Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

Biology

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Summary

Mit dem murinen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als Beispiel in-silico - Protokolle werden dargestellt , um alternative Promotor Gebrauch in Gene in Mausgeweben exprimiert erkennen und die Funktionalität der alternativen Promotoren unter Verwendung von Reporter - Assays identifiziert , zu bewerten.

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Natarajan, K., Xie, Y., Nakanishi, T., Moreci, R. S., Jeyasuria, P., Hussain, A., Ross, D. D. Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1. J. Vis. Exp. (111), e53827, doi:10.3791/53827 (2016).

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Abstract

Genexpression in verschiedenen Geweben wird häufig durch alternative Promotoren gesteuert, die bei der Synthese der mRNA resultieren mit einzigartigen - in der Regel nicht-translatierten - erste Exons. Bcrp1 (ABCG2), der murine Ortholog des Protein ABC transporter Breast Cancer Resistance (BCRP, ABCG2) hat mindestens vier alternative Promotoren, die von den entsprechenden vier alternativen ersten Exons hergestellt bezeichnet sind: E1U, E1A, E1B und E1C. Hier in-silico - Protokolle werden vorgestellt für Bcrp1 alternative Promotor Gebrauch zu prognostizieren. Weiterhin sind, reporter Assayverfahren beschrieben Reporterkonstrukten für alternative Promotoren zu erzeugen, und die Funktionalität von putativen Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu bestimmen, die gekennzeichnet sind.

Introduction

Mehr als die Hälfte der menschlichen Gene sind 1 durch alternative Promotoren geregelt. Jede alternative Promotor kann regulatorische Elemente enthalten, die sich von denen in anderen alternativen Promotoren voneinander verschieden sein können. Der Promotor (en) in einem Gewebe verwendet werden, können sich von denen in einem anderen Gewebe verwendet werden, unterscheiden. Beispielsweise ist es möglich, dass die Aktivierung eines bestimmten Signalwegs die alternative Promotor für ein Gen in einem Gewebe verwendet auslösen können, aber keine Wirkung auf oder eine separate alternative Promotor für das gleiche Gen unterdrücken, die in einem anderen Gewebe verwendet wird.

Expression des Gens wird durch Bcrp1 alternative Promotoren geregelt. Bcrp1 ist die murine Ortholog des menschlichen Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) -Gen. BCRP ist ein ATP-bindenden Kassette (ABC) Transporter, förmlich festgelegten ABCG2 2, 3. Als apikalen Plasmamembranprotein, BCRP / Bcrp1 Funktionen eine Vielzahl von natürlichen und xenobiotic Substrate Ausströmen 3, 4. Bei Menschen und Mäusen, BCRP / Bcrp1 ist hoch in pharmakologisch relevanten Organe wie Leber (Gallenkanälchen), Darm und Niere, sowie Organe mit Blut-Gewebe - Barrieren wie Placenta, Hirn und Hoden 2 ausgedrückt, 5-12. Expression von BCRP / Bcrp1 in hämatopoetischen und anderen Stammzellen, einschließlich Krebsstammzellen kann Resistenz dieser Zellen Xenobiotika und Krebs chemotherapeutischen Medikamenten verleihen 3.

In frühen Arbeiten die Regulierung der BCRP - Expression in normalen und neoplastischen Zellen, 5 'RACE-PCR (5'-RACE) Analyse der BCRP mRNA zu verstehen , wurde durchgeführt , seine genaue Transkriptionsstartstelle 13 zu bestimmen. Nicht nur waren mehrere Transkriptionsstartstellen gefunden; waren ebenfalls drei alternative Formen des ersten Exons, die in BCRP-untranslatierten auftritt. Diese alternativen ersten Exons - bezeichnet E1a, E1b, E1c - wurden unterschiedlich in einer Vielzahl von menschlichen Geweben exprimiert. Zwei weitere erste Exon - Varianten wurden in einer BLAST - Suche der menschlichen EST - Datenbank unter Verwendung des zweiten Exon von BCRP 13 entdeckt. Vier Begegnungen ergab eine erste Exon> 70 kb stromaufwärts von Exon 2, die E1U bezeichnet wurden; vier anderen Spielen ergab BCRP mRNA , die ein erstes Exon völlig fehlte, die E1- 13 bezeichnet wurden. Das Vorhandensein alternativer Führer Exons wird als 14 eine Manifestation von alternativen Promotor Nutzung zu sein.

