Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Specifiek gen transcriptie is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Het biologisch proces wordt gemedieerd door transcriptiefactoren die genomische regulatoire gebieden zoals enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die worden blootgesteld aan chemische modificaties. Modificaties van histonen verder leiden tot een onderdrukte, geactiveerd of poised gentranscriptie, dus brengt een ander niveau van fine tuning regulatie van gentranscriptie. Embryonale stamcellen (ES-cellen) herhalen binnen embryo organen (dwz cel aggregaten) of 2D kweek de vroege stappen van ontwikkeling van het hart. Ze bieden in principe genoeg materiaal voor chromatine immunoprecipitatie (chip), een technologie die in grote lijnen gebruikt om gen regulerende gebieden te identificeren. Verder menselijke embryonale cellen vormen een menselijke cel model van cardiogenese. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels mogelijk makenonderzoek naar specifieke epigenetische landschappen die nodig zijn voor de bepaling van de cel identiteit. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of ChIP-sequencing met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio's. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.

Introduction

Het hart is het eerste orgaan te vormen en functioneel in het embryo worden. Het hart is opgebouwd uit vele cellijnen die voortkomen uit de eerste en tweede embryonale hart velden 1. Uit de post-bevruchting blastocyst stadium tot aan de gevormde hart, embryonale cellen moeten dus veel mobiele beslissingen over het lot te maken. Gene transcriptie wordt geregeld in een tijd- en ruimte-afhankelijke manier en is een belangrijk biologisch proces dat lot van de cel beslissing ten grondslag ligt tijdens de embryonale ontwikkeling. Een dergelijke werkwijze wordt gemedieerd door specifieke transcriptiefactoren die regelende gebieden in het genoom waaronder enhancers en promoters van cardiale genen constitutieve binden. DNA wordt rond histonen die onderhevig zijn aan modificaties zoals acetylatie, methylatie, ubiquitinylation en / of fosforylering. Histon modificatie leidt tot onderdrukte, geactiveerd of evenwichtig gentranscriptie afhankelijk van welke lysinerest van histon is gemodificeerd 2.

jove_content "> Chromatine immunoprecipitatie assay (chip) is opgericht jaar geleden 3 en is momenteel de meest algemeen gebruikte technologie om targets van een van beide gemodificeerde histonen of transcriptiefactoren 4. Na immunoprecipitatie van histonen of transcriptiefactoren identificeren, kan gebonden DNA hetzij geamplificeerd door polymerasekettingreactie (PCR) en gesequenced. ChIP heeft technisch overwonnen lastiger gelretardatie assays 5. echter ChIP geen directe binding van een transcriptiefactor aan DNA, een voordeel van gelretardatie assay impliceren. anderzijds, ChIP gecombineerd om DNA sequentiebepaling een nieuwe genoom-brede kijk op genregulatie geopend.

ES-cellen (ES-cellen) recapituleren binnen embryo lichamen (bijv., Mobiele aggregaten) of in 2D cultuur van de eerste stappen van de ontwikkeling van het hart 6 en bieden in principe genoeg materiaal voor de chip. Bovendien humane ES-cellen zijn een menselijke cel model cardiogenesis hoewel hun potentieel cardiogene afhankelijk van hun epigenetische handtekening 7. In latere stadia van ontwikkeling, muis embryonale weefsels zorgen voor het onderzoeken van specifieke epigenetische landschappen vereist voor het bepalen van celidentiteit. Echter, het genoom getranscribeerd in een tijds- en celtype-specifieke wijze 8. Epigenetische regulatie van gentranscriptie moet worden bestudeerd in gelokaliseerde gebieden. Hierin beschrijven we de protocollen van de chip, sequentiële ChIP gevolgd door PCR of sequentiebepaling met behulp van ES-cellen, embryo lichamen en cardiale specifieke embryonale regio's. Deze protocollen laten onderzoeken van de epigenetische regulatie van cardiale gen-transcriptie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA-eiwit Verknoping

