תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שעתוק גנים ספציפית הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. התהליך הביולוגי מתווך על ידי גורמי תעתוק אשר נקלטים אזורי רגולטוריים הגנומי כוללים משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כימיים. שינויים של היסטונים נוסף להוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול, ובכך להביא לרמה אחרת של רגולצית כוונון העדינה של שעתוק גנים. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר, אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב. הם מספקים חומר העיקרון מספיק immunoprecipitation הכרומטין (שבב), טכנולוגיה בשימוש נרחב לזהות אזורים רגולטוריים הגן. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של cardiogenesis. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשרחוקר נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות תא. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או שבב רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

Introduction

הלב הוא האיבר הראשון להיווצר להיות פונקציונלי בעובר. הלב בנוי שושלות תאים רבות שעולות משדות הלב העובריים הראשונים ושני 1. מן הבלסטוציסט לאחר הפרית שלב א 'עד בצורת הלב, תאים עובריים יש אפוא לקבל החלטות תא גורל רבות. שעתוק גנים מוסדר באופן הזמן- ומרחב תלוי הוא תהליך ביולוגי מפתח העומד בבסיס החלטת גורל תא במהלך התפתחות עוברית. תהליך כזה מתווך על ידי גורמי שעתוק ספציפיים המחייבים אזורים רגולטוריים בתוך הגנום כולל משפר ומקדם של גני מכונן לב. DNA הוא כרוך סביב ההיסטונים כי הם נתונים שינויים כגון acetylation, מתילציה, ubiquitinylation, ו / או זרחון. שינוי היסטון מוביל שעתוק גנים מודחק, מופעל או שקול תלוי בו שאריות של היסטון ליזין היא שונות 2.

jove_content "> assay immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הוגדר שנים 3 ו משתמשת בטכנולוגיה הנמצא בשימוש הנרחב ביותר כדי לזהות מטרות של היסטונים שונה משני או גורמי שעתוק 4. בעקבות immunoprecipitation של היסטונים או גורמי שעתוק, DNA כבול יכול להיות או מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימרז (PCR) או רצף. שבב שהתגברה טכנית יותר מבחני פיגור ג'ל מאתגר 5. אולם שבב אינה מעידה ישירה מחייב גורם שעתוק ל- DNA, יתרון של assay ג'ל פיגור. מצד שני, שבב בשילוב כדי רצפי DNA פתח פרספקטיבת הגנום כולו חדשה על ויסות גנים.

בתאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) שיסכמו בתוך גופי embryoid (כלומר., אגרגטים תא) או בתרבות 2D השלבים המוקדמים של פיתוח לב 6 ולספק חומר עיקרון מספיק שבב. יתר על כן, בתאי גזע עובריים אנושיים מייצגים מודל תאים אנושי של CArdiogenesis למרות הפוטנציאל קרדיוגני שלהם תלויה בחתימה אפיגנטיים שלהם 7. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות, רקמות עובריות העכבר לאפשר לחקירת נופים אפיגנטיים ספציפיים הדרושים לצורך קביעת זהות התא. עם זאת, הגנום הוא עבד באופן סוג ספציפי הזמן- ותא 8. תקנה אפיגנטיים של שעתוק הגנים יש להיחקר בתוך אזורים נקודתיים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקולים של שבב, שבב רציף ואחריו PCR או רצף באמצעות תאי גזע עובריים, גופי embryoid ואזורים עובריים ספציפיים לב. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור את הרגולציה אפיגנטיים של שעתוק גני לב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חלבון דנ"א Cross-linking

  1. תקן ב 15 מיליליטר צינורות שנקטפו-ES תאים (2 x 10 6 תאים עבור שבב רגיל, 2 x 10 5 תאים עבור Microchip), גופי embryoid (EBS) המופקים מתאי גזע עובריים רקמות לב עובריות גזורים מן עוברי עכברי E9.5 (חדרים ועליות תעלה, בדרכי חדר יצוא) באמצעות פורמלדהיד 1% PBS עבור תאים או במאגר PB2 permeabilization עבור רקמות עובריות. מניחים את הצינורות על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בדיוק.
  2. עצור את התגובה cross-linking ידי הוספת גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית במהירות של 60 סל"ד.