Bei Mäusen vier alternative erste Exons von Bcrp1 beschrieben , die auf alternative Promotoren entsprechen , die Bcrp 1 Transkription in verschiedenen Geweben der Maus steuern; Diese Exons / Promotoren bezeichnet werden E1U, E1A, E1B und E1C und sind etwa 70, 58, 15 und 5 kb stromaufwärts von Exon 2 Bcrp1 5, 15 befindet. Die E1A mRNA Isoform wurde vorherrschend in Murin gefundene hämatopoetischen Stammzellen, Herz, Lunge, Milz und Gehirn, während die E1B - Isoform in Mausdarm, fetales exprimiert wurde , Leberzellen und erythroiden Vorläuferzellen in Knochenmark 5, 15. Der Promotor stromaufwärts von E1B wurde gezeigt, dass die Haupt alternative Promotor regeln Bcrp1 Transkription in Mausdarm zu sein, zumindest teilweise geregelt, indem phospho-zyklisches-AMP-Antwortelement bindendes Protein (p-CREB) und einem CREB-Response-Element einzigartig für diese alternative Bcrp1 Promotor 16. Die E1C mRNA Isoform überwiegend bei erwachsenen Maus - Leber und Niere 5 ausgedrückt. Die E1U Isoform ist nicht nachweisbar in den meisten getesteten Geweben mit Ausnahme von Mäusehoden, wo sie die vorherrschende Isoform 5 ausgedrückt. Bcrp1 ausgedrückt in Hoden von Ratten in beiden somatischen (endothelial tight junctions, peritubulären myoid Zellen und Sertoli - Zellen) gefunden und Keimzellen (in der seminiferous Endothel, wo es im Spätstadium spermatids 4 schützen kann). Die regIonen stromaufwärts von E1U enthält eine funktionelle Antwortelement für steroidogenen factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA und Protein werden in den Hoden von Sertoli zellspezifischen SF-1 - Knockout - Mäusen deutlich reduziert, was darauf hindeutet , dass Bcrp1 Expression in murinen Sertoli - Zellen durch SF-1 gesteuert wird , 5.

Die Protokolle Detail Methoden vorgestellt alternativen ersten Exons von Bcrp1 in-silico zu detektieren und identifiziert Luciferase-basierten Reporterassays für putative Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu etablieren.

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Protocol

1. In Silico Vorhersage von alternativen ersten Exons von Bcrp1 Mit BLAST - Analyse von Maus - EST - Datenbank

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt, wie die Maus ausgedrückt Sequenz-Tag (EST) Datenbank für ESTs mit Sequenzähnlichkeit zu suchen, um Exon 2 von Bcrp1 (die die Translationsstartstelle enthält) und dann, wie die passenden EST-Sequenzen zu genomischen Sequenzen auszurichten ihre zu ermitteln Lage in der Maus Bcrp1 Gen in Bezug auf das 5'-Ende von Bcrp1 Exon 2.

  1. Erhalten Sie die Sequenz für Maus Bcrp1 Exon 2 durch die mRNA Referenzsequenz ID Eingeben (NM_011920.3) in das Suchfenster des Ensembl Genome Browser 17, klicken Sie auf "GO" . Im nächsten Fenster wählen Sie eine Sequenz in voller Länge (enthält 16 Exons):
    1. Im nächsten Bildschirm ( "Transcript-basierte Display"), wählen Sie "16 Exons." Dadurch wird ein Fenster, das die Sequenz aller Exons von Bcrp1 anzuzeigen. Exon 2 von Bcrp1 erscheint "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "Die Ergebnisse werden in ähnlichen Bezugszeichen 18 gezeigt , solche , die erhalten..
    2. Klicken Sie auf den "Download-Sequenz" -Option. Im nächsten Fenster wählen Sie das FASTA-Format, und klicken Sie dann auf "Vorschau". Im nächsten Fenster kopieren Sie die Vorschau-Sequenz von Exon 2 in die Zwischenablage.
  2. Navigieren Sie zu dem BLAST - Homepage 19 am National Center for Biotechnology Information (NCBI) Webseite 20.
    1. Wählen Sie "Maus" Genom. Fügen Sie den Exon-2-Sequenz aus der Zwischenablage in das Suchfeld eingeben.
    2. Wählen Sie "ESTs" aus der Datenbank Dropdown-Liste optimieren für "sehr ähnliche Sequenzen", und wählen Sie dann "BLAST". Laufzeit wird ein paar Minuten dauern. Wenn der BLAST Lauf abgeschlossen ist, wird die "Ergebnisse" Seite angezeigt werden.
    3. Im Rahmen der "Beschreibungen" Hierher der Seite "Ergebnisse", wählen Sie "ALL", dann "Download" und dann "FASTA (komplettSequenz) "in der Dropdown-Liste, und wählen Sie dann" Weiter "eine .txt-Datei erscheint,. geöffnet und die gesamte Datei in die Zwischenablage kopieren Die TXT-Datei mit der Maus Bcrp1 exon2 die Sequenzen aller ESTs mit hoher Sequenzähnlichkeit enthält. aber nicht in Bezug ihre Position 2 in dem Bcrp1 Gen Exon.
      Hinweis: Eine Analyse durchgeführt , am 15. April 2015 14 Maus - ESTs identifiziert , die ausgerichtet mit Bcrp1 Exon 2. Diese sind in Tabelle 1 aufgeführt sind.
  3. Identifizieren die Position der EST-Sequenz, die 5 '2 in der Bcrp1 Gen Exon. Die Maus Bcrp1 Gen in dem Chromosom 6 contig NC_000072.6 (: 372.099.104 GI) befindet.
    1. Auf der BLAST-Homepage unter der "Specialized Explosion" Hierher, wählen Sie "Richten Sie zwei (oder mehr) Sequenzen unter Verwendung von BLAST (bl2seq)."
    2. Fügen Sie die Textdatei aus der Zwischenablage in das Suchfeld eingeben und geben Sie 372099104 in der Betreff-Sequenz-Box. Optimieren Sie für "sehr ähnliche Sequenzen" unter ProgrammAuswahl und führen BLAST.
    3. Sobald das Ergebnisfenster erscheint, sehen Sie grafisch die Ausrichtungen durch einen Klick auf "Grafik" in der "Alignments" Fenster. Verwenden Sie die rechte und linke Pfeile und Zoom auf Bcrp1 / ABCG2 und die Sequenz-Alignments zu konzentrieren.
    4. Speichern Sie die Sequenz-Alignments: Wählen Sie "ALL" in der "Beschreibungen" Box, dann unter dem "Download" Drop-Down wählen Sie "Hit-Tabelle (CSV)" und klicken Sie dann auf "Weiter". Diese Datei enthält die Sequenz-Alignment von Bcrp1 Exon 2 und die Ausrichtung aller EST-Sequenzen mit Sequenz-Ähnlichkeit zu Bcrp1 Exon2 bezogen auf die Numerierung der Nukleotide in dem Maus-Chromosom 6 Contig. Jede vollständige EST-Sequenz möglicherweise mehrere Ausrichtungen Spanning Regionen 5 'und 3' zu generieren 2 einschließlich der Sequenzen, Exon Überlappung mit Bcrp1 Exon 2.
    5. Da die Position des 5'-Ende von Exon 2 58.655.638 bis Nukleotid in dem Chromosom 6 contig entsprechen wird, bezeichnen dies als+1 Und dann berechnen die Position der Teilsequenzen jedes EST 5 'bis 58.655.638. Die Ergebnisse für die 14 ESTs sind in Tabelle 1 angegeben.
      Hinweis: Seien Sie vorsichtig EST - Sequenzen zu analysieren , die 5 'zu 1 (dh einen negativen Nukleotid - Wert) als mögliche erste Exons. In zwei der ESTs beispielsweise, das war mit Bcrp1 Exon 2 gezeigt in Tabelle 1 (AI647825 und AI664571) die verbleibende Sequenz 2 bis Exon 3 'ausgerichtet ist .

2. Bewertung von Bcrp1 Alternative Promotorfunktion

  1. Gestaltung von Reporterkonstrukte für Bcrp1 E1U, E1A, E1B und E1C Veranstalter
    1. Mit der Folge von E1U erhalten von der EST-Datenbank suchen, bezeichnen die ersten 5'-Nukleotid von E1U als +1.
    2. Besorgen Sie sich eine bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Klon von Maus-Chromosom 6, die die Bcrp1 / ABCG2 Gensequenz und die Sequenz mindestens 100 kb stromaufwärts von der enthältBcrp1 / ABCG2-Gen (siehe Liste der Materialien und Geräte).
      1. Identifizieren eines geeigneten Reportervektor wie die Luciferasereporterplasmid pGL3-Basic.
      2. Bestimmen Sie die multiple Klonierungsstellen in den Reportervektor. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII und HindIII sind die Restriktionsendonuklease-Stellen in die multiple Klonierungsstelle des pGL3-Basic Vektor in 5 '→ 3'-Orientierung.
        Hinweis: Die Reihenfolge der Verdauung Webseiten, die auf Produktkataloge von Firmen zur Verfügung, die die Restriktionsenzyme produzieren.
      3. Identifiziere alle Verdauungsstellen in der E1U Exon und das 2 kb-Region 5 'von E1U Softwareprogramme wie DNA5 verwenden. Identifizieren mindestens zwei Verdauung Standorten in den pGL3-Basic Mehrfachklonierungsstelle, die nicht in E1U oder 2 kb upstream-Region zu finden sind.
        Anmerkung: Sie müssen eine multiple Klonierungsstelle Restriktionsstelle für die Vorwärts-Primer zu wählen, die für die Rückwärts-Primer ausgewählt, stromaufwärts von der einen ist, um sicherzustellen, daß der Einsatz will liegen in der richtigen Ausrichtung.
    3. Bereiten Sie Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die PCR, die Sequenzen für die ausgewählten pGL3-basic Mehrfachklonierungsstelle Restriktionsendonukleasestellen mit kommerziellen Gen / Primer-Synthese Dienstleistungen oder Primer Auswahlsoftware (siehe Liste der Materialien und Geräte) enthalten. Wählen Sie einen Forward-Primer befindet ~ 2 kb stromaufwärts von der E1U Sequenz und einer Rückwärts-Primer innerhalb der E1U Sequenz. Die Primer, die in der Autoren verwendet 'früheren Arbeiten integriert, um eine SacI-Stelle in der Vorwärts-Primer und eine NheI-Stelle in der Rückwärts-Primer, und verstärkt die genomische Region von etwa -1.906-64 mit dem ersten 5'-Nukleotid von E1U angegeben als + 1 (siehe Schritt 2.1.1 oben) und sind in Bezug 16 zur Verfügung gestellt.
      1. PCR - Amplifikation die E1U genomischen Region unter Verwendung dieser Primer, 0,01 bis 1 ug des BAC und PCR - Master - Mix High-Fidelity - Taq - Polymerasen enthält (siehe Liste der Materialien und Geräte) mit Denaturierung bei95 ° C für 30 Sekunden, dann 35 bis 40 PCR-Zyklen, mit der Erweiterung bei 72 ° C (2 min), und Tempern und Schmelztemperaturen auf der Grundlage der Schmelzeigenschaften der verwendeten Primer.
        Anmerkung: Die Verwendung von High-Fidelity Taq - Polymerasen zur Sequenzierung von Promotorregionen von wesentlicher Bedeutung ist , die hohen GC - Gehalt haben. Wenn große genomische DNA-Fragmente unter Verwendung von beispielsweise einer BAC als Templat kann die Sekundärstruktur der genomischen DNA für PCR-Primer schwer zu binden. Wenn dieses Problem auftritt, kann eine bessere PCR-Ergebnisse erhalten werden, wenn die lange genomische DNA-Templat sanft durch Beschallung vor der PCR-Reaktion geschert wird.
      2. Überprüfen Sie die Länge des amplifizierten PCR-Produkts durch einen Vergleich gegen eine 1 kb DNA-Leiter 0,8% TAE-Agarose-Gelelektrophorese.
    4. Digest das PCR-Produkt erhalten und den pGL3-Basic Vektor, mit den Restriktionsendonucleasen spezifisch für die Restriktionsverdauung Stellen eingeführt in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer gemäß instructions mit den Restriktionsverdauungsenzyme geliefert.
      1. Reinige die Verdauung Reaktionen unter Verwendung von kommerziellen SV Gel und PCR Clean-Up - Systeme Satz (siehe Liste der Materialien und Geräte), nach dem Kit - Protokoll 21.
        1. Überprüfen Verdauung und Linearisierung des Vektors durch sie gegen den ungeschnittenen Vektor unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese verglichen wird, dann geschnitten und reinige den verdauten Vektor DNA Band. Messen Sie die Konzentration des gereinigten PCR-Produkt und das gereinigte Vektor UV-Spektrometrie (siehe Liste der Materialien und Geräte).
    5. Bereiten Sie die E1U Reporterkonstrukt durch das gereinigte Ligatur, Restriktionsenzym-verdaute PCR-Produkt und pGL3-Basic Glühwürmchen-Luciferase-Reportervektor (in dem Reporter-Assay-Kit enthalten, siehe Liste der Materialien und Geräte) im Einsatz: Vektor-Verhältnisse von 11, 21 und 31, unter Verwendung der "T4 - DNA - Ligase schnell Ligationskits" , wie pro Set Anweisungen 22, wodurch die E1U r Herstellungeporter Konstrukt, mit dem Namen pGL3-E1U.
      1. Verwenden Sie das pGL3-E1U Plasmid zur Transformation von Bakterien zu klonal pGL3-E1U folgenden Anweisungen in der TA-Cloning-Kit (siehe Liste der Materialien und Geräte) erweitern.
      2. Bestätigen Sie die Ausrichtung und die Treue des Einsatzes durch Sequenzanalyse.
    6. Bereiten Reporterkonstrukte für E1A, E1B und E1C mit einer ähnlichen Methodik wie für E1U. Bestätigen Sie die Treue der Einsätze durch Sequenzierung, wie in Abschnitt 2.1.5.2.
      Anmerkung: Die Promotoreinsätze für E1A, E1B und E1C sollte ungefähr -1875 / + 10, -1847 / + 60 und -1904 / + 83 relativ zu dem ersten 5'-Nukleotid (bezeichnet als +1) von E1A, E1B, oder E1C, respectively.
  2. Reporter - Assay - Verfahren
    Anmerkung: Allgemeine Strategie der Reporter-Assays: die putative Promotor (5'-stromaufwärts-Region) eines Gens in die multiple Klonierungsstelle eines leeren "Reporter" Vektor insertiert, der eine "reporte enthältr Gen "(zB Glühwürmchen - Luciferase) stromabwärts von der Mehrfach - Klonierungsstelle. Der Vektor wird dann in eukaryotische Zellen transfiziert, die das Gen von Interesse exprimieren. Die trans-wirkenden Faktoren , die die Expression des Gens von Interesse in diesen Zellen zu fördern sollte die Aktivierung Promotor in der transfizierten Reportervektor, wodurch die Expression von Glühwürmchen-Luciferase, die sich leicht mit einem Lumineszenz-Assay quantifiziert werden kann.
    1. Wählen Sie die entsprechende Zelllinie für die Reporter-Assay zu verwenden.
      Hinweis: Um die Aktivität des E1U alternative Promotorreporterkonstrukt bewerten, ist es notwendig, dass in Zellen zu transfizieren, die konstruieren exprimieren Bcrp1 unter der Kontrolle des Promotors E1U. Die TM4 Maus Sertoli - Zelllinie (siehe Liste der Materialien und Geräte) drückt Bcrp1 Protein und Bcrp1 mRNA enthält E1U sowie E1A, E1B und E1C 5. Als negative Kontrolle, sollten Sie eine Zelllinie, die nicht Bcrp1 Protein oder mRNA exprimiert.
    2. Kultur der TM4 cells in Platten mit 24 Vertiefungen bei einer Anfangsdichte von 200.000 Zellen / Vertiefung in einer 1: 1-Gemisch von Ham-F12-Medium und modifiziertem Eagle-Medium von Dulbecco mit 1,2 g / l Natriumbicarbonat, 15 mM HEPES mit 5% Pferdeserum, 2,5% fötales Rinderserum, Penicillin (100 IU / ml) und Streptomycin (100 ug / ml), bei 37 ° C, 5% CO 2, wie zuvor beschrieben 5.
    3. Sechs Stunden nach der Zellen in Kultur platziert, transfizieren die Zellen mit 0,2 & mgr; g pGL3-basic leeren Vektor oder mit 0,2 & mgr; g pGL3-Vektor, enthaltend das -1906 / + 64 E1U oder -1875 / + 10 E1A oder -1847 / + 60 E1B oder -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 Löschen konstruieren zusammen mit 4 ng pRL-TK (ein Renilla - Luciferase-exprimierenden Vektor) als interne Kontrolle, eine kommerzielle DNA - Transfektion Kit und Protokoll des Herstellers 23 (siehe Liste der Materialien und Geräte) .
    4. 30 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus dem culturED-Zellen transfiziert. Waschen Sie die Zellen einmal mit 200 ul PBS, entfernen Sie dann die Waschlösung.
      1. Messen Sie Glühwürmchen und Renilla - Luciferase - Aktivität eines kommerziellen Kits nach Herstellerprotokolle 24.
    5. Drücken die Aktivität für jedes Rohr als das Verhältnis der Glühwürmchen - Luciferase - Aktivität , geteilt durch die interne (Renilla - Luciferase) -Steuerung; Gesamtergebnisse sind in der Regel als die Aktivität jedes Reportergen exprimiert mit dem leeren Vektor transfiziert pGL3 Grund derjenigen von Zellen relativ zu konstruieren, die einen Wert von 1 gegeben wird.

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Representative Results

Identifizierung von Bcrp 1 alternative Promotor Nutzung in Maus Hoden durch die Analyse der Leader - Exons

Wenn die EST - Datenbank bei NCBI sondiert wurde (April 2015) , erläutert die Schritte unter Verwendung von in Protokoll 1, fanden die ESTs , die mit dem 5' - Ende von Exon 2 in Bcrp 1 - mRNA sind in Tabelle 1 gezeigt, zusammen mit ihrer Position in der genomischen zusammenhängenden waren DNA relativ zum Start von Exon 2. Ein EST abgeleitet von C57BL / 6J Maus - Hoden , die benachbart ist zu Exon 2 in Bcrp 1 mRNA hat Sequenzen in genomischer DNA 70 kb stromaufwärts von Exon 2, E1U entspricht (Tabelle 1). Ebenso ESTs zu E1A entspricht, E1B und E1C nachgewiesen. Bemerkenswert ist, daß die beiden zu E1C entsprechenden ESTs E1B auch an das 5'-Ende E1C gespleißt enthalten. Die Lage dieser vorhergesagten ersten ExonsBezug auf Bcrp1 Exon 2 auf Maus - Chromosom 6 ist in Abbildung 1 dargestellt.

Evaluierung von Bcrp 1 alternative Promotorfunktion

Typische Luciferase Assay - Ergebnisse entsprechend E1U, E1A, E1B und E1C Promotor-Luciferase - Reporterkonstrukte Transfektion in TM4 Maus Sertoli - Zellen (siehe Abschnitt 2.2) sind in 2A gezeigt.

In früheren Arbeiten wurde ein SF-1 - Response - Element vorhergesagt 5 in der E1U Promotor sein. Wenn diese putative SF-1 - Response - Element wird in der Regulation der Bcrp1 Transkription in mouse testis beteiligt, dann Mutation (wie in einer früheren Veröffentlichung beschrieben 5) dieses Responseelement in dem Konstrukt - Promotor - Reporter E1U wird die Luciferase - Aktivität von diesem Konstrukt erzeugt reduzieren wenn Transfektion inTM4-Zellen. Ergebnisse eines typischen Experiments sind in 2B gezeigt. Das mutierte Konstrukt zeigt niedrigere Luciferase Aktivität als die nicht-mutierte Konstrukt mit einer Aktivität vergleichbar mit der von dem leeren pGL3-Basisvektor, auch in Zellen mit erzwungenen Expression von SF-1 (in einer früheren Veröffentlichung beschrieben 5). Erzwungene Expression von SF-1 erhöht die Aktivität des nicht-mutierten Konstrukt, nicht aber die des mutierten ein.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der genomischen Ausrichtung von ESTs mit Sequenzidentität zu Bcrp1 Exon 2 mit Maus - Chromosom 6. Diese Ausrichtungen wurden in einer dbEST BLAST - Suche durchgeführt im April identifiziert, 2015. Vier verschiedene Ausrichtungen gefunden wurden, entsprechende alternative erste Exons E1U, E1A bis Bcrp1, E1B und E1C. Diese Zahl ergibt sich aus einer früheren Veröffentlichung 5 wiedergegeben.

Figur 2
Abbildung 2. (A) Reporter Assay für Bcrp1 Promotoren E1U, E1A, E1B und E1C in BALB / c Sertoli - Zellen abgeleiteten TM4 - Zellen. Die Daten sind als Lumineszenz von Glühwürmchen - Luciferase ausgedrückt , normalisiert zu der von Renilla - Luciferase, Methods in Abschnitt beschrieben unter Verwendung von 2 gezeigten Daten sind die mittlere und Standardabweichung von drei verschiedenen Experimenten, durchgeführt an verschiedenen Tagen. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied von der leeren pGL3 Vektor - Kontrolle mit dem t - Test (P <0,01). Diese Zahl ergibt sich aus einer früheren Veröffentlichung reproduziert . 5 (B) Auswirkungen der Mutation des SF-1 - Response - Element in der Bcrp1 E1U rePförtner auf Luciferase-Aktivität zu konstruieren. Bcrp1 Reporterkonstrukten mit der putative SF-1-Bindungsregion (mutiert oder un-mutiert) wurden in TM4-Zellen transfiziert mit (SF-1 transfiziert) und ohne (Vektor transfiziert), um die erzwungene Expression von SF-1.Die gezeigten Daten sind die mittlere von 3 verschiedenen Experimenten an verschiedenen Tagen durchgeführt; Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Für jedes Experiment wurden einzelne Assays in Doppelbestimmung durchgeführt. In der Figur ist (A) bezeichnet einen signifikanten Unterschied gegenüber dem leeren Vektor pGL3 Kontrolle (P <0,05) unter Verwendung der t - Test, (B) einen statistisch signifikanten Unterschied bedeutet gegenüber dem E1U Promotorkonstrukt mit dem t - Test (P < 0,05). Diese Zahl kann von einer früheren Veröffentlichung wiedergegeben wird 5. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Tabelle 1. Blast - Suche der Maus - EST - Datenbank gegen die Sequenz des zweiten Exon von Bcrp1 25 -28. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Discussion

Die Mehrzahl der Methoden und repräsentative Ergebnisse sind in früheren Arbeit mit dem Titel beschrieben "B CRP1 Transkription in Maus Hoden wird durch einen Promotor kontrolliert vor einem neuen ersten Exons (E1U) durch steroidogenen factor-1 reguliert" , die im Jahr 2013 5 veröffentlicht . Zusätzlich zu den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen, sofern die vorherige Papier Schätzungen von alternativen ersten Exons Nutzungs 5'-RACE PCR und RT-PCR-Methodik. Darüber hinaus wurde in silico-Identifizierung eines mutmaßlichen SF-1 - Response - Element in dem Promotor stromaufwärts von E1U erreicht und Chromatin - Immunopräzipitation (ChIP) Assays zeigten , dass SF-1 , gebunden an die putative SF-1 - Antwortelement. Funktionelle Untersuchungen zeigten , dass in murine Sertoli - Zellen, Bcrp 1 Transkription von SF-1 über den SF-1 - Antwortelement in der E1U Promotor gesteuert wird. Diese funktionellen Studien umfassten upregulation von SF-1 in TM4-Zellen durch transfection oder durch die Verwendung eines Histon - Deacetylase - Inhibitor (vorinostat), die eine verstärkte Expression von BCRP 1 E1U mRNA resultiert, und eine Zunahme in Bcrp 1 - Protein sowie Aktivität des Bcrp 1 E1U Promotor in einem Reporter - Assay. Schließlich diese Studien nachgewiesen, dass in den Hoden von erwachsenen Sertoli-Zell - spezifische SF-1 - Knockout - Mäuse, die Ausdrücke von Bcrp 1 E1U mRNA, insgesamt Bcrp 1 - mRNA und Protein Bcrp1 deutlich 5 vermindert wurden. Die gleiche Arbeit berichtet auch die Expressionsmuster von Bcrp1 mRNA - Isoformen in einer Vielzahl von murinen Geweben, einschließlich Niere, Leber, Hoden, Gehirn, Herz, Lunge, Muskeln und Milz 5.

Die Protokolle hier beschrieben - gewebespezifische Regulierung der Bcrp 1 als Modell - bieten einen einfachen experimentellen Rahmen die Transkriptions Komplexität eines beliebigen Gens zu entwirren seine Differential zu bestimmenExpression in verschiedenen Geweben oder Zellsubtypen. Es muss betont werden , dass die Ergebnisse aus den Protokollschritte beschrieben für die In-silico - Auswertungen erhalten werden , da die verschiedenen Websites zeitabhängig sein, die die Software und Datenbanken beherbergen unterliegen können zu ändern. Die in-silico - Methodik hier präsentierten nutzt Durchsuchen der EST - Datenbank (dbEST) , wie zuvor 29, berichtet , die schätzt , dass etwa 18% aller menschlichen Gene in der EST - Datenmenge alternative Promotoren einzusetzen. Die Suche der dbEST Exons erste Alternative unterschätzen kann, weil andere Forscher - eine "Oligo-Capping" Methode zur Herstellung von 1,8 Millionen 5'-Endsequenzen von cDNAs aus vielen menschlichen Geweben - konnten mutmaßliche Transkriptionsstartstellen für die menschliche Gene und Schätzung zu identifizieren dass 52% der menschlichen RefSeq Gene untersucht wurden möglicherweise durch alternative Promotoren geregelt 1. Interessanterweise fand diese Studie, dass dieGewebe, die putative alternative Promotoren waren die Hoden und das Gehirn verwendet wird; Ferner fanden sie , dass verwandte Proteine ​​codieren , Gene Übertragungswegen wurden eher zu signalisieren 1 gewebespezifische alternative Promotoren zu verwenden. Trotz der genannten Nachteile, analysiert dbEST für ein bestimmtes Gen in mehreren Geweben mit minimalem Aufwand einen groben Überblick über 5'-UTR-Nutzung zur Verfügung stellen.

Obwohl dbEST Analyse einen einfachen Blick auf alternative erste Exon-Verwendung bietet, empfehlen wir in hohem Grade 5 'RACE-PCR durchführen (5'-RACE) Analyse erste Exon-Verwendung in einem Gewebe oder Zelllinie unter Untersuchung zu überprüfen. Kommerzielle Kits sind verfügbar für 5'-RACE, mit detaillierten und unkomplizierte Verfahren durch den Hersteller zur Verfügung gestellt (siehe Liste der Materialien und Geräte). Obwohl etwas zeitraubend, bieten 5'-RACE Studien tatsächlichen Schätzungen der Gegenwart sowie die Reihenfolge der alternativen ersten Exons in der mRNA von Interesse; Weiterhin kann die Anwesenheit von mehreren Transkriptionsstartstellen auch 13 detektiert werden. Um eine ausreichende Darstellung gewährleisten, Sequenzierung von mindestens 15 bis 25 Klone erforderlich. Vor der Sequenzierung, ist es wesentlich, "verunreinigenden Vektorsequenzen vom 5 RACE Produkte zu entfernen. Wenn dies nicht geschieht, können BLAST-Analyse nicht vollständig ein Sequenz-Alignment mit dem Mausgenom zu detektieren. Sobald erste Exon-Verwendung festgelegt wird, werden die 5'-RACE Ergebnisse verwendet werden können nachfolgende quantitative RT-PCR-Assays für alternative erste Exons zu validieren. Im Allgemeinen wird die bisherige Arbeit gefunden "Autoren , dass eine gute Korrelation zwischen dem Prozentsatz der ersten Exons mRNA Klone durch 5' - RACE und der Prozentsatz der PCR - Produkt gewonnen für eine bestimmte Alternative ersten Exons aus dem gleichen Gewebe oder Zelllinie 5 gewonnen wird. Zusätzlich wurde eine gute Korrelation zwischen den Aktivitäten der Luciferase-Promotorkonstrukte für alternative Bcrp1 Promoter gefunden einnd die Expression des entsprechenden alternativen ersten Exons in einer bestimmten Zelllinie 5.

Bei der Suche nach gewebespezifische alternative Promotor - Nutzung, wenn ganze Organe verwendet werden, muss man sich bewusst sein , dass die alternativen Promotoren / gefunden ersten Exons des Gewebes Heterogenität des Organs wie Drüsen Elemente widerspiegeln, Blutgefäße, Stroma, etc. Für beispiels~~POS=TRUNC weise~~POS=HEADCOMP ist der testis eine Mischung aus somatischen (Leydig, Sertoli, myoid, und endotheliale Zellen) und germinalen (haploid) -Zellen sowie Vaskulatur. Sonde für die gewebespezifische Expression erste Exon, wird es notwendig sein, zu bestimmten Geweben aus den Organen zu isolieren.

Andere Verfahren wurden zur Identifizierung von alternativen Promotor Nutzung und Regulierung berichtet; Jedoch erfordern diese Next-Generation-Sequenzierung und Bioinformatik der Berechnung der Lage, die große Menge an Daten erzeugt analysieren. Diese Methoden umfassen ganze Transkriptosoms Sequenzierung (RNA seq) und ChIP-seq vonHistone wie H3K4me3, die 30 bevorzugt an Promotoren bindet. Obwohl diese Verfahren teuer sein kann de-novo durchzuführen, wenn sich der Fokus auf die Expression von einigen spezifischen Genen und Geweben ist, im Bergbau vorhandener Daten kann ein praktischer Ansatz.

Die Assays zum Abschätzen Promotoraktivität hier vorgestellten verwenden die pGL3-Basisvektor, der stromaufwärts eine multiple cloning Region enthält aus dem Glühwürmchen-Luciferase-Gen. Die Promotoraktivität wird durch die Produktion von Firefly Luziferase gemessen, die leicht quantifiziert wird nach Zugabe von Cofaktoren und einem lumineszenten Substrat, durch Messung von Lumineszenz in einem kommerziellen Luminometer (siehe Liste der Materialien und Geräte). Die im Zusammenhang mit pGL4 Vektor kann hergestellt werden selektierbare Marker enthalten (beispielsweise Neomycin, Hygromycin, Puromycin), so dass die Produktion von stabil transfizierten Zellen. Die Protokolle in diesem Papier gegeben nutzen vorübergehende Transfektion. Typischerweise Reporter-Assays für promoter Aktivität verwenden Cotransfektion mit einem Vektor durchgeführt , die konstitutiv exprimiert Renilla (Sea Stiefmütterchen) Luciferase (pRL-TK), um Variationen in der Zellzahl zu kontrollieren und die Effizienz der Transfektion. Ein entscheidender Schritt für einen Promoter Assay für ein gegebenes Gen in Festlegung ist sicher zu sein, dass das Gen von Interesse wird in der Zelllinie exprimiert, die mit dem Reporterkonstrukt transfiziert ist. Zweitens, wenn alternative Promotor Gebrauch vorhanden ist, ist es wichtig, den Promotor-Konstrukt zu verwenden, das in der Zelllinie exprimierten, transfiziert mit dem alternativen ersten Exon entspricht. Zum Beispiel, nicht erwarten, Lumineszenz für die E1U Promotor-Konstrukt, um zu sehen, die in Zellen transfiziert wird, die ausschließlich unter der Kontrolle des E1B Promotors exprimieren Bcrp1. Alternativ als negative Kontrolle, die Transfektion der Reporter in eine Zelllinie zu konstruieren, die nicht das Gen oder mRNA-Isoform von Interesse nicht exprimiert in keiner Produktion von Glühwürmchen-Luciferase führen.

Die consequences alternativer Promotor Gebrauch sind die Herstellung des gleichen Proteins, die Produktion von Proteinen mit unterschiedlichen N-Termini oder der Herstellung von verschiedenen Proteinen 29. Im Falle von Bcrp1 / BCRP, Steuerung mehrerer (gewebe- oder zelltypspezifischen) Promotoren, die Produktion des gleichen Proteins. Ein ähnliches Muster besteht für die CYP19 (Aromatase) Gen 29, 31. Die Protokolle hier vorgestellten liefern die grundlegenden Schritte, die man in einem Gewebe oder einer Zelllinie zu entschlüsseln, die komplexen Mechanismen der Transkriptionskontrolle eines Proteins von Interesse verwendet werden können.

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Disclosures

Douglas D. Ross und der University of Maryland, Baltimore halten Patentrechte für die menschliche BCRP.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Merit Review Awards Douglas D. Ross und Arif Hussain aus dem Department of Veterans 'Affairs unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kit Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies AM1700 5'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kit Life Technologies K450001 This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria.
T4 DNA ligase quick ligation kit New England Biolabs M2200
Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase Sigma-Aldrich/Roche 3553400001/RMB-4738284001  Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend
XtremeGENE HP DNA transfection reagent Roche 6366236001
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1910 Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors.
QIAprep Qiagen 27104 For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies
pCR2.1 vector part of the TOPO TA cloning kit
pGL3-basic luciferase containing vector Promega E1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vector Promega E2241
Bacterial artificial chromosome BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA RP23-285A12 and RP24-314E24 http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol Life Technologies 15596026
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases
CRYOVIALS Denville Scientific V9012
SOFTWARE:
Ensembl software Ensembl project http://Ensembl.org  The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online.
Blast software NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 software Simgene http://simgene.com/Primer3 Useful for designing primers for 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cells ATCC, Manassas, Virginia CRL-1715™
INSTRUMENTS:
Luminometer Turner Biosystems TD-20/20 This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates.
NanoDrop spectrophotometers Thermo Scientific, Inc. NanoDrop 2000 Spectrophotometer can use very small quantities of sample
DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA DU 800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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