  1. Fix in 15 ml buisjes geoogste-ES-cellen (2 x 10 6 cellen regelmatige ChIP, 2 x 10 5 cellen Microchip), embryo organen (EBS) gegenereerd uit ES-cellen en embryonale hartweefsel ontleed van E9.5 muizenembryo's (atrioventriculaire kanaal uitstroombaan en ventrikel) middels 1% formaldehyde in PBS gedurende cellen of permeabilisatie buffer PB2 voor embryonale weefsels. Plaats de buizen op rondschudapparaat bij een snelheid van 60 rpm bij kamertemperatuur gedurende exact 10 minuten.
  2. Stop de verknopingsreactie door toevoeging van glycine tot een eindconcentratie van 125 mM en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting bij snelheid van 60 rpm.

2. Cell Lysis en chromatine fragmentatie

  1. Was tweemaal verknoopte cellen geresuspendeerd in 10 ml PBS 1x of embryonale weefsels geresuspendeerd in 1 ml PB2. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de supernatanten. </ Li>
  2. Voeg proteaseremmers aan PB1 of PB2 (2 ug / ml leupeptine, 1 ug / ml aprotinine en 0,1 mM PMSF) (Tabel 1) buffer. Resuspendeer de celpellet of embryonaal weefsel uit stap 1 in 2,1 ml buffer PB1 of PB2 respectievelijk. Pipet op en neer en resuspendeer de cellen of weefsels. Gebruik een 1 ml spuit met een 21 gauge naald om cellen of weefsels te homogeniseren. Incubeer bij 4 ° C (op een wiel) gedurende 10 min.
  3. Spin down bij 3.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant.
  4. Resuspendeer de pellet in 300 gl respectieve SB buffers (tabel 1) aangevuld met proteaseremmers in een schone buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) één DNA degradatie voorkomen. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten op ijs.
  5. Ultrasone trillingen de monsters bij 4 ° C om de chromatine met een sonicator volgens de in tabel 2 vermeld voor elk materiaal programma scheren. Pas duur ultrasoonapparaat, afhankelijk van de volgende applicatie (<em> dat wil zeggen, PCR of sequencing). Geknipt DNA grootte moet ongeveer 500 bp voor PCR en 300 bp voor sequencing.
  6. Centrifugeer gesonificeerd cellysaat gedurende 10 minuten bij 6000 xg bij 4 ° C en breng het supernatans (chromatine) in een schone buis van 1,5 ml en gooi de pellet.
  7. Verdun het chromatine in oplossing (supernatant buffer B) gedurende 10 maal met water en beoordeelt de extinctie toepassing van 1,5 pi van een nano-spectrofotometer. Lees de concentratie van eiwitten in pg / pl volgens de volgende formule: 1,55 OD x 280-0,76 x 260 OD.
Buffer benutting Samenstelling materialen
EEN permeabilisatie PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 Alle
PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100 embryonaal weefsel
B Lysis / Sonicatie SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 ESC
SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7.9; 140 mm; 1 mM EDTA; 0,1% deoxycholaat; 0,1% SDS EBS
SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% laurylsarcosine embryonaal weefsel
C ChIP buffer 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. Alle
D DNA / eiwit Elution D1: 1% SDS; 1003 mM NaHCOs
D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E DNA-bindende kralen voorbereiding E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA

Tabel 1. ChIP buffers.

Materiaal sonicatie programma
Embryonale stamcellen 15 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF
embryoid lichamen 30 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF
embryonale weefsels 21 cycli van 30 sec ON en 30 sec OFF

Tabel 2. Sonicatie Programs.