פיצול 2. תא תמוגה הכרומטין

  1. שטפו פעמיים תאים צולבים resuspended ב 10 מ"ל PBS 1x או רקמות עובריות resuspended ב 1 מ"ל PB2. צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.. מחק את supernatants. </ Li>
  2. הוסף מעכבי פרוטאז למאגר PB1 או PB2 (2 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin, 1 מיקרוגרם / מ"ל Aprotinin, ו 0.1 מ"מ PMSF) (טבלה 1). Resuspend התא גלולה או רקמה עוברית משלב 2.1 ב 1 מ"ל של הצפת PB1 או PB2 בהתאמה. Pipet למעלה ולמטה ו resuspend תאים או רקמות. השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 21 מד כדי homogenize תאים או רקמות. דגירה ב 4 ° C. (על גלגל) במשך 10 דקות.
  3. ספין למטה ב 3000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
  4. Resuspend גלולה ב 300 μl של מאגרי SB בהתאמה (לוח 1) השלימו עם מעכבי פרוטאז בתוך שפופרת נקיה (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) כדי למנוע כל שפלת DNA. דגירה של 15 עד 30 דקות על קרח.
  5. Sonicate דגימות ב 4 ° C. כדי לכסח את הכרומטין באמצעות sonicator פי התוכניות המפורטות בטבלה 2 עבור כל חומר. התאם משך sonication בהתאם היישום הבא (<em> כלומר, PCR או רצף). גודל DNA טעון צריך להיות סביב 500 נ"ב עבור PCR ו -300 נ"ב על רצף.
  6. צנטריפוגה sonicated תא lysate למשך 10 דקות ב 6000 XG ב 4 ° C, להעביר את supernatant (הכרומטין) בצינור 1.5 מ"ל נקי וזורקים את הכדור.
  7. לדלל את הכרומטין בתמיסה (B חיץ supernatant) במשך 10 פעמים עם מים להעריך את הצפיפות האופטית באמצעות 1.5 μl ב ספקטרופוטומטר-ננו. השג את הריכוז של החלבונים מיקרוגרם / μl באמצעות הנוסחה הבאה: 1.55 x OD 280 - 0.76 x OD 260.
בַּלָם שימוש הרכב חומרים
א permeabilization PB1: 5 מ"מ צינורות pH 8; 85 מ 'M KCl; 0.5% NP40 את כל
PB2: 15 מ"מ HEPES pH 7.6, 15 mM NaCl, 4 מ"מ MgCl2 60 מ"מ KCl, 0.5% Triton X-100 רקמה עוברית
B תמוגה / Sonication SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 יציאה
SB2: 50 מ"מ HEPES-KOH pH7.9; 140 מ"מ; 1 מ"מ EDTA; 0.1% deoxycholate; 0.1% SDS EBS
SB3: 15 מ"מ HEPES pH7.6, 15 מ"מ NaCl; 60 מ"מ KCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA; 1% Triton-X100, 0 1% SDS, 0.5% laurylsarcosine רקמה עוברית
C חיץ שבב 150 מ"מ NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 5 mM EDTA; 0.5% NP40; 1% Triton-X100. את כל
D דנ"א / חלבון Elution D1: 1% SDS; 100מ"מ NaHCO 3
D2: 50 המ"מימ טריס pH 7.6 / 5 EDTA מ"מ, 15 המ"מ DTT, 2% SDS
E הכנת חרוזי DNA מחייבים E: 20% PEG 8000; 2.5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 מ"מ EDTA

מאגרי שבב בטבלת 1..

חוֹמֶר תוכנית sonication
תאי גזע עובריים 15 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
גופי Embryoid 30 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF
רקמות עובריות 21 מחזורים של 30 שניות על 30 שניות OFF

תוכניות טבלה 2. Sonication.

3. Immunoprecipitation ורוחץ

  1. לשטוף חרוזים 3 פעמים חלבון A-מצומדות עם חיץ C. קח 100 μl של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי ולהוסיף 1 מ"ל של חיץ C (טבלה 1). הצינור הוא הועבר לאחר מכן על גבי מגנט; להמתין דקות 1 ו לשאוב supernatant. חזור פעמים על שלב הכביסה.
  2. דגירת נוגדן שהועלה נגד היסטונים שונים או גורם שעתוק (ריכוזים המפורטים בטבלה 3) עם 20 μl של חלבון שרחץ חרוזי מצומדות 1 מיליליטר של החיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז צינור 1.5 מיליליטר נקי. הגדר את הדגימות על כתף ב 40 סל"ד במשך שעה לפחות 2 ב 4 ° C.
  3. נוגדן-חרוזים לשטוף קומפלקסי 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה המתוארים 3.1).
  4. כן 2 צינורות, אחד המכיל 150 מיקרוגרם של מתחמי הכרומטין נוגדן-חרוזי הצינור האחר המכיל 150 מיקרוגרם של הכרומטין 20 μl של חרוזי שטף; הוסף 1 מ"ל של חיץ C בתוספת מעכבי פרוטאז על צינור אחדדגירת הדגימות על גלגל מסתובב ב 40 סל"ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז הכרומטין חייב להיות לפחות 300 מיקרוגרם כדי immunoprecipitate גורמות שעתוק או עבור שבב רציף.
תֶקֶן ריכוז (ng / μl) נפח (μl) ריכוז ה- DNA סה"כ (נ"ג)
א 10.0 1 10.0
B 5.00 1 5.00
C 2.50 1 2.50
D 1.25 1 1.25
E 0.625 1 0.625
F .3125 1 0.3125
G 0.156 1 0.156
H 0.0 1 0.0

ריכוזים לתקני לוח 3..

4. DNA Elution, היפוך חוצה הקישור proteinase K עיכול

  1. הגדר את הדגימות המתלות המגנטית. לשחזר את supernatant המכיל הכרומטין נוגדן מאוגד.
    הערה: דוגמאות אפשר להקפיא במהירות בחנקן נוזלי באותו צעד ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. הכרומטין יכול לשמש מבחני immunoprecipitation אחרים עם נוגדן אחר. לשטוף כל מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של חיץ C (מניפולציה שתואר קודם).
  2. Elute החלבון כבול-נוגדנים על ידי הוספת 150 μl של חיץ D1 או D2 אם שבב רציפים חייב להיעשות (טבלה 1) לחומרי שבב שטף דגירת הדגימות במשך 20 דקות ב 50 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום.
  3. הסר צינורות מ בלוק חימום ולשים דגימות מתלה מגנטי, לשחזר את supernatant בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) וזורקים את החרוזים.
  4. השתמש supernatant עבור שבב רציפי הוספת 1 עד 3 מיקרוגרם של הנוגדן השני ב 2 כרכים של החיץ C או הפוך crosslink ידי הוספת 5 M NaCl כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מ"מ.
  5. כן מדגם קלט של הכרומטין בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם) לוקח את אותה כמות של הכרומטין כמו זה של מדגם IP (150 מיקרוגרם) בנפח סופי של 150 μl של מים (מים חופשיים RNase DNase). להוסיף 5M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ. דגירה דגימות לילה בשעה C 65 °.
  6. למחרת, להסיר דגימות מהגוש חימום, להוסיף 250 מ"מ EDTA כדי לקבל ריכוז סופי של 12.5 מ"מ ו proteinase K כדי לקבל ריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל ​​בחומר שבב ולעכל על 55 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב בלוק חימום.

ss = "jove_title"> 5. בידוד DNA באמצעות חרוזים ה- DNA מחייבת

  1. הכנת חרוזים
    1. התחל להביא את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך לפחות 30 דקות, מערבולת החרוזים ביסודיות מאוד. חרוזים להתיישב, כך לעבוד מהר כאשר pipetting. העברת 1 מ"ל של חרוזים בצינור 1.5 מ"ל נקי (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
    2. גדר על מגנט, לחכות 2 - 3 דקות עבור הפתרון להבהיר, supernatant שנזרק. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA ומערבבים ידי vortexing קצר.
    3. חזור על שלב 5.1.2 פעמיים, וזורקים supernatant בסוף.
    4. הסר מגנט, להוסיף 1 מ"ל של חיץ E ולאט לאט resuspend את החרוזים. מעבירים את תערובת כולו (החרוזים E חיץ) לתוך 50 מ"ל של חיץ א מקום על שייקר ולתת לו ומערבלים במהירות איטית בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
    5. מבחן ה- DNA מחייבת חרוזים בעקבות פרוטוקול טיהור המתוארים להלן באמצעות 3 תנאי הניסוי: 50 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (1 נפח / נפח 1), 100 μl של חרוזים/ 50 μl של ה- DNA (2 כרכים / 1 נפח) 125 μl של חרוזים / 50 μl של ה- DNA (2.5 כרכים / 1 נפח). בואו להעביר DNA מטוהרים על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את גודל שברי (איור 1 א).
  2. טיהור DNA
    1. להוסיף 425 μl (2.5 כרכים) של DNA מחייב חרוזים מגנטיים לכל דגימת DNA (כ -170 μl). Resuspend לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה (כ -10 פעמים) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    2. מניחים על מגנט במשך 5 דקות, ואז לשאוב supernatant וזורקים (על מגנט).
    3. להוסיף 600 μl של אתנול טרי 80% אל הצינור על מגנט, לחכות 1 דקות, לשאוב supernatant וזורק ולאחר מכן חזור על השלב הקודם שוב.
    4. תן סיבוב מהיר, במשך 5 שניות (microfuge), במקום צינור על מגנט ולהסיר את הטיפות האחרונות של אתנול. תן יבש דקות 1 ב RT
    5. Elute את ה- DNA על ידי הוספת 20 μl של מים חינם DNase RNase. סר מגנט מערבולת המדגם.
    6. דגירה של 3 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם דגימות על מגנט. DNA eluted לשאוב לתוך צינור חדש (מוסמך RNase-, DNase-, ו pyrogen-חינם).
    7. הפעל את ה- DNA מן השבר קלט על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA (איור 1 ב).

6. כימות DNA באמצעות מכשיר גילוי הקרינה

  1. סדרתי לדלל בדנ"א מיקרוגרם מים 1 (1 סולם kb) לתת סך של 7 דילולים בתוספת נקודה לא-דנ"א (דילולים שנאסף בטבלה 3).
  2. הכן פתרון של צבע PCR הירוק אני, מספיק עבור כל הדגימות (דנ"א דילולים תקן מטוהרים AH): לדלל 10,000x לצבוע ירוק במאגר 1x TE.
  3. הוסף 1 μl של כל דגימות דנ"א (DNA דילולים תקן מטוהרים AH) עד 10 תמהיל צבע ירוק 1x μl ב cuvettes נימים להיקרא בתוך fluorimeter באורך גל 488 ננומטר. עבור assay לא-DNA, השתמש 1 μl של חיץ 1x TE.
  4. לִבנוֹתעקומת כיול באמצעות תוכנות גרפיקה לקבוע את הריכוזים היחסיים לטווח בדגימת DNA הנמצאת ng / μl. ה- DNA הוא אז מוכן PCR או לעשות ספריות רצף.

7. PCR

  1. מבחר פריימרים
    1. פריימרים תכנון עניין לחקור את האזורים הגנומי של עניין. פריימרים עיצוב להגביר אזורים משפר גנים באמצעות דפדפן הגנום UCSC. משפרים הם חזו נוספים באמצעות H3K4me1 או p300 שבב seq 9 נתונים זמינים בערכת נתוני GEO.
  2. PCR
    1. הפעלה PCR תגובות עבור 45 מחזורים (8 שניות 95 מעלות צלזיוס, 8 שניות 60 ° C, 8 שניות 72 ° C) להשתמש thermocycler PCR בזמן אמת 25 μl תערובת צבע ירוק, 2 ng DNA, ו -0.5 μl תערובת פריימר (20 מיקרומטר פתרון המניות) 10.
  3. ניתוח של העשרה
    1. חישוב העשרה מוחלטת והניחה שלכל היותר 1% של הנוקלאוזום היו immunoprecipitated 11.
    2. consideהאות R גנומי כמו מועשר אם 10 דגימות ng IP להראות העשרה יותר בהשוואה ל 0.1 ng של DNA קלט.
    3. אין מהיר תוצאות כמו גידול של פי העשרה על אזור שאינו מועשר לאחר נורמליזציה לכניסת וכוונון עם מדגם השליטה הלא ספציפית.
    4. קחו למשל את ה- DNA קלט על דילול 100 (גורם לדילול או DF).
    5. לנרמל את קלט באמצעות המשוואה הבאה 2 -ΔCt x 100%, כאשר -ΔCt = Ct [IP] - Ct [קלט x DF].
    6. התאם שליטה באמצעות המשוואה הבאה (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) שבו NS הוא מדגם שאינם ספציפיים (לא נוגדן ה- IP, או IgG IP).
    7. חשב את ההעשרה פי המדגם כפי 2 -ΔΔCt. קובץ כולל את כל השלבים של חישובים עם נוסחאות בה רק מדגם PCR ניתן להזין יקל על ניתוח של התוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 א הממחיש ראשון בהכנת חרוזי בקרת איכות-DNA מחייבת שימוש ב- DNA בגדלים שונים (סולם 1 kb). 0ne, 2 ו 2.5 כרכים (1 עד 3) חרוזים התווספו בכרך אחד של המדגם כדי לטהר שברי DNA בגודל מולקולרי גבוהים ונמוכים.

איורים 1 B, C, D הם דוגמאות אופייניות של ג'לים דנ"א DNA sonicated כולו מופק בתאי עכבר ES, גופי embryoid או אזור עוברי לב (ותקווה 25 E9.5 חדרים), בהתאמה.

כאשר בתאי גזע עובריים להבדיל כלפי גורל תא לב, הם המעבר ראשון דרך mesendodermal ואז מדינת mesodermal. מסע כזה התפתחותיים כולל צעד אחר שבו תאי אפיתל צריך לעבור במעבר epithelio-mesenchymal

איור 2

גני בידול תכונת תחומים דו ערכיים בתאי גזע עובריים 12. 5 'שלהם UTR אזורים קרובים היזמים שלהם תפוסים אכן על ידי שתי H3K4me3 סימן הפעלת הכרומטין H3K27me3, סימן מודחק. סימנים אלה הם שונים כאשר תאים מאותגרים על ידי מורפוגן כגון BMP2 7. סימנים אלה הם לעומת זאת משתנה בהתאם לקו תאים אנושיים ESזה כנראה בגלל הבלסטוציסט המקורי הם נובעים גם כאשר מובחן (איור 3).

הפרוטוקולים מתוארים לעיל מתאימים רצף שבב אפילו החל כמות נמוכה של חומר; ניסויים שבב בוצעו מן הכרומטין מופק AVC, OFT ואת חדרי הלב של עוברי עכברים E9.5 על מנת לחשוף גנים וחילוף הרומן משחק תפקיד בהגדרת הזהות של אזורים לב ספציפיים אלה. איור 4 מראה 2 אזורים הגנומי של גנים שריר הלב חדר עכבר E9.5 מתעשר H3K27 acetylated ושל קוצב ספציפי אחד (כלומר., לא חדרית) גן לא מועשר על ידי H3K27 acetylated.

איור 1
איור 1. אלקטרופורזה נתונים: חרוזי ה- DNA מחייבת בדיקת Sonication Validation. (א) DNA מטוהרים על ידי חרוזי מחייב DNA, 1 נפח של חרוזים / 1 נפח של ה- DNA (1) ו -2 כרכים של חרוזים / 1 נפח של דנ"א (2) ו -2.5 נפח של חרוזים / 1 נפח של ה- DNA (3). גודל של קטעי DNA המתקבל לאחר crosslink הפוכה של שברים קלט של עכבר לתאי גזע עובריים (B), גופים embryoid (C), ו ברקמת הלב העוברי (D). הדגימות נוהלו על ג'לים אלקטרופורזה agarose 2%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שבב ניתוח נתונים. (א) העשרה של סימן אפיגנטיים H3K27ac על אמרגן משפר E-cadherin / (A - אזורים E) (B) העשרת H3K4me1, H3K36me3 ו H3K9me2 epige.סימני מגנטיים על משפר טוויסט / אמרגן (אזורי AC). אזורים הגנום הם מוגברים על ידי qPCR למדוד את העשרת היסטון vs הקלט הבא שבב. תוצאות הם אמצעי ± SEM מ 3 ניסויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. סדרתית שבב. הכרומטין הופק מ -4 שורות תאים אנושיות ES וצ'יפ בוצע ברצף באמצעות H3K4me3 אנטי ולאחר מכן נוגדנים נגד H3K27me3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. גני הלב Nkx2.5 ו Tbx5 מועשרים ב היסטון השונה ואזור אחד הגנומי של גן הקוצב ספציפי Shox2 לא מועשר ולא לידי ביטוי החדר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפיגנטיקה הפך תחום חשוב של מחקר בביולוגיה התפתחותית. איך תכנית גנטית מופעלת בתאים עובריים כדי לאפשר לתאי רכישת זהות ספציפית בתוך שושלת עוברית כבר במשך זמן רב שאלת מפתח עבור ביולוגים התפתחותיים.

שבב נעשה שימוש נרחב בתוך בשנים האחרונות ומשולב כדי רצפי DNA בעקבות שיפור ברזולוציה של רצף. זה הפך טכניקה רבה עצמה כדי לחקור בגנום רחב באופן תלוי בנוף אפיגנטיים של תאים או רקמות עובריות מבוגרות ספציפיות. מאגרי assay השבב ותנאי sonication שופרו מאוד לאפשר מבחנים עבור כמות קטנה של חומר ביולוגי. זה כולל אזורים ספציפיים של לבבות עובריים מתקבלים על ידי microdissection או על ידי תאים ממוינים FACS לבטא חלבון כתב ניאון. ואכן שבב שבוצע על אוכלוסיות תאים הטרוגנית 13 14 פחיתלהוביל לתוצאות מטעות שקשה לפרש. סימני החתימה אפיגנטיים מאוד במדויק לתא אוכלוסיות. חתימה זה מקנה להם פוטנציאל מסוים של בידול וקובע את גורלם. מכיוון שכך, חשוב לעבוד עם אוכלוסיות תאים מטוהרות (מיון) או רקמות עובריות גזורות.

תיארנו לעיל פרוטוקולים עמידים על מנת להשיג מטרות אלה. השתמשנו הפרוטוקולים הללו עבור שבב ה- PCR, שבב על שבב 7, 10 או רצף שבב (איור 4, כתב היד בהכנה). סיבת החוסן מטילה על מאגרי permeabilization ותא תמוגה כי כבר מותאמים על מנת להבטיח תא שלם תמוגה גרעינית sonication הכרומטין ביותר. הפרוטוקולים ולכן יכולים לשמש כמות קטנה של רקמות עובריות.

מגבלות הפרוטוקולים הללו נובעים מעצם שבב. באופן ספציפי יותר, את הרזולוציה המרחבית אינה גבוהה מאוד עם גדלי DNA כ -500 נ"ב. אֵיךפעם, הוא מאפשר לנו לחקור את הדינמיקה של תחומים דו ערכיים להבדיל בתאי גזע עובריים 7 וכדי לחשוף הבדלי העשרת היסטונים שונה על אזורי רגולטוריים גן EMT ב סוג בר או תאים-מוטציה בגן. (איור 2). רצף עמוק של DNA immunoprecipitated (איור 4) חלקית מתגבר על מגבלה זו.

העשרה של immunoprecipitation הבא לאזור מסוים הגנומי של גורם שעתוק אינו מצביע בודאות שהגורם ישירות נקשר DNA. זה יכול להיות רק חלק במפעל מורכב כבול ל- DNA. זוהי נקודה חשובה להיות מודע על. לעומת זאת, assay פיגור ג'ל יכול לשמש כדי לענות על השאלה.

כך את הטכנולוגיה בידות בשילוב עם רצף עמוק מאפשר לפקח הגנום רחב האזורים גנומי תפוסים על ידי גורמי שעתוק או סימן היסטון ספציפי. הטכנולוגיה משתפרת ומאפשרת לחקור SMA רקתא ll אוכלוסיות 15. בכך היא פותחת אפיקים חדשים בדינמיקה של נופים אפיגנטיים ספציפיים במהלך ההתפתחות העוברית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics