्तेमाल को बदलने के लिए विषय हो सकता है डेटाबेस के घर के बाद हो सकता है। में सिलिको यहाँ प्रस्तुत पद्धति खोज ईएसटी डेटाबेस (dbEST) के रूप में पहले से 29 की सूचना दी है, जो अनुमान लगाया गया है कि ईएसटी डाटासेट में सभी मानव जीन का लगभग 18% वैकल्पिक प्रमोटरों को रोजगार का इस्तेमाल करता। सर्च कर रहे हैं dbEST विकल्प पहले एक्सॉनों नजरअंदाज कर सकते हैं, क्योंकि अन्य जांचकर्ताओं - एक "oligo-कैपिंग" पद्धति से कई मानव ऊतकों से cDNAs की 1.8 मिलियन 5'-अंत दृश्यों का उत्पादन करने के लिए - मानव जीन और अनुमान के लिए ख्यात ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों की पहचान करने में सक्षम थे अध्ययन मानव RefSeq जीन की है कि 52% संभवतः वैकल्पिक प्रमोटरों 1 द्वारा विनियमित रहे थे। दिलचस्प है, बाद के अध्ययन में पाया गया है किऊतकों कि उपयोग किया ख्यात वैकल्पिक प्रमोटरों सबसे थे वृषण और मस्तिष्क; इसके अलावा, उन्होंने पाया कि पारगमन मार्ग संकेत से संबंधित प्रोटीन एन्कोडिंग जीन अधिक ऊतक विशेष वैकल्पिक प्रमोटरों 1 को रोजगार की संभावना थे। कमियां उल्लेख के बावजूद, dbEST न्यूनतम प्रयास के साथ कई ऊतकों में एक विशेष जीन के लिए 5 'UTR उपयोग के लिए किसी न किसी अवलोकन प्रदान विश्लेषण करती है।

हालांकि dbEST विश्लेषण विकल्प पहली एक्सॉन के उपयोग पर एक सतही झलक प्रदान करता है, हम अत्यधिक जांच के तहत एक ऊतक या सेल लाइन में पहली एक्सॉन उपयोग सत्यापित करने के लिए 5 'सीडीएनए समाप्त होता है (5'-दौड़) विश्लेषण के तेजी से प्रवर्धन प्रदर्शन सलाह देते हैं। वाणिज्यिक किट निर्माता द्वारा प्रदान की विस्तृत और सरल प्रक्रियाओं के साथ, 5'-दौड़ के लिए उपलब्ध हैं (सामग्री और उपकरणों की सूची देखें)। हालांकि कुछ समय लगता है, 5'-दौड़ के अध्ययन उपस्थिति का वास्तविक अनुमान के साथ ही वैकल्पिक पहले पूर्व के अनुक्रम प्रदानब्याज की mRNA में ons; इसके अलावा, कई ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों की उपस्थिति भी 13 से पता लगाया जा सकता है। पर्याप्त प्रतिनिधित्व आश्वस्त करने के लिए है, कम से कम 15 से 25 क्लोन की अनुक्रमण आवश्यक है। अनुक्रमण से पहले, यह 5 'रेस उत्पादों से दूषित वेक्टर दृश्यों को दूर करने के लिए आवश्यक है। अगर ऐसा नहीं किया जाता है, विस्फोट विश्लेषण माउस जीनोम के साथ एक दृश्य संरेखण पता लगाने के लिए पूरी तरह से विफल हो सकता है। एक बार पहले एक्सॉन उपयोग की स्थापना की है, 5'-दौड़ निष्कर्षों विकल्प पहले एक्सॉनों के लिए बाद में मात्रात्मक आरटी पीसीआर assays मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, 'लेखक पिछले काम पाया पहला एक्सॉन mRNA 5'RACE द्वारा बरामद क्लोन का प्रतिशत और एक ही ऊतक या सेल लाइन 5 से किसी दिए गए विकल्प पहली एक्सॉन के लिए बरामद पीसीआर उत्पाद के प्रतिशत के बीच अच्छे संबंध है। इसके अतिरिक्त, अच्छा संबंध वैकल्पिक Bcrp1 प्रमोटरों के लिए luciferase प्रमोटर निर्माणों की गतिविधियों के बीच पाया गया था एकएन डी एक विशेष सेल लाइन 5 में इसी विकल्प पहली एक्सॉन की अभिव्यक्ति।

ऊतक विशेष विकल्प प्रमोटर के उपयोग के लिए खोज में, पूरे अंगों उपयोग किया जाता है, तो एक के बारे में पता है कि वैकल्पिक प्रवर्तकों / पहली बार पाया एक्सॉनों ऐसे ग्रंथियों के तत्वों, रक्त वाहिकाओं, स्ट्रोमा, आदि के लिए के रूप में अंग के ऊतकों विविधता को प्रतिबिंबित करेगा होना चाहिए उदाहरण के लिए, वृषण दैहिक (लेडिग, Sertoli, myoid, और endothelial) कोशिकाओं और कीटाणु (अगुणित) कोशिकाओं, साथ ही वाहिका का एक मिश्रण है। ऊतक विशेष पहली एक्सॉन अभिव्यक्ति के लिए जांच करने के लिए, यह अंगों से विशिष्ट ऊतकों को अलग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।

अन्य तरीकों विकल्प प्रमोटर के उपयोग और विनियमन की पहचान के लिए सूचित किया गया है; हालांकि, इन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण आवश्यकता होती है और जैव सूचना विज्ञान उत्पादित डेटा की बड़ी मात्रा का विश्लेषण करने में सक्षम कंप्यूटिंग। इन विधियों पूरे transcriptosome अनुक्रमण (आरएनए seq), और की चिप-सेक में शामिलऐसे H3K4me3, जो प्रमोटरों से 30 रियायत के रूप में बांधता है histones। हालांकि इन तरीकों डी-नोवो प्रदर्शन करने के लिए, जब ध्यान में कुछ विशिष्ट जीन और ऊतकों की अभिव्यक्ति पर है महंगा हो सकता है, मौजूदा आंकड़ों का खनन एक और अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण हो सकता है।

यहाँ प्रस्तुत प्रमोटर गतिविधि का आकलन करने के लिए assays pGL3-बुनियादी वेक्टर, जो जुगनू luciferase जीन से नदी के ऊपर एक कई क्लोनिंग क्षेत्र शामिल है रोजगार। प्रमोटर गतिविधि एक वाणिज्यिक luminometer (देखें सामग्री और उपकरणों की सूची) में, जुगनू luciferase है, जो आसानी मात्रा निर्धारित है के उत्पादन से मापा जाता है सहकारकों के अलावा और एक luminescent सब्सट्रेट के बाद, luminescence के माप से। संबंधित pGL4 वेक्टर stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के उत्पादन को सक्रिय करने, चयन मार्कर (जैसे, neomycin, hygromycin, puromycin) को रोकने के लिए बनाया जा सकता है। इस पत्र में दी प्रोटोकॉल क्षणिक अभिकर्मक का उपयोग। आमतौर पर, promot के लिए रिपोर्टर assaysएर गतिविधि एक वेक्टर कि अनिवार्यता से व्यक्त करता है Renilla (सागर स्रीवत) luciferase (पीआरएल-टी) के साथ सह-अभिकर्मक का उपयोग कर, सेल नंबर में बदलाव और अभिकर्मक की क्षमता को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। किसी जीन के लिए एक प्रमोटर परख स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करें कि ब्याज की जीन सेल लाइन है कि संवाददाता का निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है में व्यक्त किया जाता हो रहा है। दूसरे, जब वैकल्पिक प्रमोटर उपयोग मौजूद है, यह महत्वपूर्ण प्रमोटर का निर्माण है कि वैकल्पिक पहले एक्सॉन ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइन में व्यक्त करने के लिए संगत का उपयोग करने के लिए है। उदाहरण के लिए, E1U प्रमोटर का निर्माण है कि कोशिकाओं है कि केवल E1B प्रमोटर के नियंत्रण के तहत Bcrp1 एक्सप्रेस में ट्रांसफ़ेक्ट है के लिए luminescence देखने की उम्मीद नहीं है। वैकल्पिक रूप से, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, रिपोर्टर की अभिकर्मक एक सेल लाइन व्यक्त नहीं करता है कि जीन या ब्याज की mRNA isoform जुगनू luciferase की कोई उत्पादन में परिणाम चाहिए में निर्माण।

गवैकल्पिक प्रमोटर उपयोग के onsequences ही प्रोटीन का उत्पादन, अलग-एन Termini, या अलग प्रोटीन 29 के उत्पादन के साथ प्रोटीन के उत्पादन में शामिल हैं। Bcrp1 / BCRP, कई के मामले में (ऊतक या सेल प्रकार विशिष्ट) प्रमोटरों ही प्रोटीन के उत्पादन को नियंत्रित करते हैं। एक समान पैटर्न CYP19 (aromatase) जीन 29, 31 के लिए मौजूद है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बुनियादी कदम एक ब्याज की एक प्रोटीन के transcriptional नियंत्रण के जटिल तंत्र एक ऊतक या सेल लाइन में समझने के लिए उपयोग कर सकते हैं प्रदान करते हैं।

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Disclosures

डगलस डी रॉस और मैरीलैंड विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर मानव BCRP करने के लिए पेटेंट अधिकार का आयोजन करेगा।

Acknowledgments

इस काम डगलस डी रॉस और दिग्गजों मामलों के विभाग से आरिफ हुसैन को मेरिट समीक्षा पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kit Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies AM1700 5'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kit Life Technologies K450001 This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kit New England Biolabs M2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase Sigma-Aldrich/Roche 3553400001/RMB-4738284001  Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagent Roche 6366236001
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1910 Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprep Qiagen 27104 For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vector part of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vector Promega E1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vector Promega E2241
Bacterial artificial chromosome BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA RP23-285A12 and RP24-314E24 http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol Life Technologies 15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALS Denville Scientific V9012
SOFTWARE:
Ensembl software Ensembl project http://Ensembl.org  The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast software NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software Simgene http://simgene.com/Primer3 Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cells ATCC, Manassas, Virginia CRL-1715™
INSTRUMENTS:
Luminometer Turner Biosystems TD-20/20 This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometers Thermo Scientific, Inc. NanoDrop 2000 Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA DU 800

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References

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