3. Immunoprecipitatie enwast

  1. Was 3 maal proteïne A-geconjugeerde kralen met buffer C. Neem 100 ul van kralen in een schone buis van 1,5 ml en voeg 1 ml buffer C (Tabel 1). De buis wordt dan overgebracht op een magneet; wacht 1 min en zuig de supernatant. Tweemaal herhalen de wasstap.
  2. Incubeer antilichaam opgewekt tegen gemodificeerde histonen of transcriptiefactor (concentraties in tabel 3) met 20 ul Proteïne A gewassen geconjugeerde kralen en 1 ml buffer C aangevuld met proteaseremmers in een schone buis van 1,5 ml. Stel de monsters op een rotator bij 40 rpm gedurende ten minste 2 uur bij 4 ° C.
  3. Wash antilichaam-complexen beads 3 maal met 1 ml buffer C (3,1 manipulatie beschreven).
  4. Bereid 2 buizen, een met 150 ug chromatine en antilichaam-beads-complexen en de andere buis met 150 ug chromatine en 20 ui gewassen kralen; Voeg 1 ml buffer C aangevuld met proteaseremmers aan elke buisen incubeer de monsters op een roterend wiel bij 40 rpm gedurende de nacht bij 4 ° C.
    Opmerking: De concentratie van chromatine moet minstens 300 pg tot een transcriptiefactor of sequentiële ChIP immunoprecipitatie.
Standaard concentratie (ng / gl) Volume (pl) Totaal DNA-concentratie (ng)
EEN 10.0 1 10.0
B 5.00 1 5.00
C 2.50 1 2.50
D 1.25 1 1.25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
G 0,156 1 0,156
H 0.0 1 0.0

Tabel 3. Normen concentraties.

4. DNA Elutie, Cross-link-Reversal en Proteinase K Digestion

  1. Stel de monsters in de magnetische rek. Herstellen van de supernatant dat ongebonden antilichaam chromatine.
    OPMERKING: Monsters kunnen snel ingevroren in vloeibare stikstof bij die stap en opgeslagen bij -80 ° C. Chromatine kunnen worden gebruikt in andere immunoprecipitatie assays met andere antilichamen. Was elk monster 3 maal met 1 ml buffer C (manipulatie eerder beschreven).
  2. Elueer het antilichaam gebonden eiwit door toevoeging van 150 ul buffer D1 of D2 indien sequentiële chip moet worden gedaan (tabel 1) tot gewassen ChIP materiaal en incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 50 ° C in een verwarmingsblok.
  3. Verwijderen buizen uitde verwarming blok en zet de monsters in de magnetische rek, herstellen van de bovenstaande vloeistof in een schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) en gooi de kralen.
  4. Gebruik supernatant een sequentiële toevoeging ChIP 1-3 ug van het tweede antilichaam in 2 volumes buffer C of omgekeerde verknopen door toevoeging van 5 M NaCl tot een eindconcentratie van 200 mM te verkrijgen.
  5. Bereid een inputsteekproef van chromatine in een schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij) waarbij evenveel chromatine als die van de IP monster (150 ug) in een eindvolume van 150 ui water (RNase DNase gratis water). Voeg 5M NaCl tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM. Incubeer de monsters een nacht bij 65 ° C.
  6. De volgende dag, verwijder monsters van het verwarmingsblok, voeg 250 mM EDTA tot een eindconcentratie van 12,5 mM en proteinase K te verkrijgen tot een uiteindelijke concentratie van 250 ug / ml in de ChIP materiaal te verkrijgen en verwerken bij 55 ° C gedurende 2 uur in de blokverwarming.

  1. Bereiding van kralen
    1. Start de korrels bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min, vortex de kralen grondig te brengen. Kralen vestigen, zo snel werken als pipetteren. Breng 1 ml kralen in schone 1,5 ml buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij).
    2. Stel op magneet, wacht 2-3 minuten voor de oplossing te verduidelijken, teruggooi supernatant. Verwijderen uit magneet, voeg 1 ml van 0,5 M EDTA en meng door kort vortexen.
    3. Herhaal stap 5.1.2 twee keer, en gooi supernatant aan het eind.
    4. Verwijderen uit magneet, voeg 1 ml buffer E en langzaam resuspendeer de kralen. Breng de gehele mengsel (kralen in buffer E) in 50 ml buffer E. plaatsen op een schudapparaat en laat het mengsel langzaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    5. Test DNA-bindende kralen volgens de zuiveringsprotocol daaronder; 3 experimentele omstandigheden beschreven: 50 ui bolletjes / 50 ui DNA (1 volume / volume 1), 100 ui kralen/ 50 pl DNA (2 volumes / 1 volume) en 125 pl kralen / 50 pl DNA (2,5 volume / volume 1). Laat migreren gezuiverd DNA op een 1,5% agarosegel om de grootte van de fragmenten (Figuur 1A) controleren.
  2. DNA Purification
    1. Voeg 425 pl (2,5 volumina) DNA binding magnetische beads aan elk DNA-monster (ongeveer 170 ui). Resuspendeer langzaam op en neer te pipetteren (ongeveer 10 keer) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
    2. Plaats op magneet gedurende 5 minuten, dan aspireren supernatant en gooi (op magneet).
    3. Voeg 600 ul van vers bereide 80% ethanol aan de buis op magneet, wacht 1 min, aspireren supernatant af en gooi en herhaal de vorige stap nog eens.
    4. Geef een snelle rotatie, gedurende 5 sec (microfuge), plaats de buis op de magneet en verwijder de laatste druppels ethanol. Laten drogen 1 min bij KT
    5. Elueer het DNA door het toevoegen van 20 ul van DNase RNase vrij water. Verwijderen uit de magneet en vortex het monster.
    6. Incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur en plaats monsters op magneet. Aspireren geëlueerde DNA in een nieuwe buis (gecertificeerd RNase-, DNase- en pyrogeenvrij).
    7. Voer het DNA van de inputfractie op een 1,5% agarosegel om de grootte van DNA-fragmenten (Figuur 1B) controleren.

6. DNA Kwantificering Met behulp van een fluorescentiedetectie Instrument

  1. Serieel verdund in water 1 pg DNA (1 kb ladder) in totaal 7 verdunningen en een niet-DNA point (verdunningen verzameld in Tabel 3) werd verkregen.
  2. Bereid een oplossing van PCR Green I kleurstof, voldoende voor alle monsters (gezuiverd DNA en standaard verdunningen AH): verdunnen 10.000 x de groene kleurstof in 1x TE-buffer.
  3. Voeg 1 pl van elk DNA monsters (gezuiverd DNA en standaardverdunningen AH) aan 10 pl 1x groene kleurstof mix capillairen cuvettes worden gelezen in een fluorimeter bij 488 nm golflengte. Voor de niet-DNA-test, gebruik maken van 1 pl van de 1 x TE-buffer.
  4. Bouweneen ijkkromme met een grafische software en bepalen de relatieve concentraties om te zien welke DNA-monsters in ng / ul. Het DNA is dan klaar voor PCR of sequencing bibliotheken te maken.

7. PCR

  1. Selectie van primers
    1. Ontwerp primers van belang voor de genomische regio's van belang ondervragen. Ontwerp primers aan enhancer gebieden van genen met behulp van de UCSC genoom browser te versterken. Enhancers worden verder voorspeld met behulp van H3K4me1 of p300 ChIP-seq 9 gegevens beschikbaar in GEO-dataset.
  2. PCR
    1. Run PCR reacties voor 45 cycli (8 sec 95 ° C, 8 sec 60 ° C, 8 sec 72 ° C) met een real-time PCR thermocycler in 25 pi groene kleurstof mix, 2 ng DNA en 0,5 ui primer mix (20 uM voorraad oplossing) 10.
  3. Analyse van de verrijking
    1. Bereken Absolute verrijking ervan uitgaande dat hoogstens 1% van nucleosoom werden immunogeprecipiteerd 11.
    2. ontr de genomische als verrijkte of 10 ng IP monsters een grotere verrijking in vergelijking met 0,1 ng DNA ingang.
    3. Drukken resultaten als de voudige toename van verrijking over een niet-verrijkte gebied na normalisatie naar de ingang en aanpassing met een niet-specifiek controlemonster.
    4. Denk aan de ingang DNA worden verdund met 100 (verdunningsfactor of DF).
    5. Normaliseren van de ingang met de volgende vergelijking 2 -ΔCt x 100%, waarbij -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
    6. Pas controle met behulp van de volgende vergelijking (ACt [IP] -ΔCt [NS]) waarbij NS is de niet-specifieke monster (geen antilichaam IP, of IgG IP).
    7. Bereken de vouw verrijking van het monster 2 -ΔΔCt. Een bestand met alle stappen van berekeningen met formules die op elke PCR monster kan worden ingevoerd zal de analyse van de resultaten te vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1A illustreert de eerste bereiding van DNA-bindende kralen en kwaliteitscontrole middels DNA van verschillende grootte (1 kb ladder). 0ne, 2 en 2,5 volumes (1-3) van de korrels werd een volume van het monster hoog en laag molecuulgrootte DNA-fragmenten te zuiveren toegevoegd.

Figuren 1 B, C, D zijn typische voorbeelden van DNA gelen uit geheel gesoniceerde DNA geëxtraheerd uit muizen ES cellen embryoïde lichamen of cardiale embryonische gebied (gepoolde 25 E9.5 ventrikels), respectievelijk.

Bij ES-cellen differentiëren in de richting van een cardiale lot van de cel, ze doorvoer eerst door een mesendodermal en vervolgens een mesodermale staat. Een dergelijke ontwikkeling reis een stap omvat waarbij epitheliale cellen een epithelio-mesenchymale overgang ondergaan

Figuur 2

Differentiatie genen hebben bivalent domeinen in ES-cellen 12. Hun 5 'UTR regio's dicht bij hun promotoren inderdaad bezet door zowel H3K4me3 een chromatine activerende merk en H3K27me3, een onderdrukte merk. Deze merken worden gewijzigd wanneer de cellen worden uitgedaagd door morfogenen zoals BMP2 7. Deze merken zijn echter variabel, afhankelijk van de menselijke embryonale stamcellen lijns waarschijnlijk door de oorspronkelijke blastocyst zij ontlenen aan zelfs wanneer ongedifferentieerde (figuur 3).

De protocollen hierboven beschreven zijn geschikt voor ChIP sequencing zelfs vanaf een lage hoeveelheid materiaal; ChIP experimenten werden uitgevoerd van chromatine geëxtraheerd uit AVC, OFT en ventrikels van E9.5 muizenembryo's om nieuwe genen en enhancers spelen een rol bij het ​​bepalen van de identiteit van deze specifieke cardiale gebieden onthullen. Figuur 4 toont 2 genomische regio van myocardiale genen in het E9.5 muis ventrikel verrijkt met een geacetyleerde H3K27 en een pacemaker-specifieke (bijv., niet ventriculair) gen niet verrijkt geacetyleerde H3K27.

Figuur 1
Figuur 1. elektroforese gegevens: DNA-bindende kralen Controleren en Sonicatie Validation. (A) DNA gezuiverd met DNA-bindende kralen, 1 volume kralen / 1 volume DNA (1) en 2 volumes kralen / 1 volume van DNA (2) en 2,5 volume kralen / 1 volume DNA (3). Grootte van DNA-fragmenten verkregen na reverse verknoping van inputfracties van muizen ES cellen (B), embryoïde lichamen (C), en embryonale hartweefsel (D). De monsters werden op 2% agarose elektroforese gels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. chip data-analyse. (A) Verrijking van H3K27ac epigenetische markering op E-cadherine enhancers / promotor (A - E regio's) (B) Verrijking van H3K4me1, H3K36me3 en H3K9me2 epige.magnetische merken op Twist enhancers / promotor (AC regio's). Genomische regio's worden versterkt door qPCR aan de histon verrijking vs de ingang volgende ChIP meten. De resultaten zijn gemiddelden ± SEM van 3 experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Sequential chip. Chromatine werd uit 4 menselijke embryonale cellijnen gewonnen en chip werd achtereenvolgens uitgevoerd met behulp van anti H3K4me3 en vervolgens anti-H3K27me3 antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. genen Nkx2.5 en Tbx5 verrijkt in de gemodificeerde histon en één genomische regio Shox2 pacemaker-specifiek gen niet verrijkt en niet tot uitdrukking in de hartkamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetica is een belangrijk gebied van onderzoek in ontwikkelingsbiologie geworden. Hoe een genetische programma wordt geactiveerd in embryonale cellen om de cellen te laten verwerven van een specifieke identiteit binnen een embryonale geslacht is al lange tijd een belangrijke vraag voor de ontwikkelingsbiologie biologen.

Chip is in grote lijnen gebruikt in de laatste jaren en gecombineerd om DNA-sequencing volgende verbetering van de resolutie van sequencing. Dit is uitgegroeid tot een krachtige techniek om te onderzoeken in een genoomwijde afhankelijke manier de epigenetische landschap van cellen of specifieke embryonale en volwassen weefsels. De ChIP assay buffers en sonicatie omstandigheden zijn sterk verbeterd assays kleine hoeveelheid biologisch materiaal mogelijk. Dit omvat specifieke gebieden van embryonale hart verkregen door microdissectie of FACS gesorteerde cellen die een fluorescent reporter proteïne. Inderdaad ChIP uitgevoerd op heterogene celpopulaties 13 14 canleiden tot misleidende resultaten die moeilijk te interpreteren zijn. De epigenetische handtekening merken zeer nauwkeurig celpopulaties. Dat handtekening verleent aan hen een specifieke potentieel van differentiatie en bepaalt hun lot. Het is daarom belangrijk om met gezuiverde (gesorteerd) celpopulaties of ontleed embryonale weefsels.

We hebben hierboven robuuste protocollen beschreven om deze doelen te bereiken. We hebben deze protocollen voor ChIP-PCR, chip die gebruikt wordt op de chip 7, 10 of ChIP-sequencing (Figuur 4, manuscript in voorbereiding). De reden voor robuustheid legt op de permeabilisatie en cellysis buffers die zijn geoptimaliseerd om een ​​volledige cel en nucleaire lysis en efficiënte chromatine sonicatie waarborgen. De protocollen kan dus worden gebruikt voor kleine hoeveelheid embryonale weefsels.

Beperkingen van deze protocollen zijn inherent aan chip. Meer specifiek is de ruimtelijke resolutie is zeer hoog met DNA afmetingen ongeveer 500 bp. Hoeooit, het stelt ons in om de dynamiek van bivalent domeinen te onderzoeken in het onderscheiden van ES-cellen 7 en verschillen in de verrijking van gemodificeerde histonen op EMT-gen regulerende gebieden in het wild type of gen gemuteerde cellen te onthullen. (Figuur 2). Sequentie-analyse van immunogeprecipiteerd DNA (Figuur 4) gedeeltelijk ondervangt deze beperking.

Verrijking van specifieke genomische regio na immunoprecipitatie van een transcriptiefactor vermeldt niet of de factordirect DNA bindt. Dit zou slechts een deel van de fabriek complex gebonden aan DNA. Dit is een belangrijk punt om bewust te zijn over. Daarentegen kan gelretardatie assay worden gebruikt om de vraag te beantwoorden.

Het hebben van de technologie in handen in combinatie met diepe sequencing maakt het mogelijk om te controleren genoomwijde de genomische regio bezet door een transcriptiefactoren of een specifieke histon markering. De technologie verbetert en laat het ondervragen alleen small celpopulaties 15. Het opent dus nieuwe wegen in de dynamiek van specifieke epigenetische landschappen tijdens de embryonale ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics