Epigenetisk forordning af Cardiac Differentiering af embryonale stamceller og væv

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En finjustering regulering af gen transskription ligger til grund embryonal celle skæbne beslutning. Heri beskriver vi chromatin immunopræcipitationsanalyser anvendt til at undersøge epigenetisk regulering af både hjerte- differentiering af stamceller og kardial udvikling af musefostre.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Specifik gentransskription er en vigtig biologisk proces, der ligger til grund celleskæbne beslutning under fosterudviklingen. Den biologiske proces medieres af transkriptionsfaktorer, som binder genomiske regulatoriske regioner, herunder forstærkere og initiativtagere til hjerte-konstitutive gener. DNA er viklet rundt histoner, der udsættes for kemiske modifikationer. Ændringer af histoner føre yderligere til undertrykt, aktiveret eller balancerer gentranskription, hvilket bringer et andet niveau af finjustering regulering af gen transskription. Embryonale stamceller (ES-celler) rekapitulere inden embryoide legemer (dvs. celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trin i hjerte- udvikling. De giver i princippet nok materiale til kromatin immunofældning (chip), en teknologi bredt anvendt til at identificere regulatoriske regioner gen. Endvidere humane ES-celler repræsenterer en human celle model af cardiogenese. På senere stadier af udvikling, mus embryonale væv tilladerundersøge specifikke epigenetiske landskaber kræves til bestemmelse af celle identitet. Heri beskriver vi protokoller chip, sekventiel chip efterfulgt af PCR eller chip-sekventering ved hjælp ES-celler, embryoide organer og hjerte-specifikke embryonale regioner. Disse protokoller gør det muligt at undersøge epigenetisk regulering af hjerte gentranskription.

Introduction

Hjertet er det første organ, der skal dannes, og at blive funktionelle i embryoet. Hjertet er bygget af mange cellelinier, der opstår fra den første og anden embryonale hjerte felter 1. Fra post-befrugtning blastocyst-stadiet til formede hjerte, har embryonale celler således at gøre mange celle fate beslutninger. Gentransskription reguleres på en tids- og rum-afhængig måde og er en vigtig biologisk proces, der ligger til grund celleskæbne beslutning under fosterudviklingen. En sådan proces medieres af specifikke transkriptionsfaktorer, som binder regulatoriske regioner i genomet, herunder enhancere og promotorer af kardiale konstitutive gener. DNA er viklet rundt histoner, der udsættes for modifikationer, såsom acetylering, methylering, ubiquitinylation, og / eller phosphorylering. Histon modifikation fører til undertrykt, aktiveret eller poised gentransskription afhængigt af hvilken lysinrest af histon modificeres 2.

jove_content "> chromatin immunopræcipitationsassay (chip) er blevet oprettet år siden 3 og er i øjeblikket den mest bredt anvendt teknologi for at identificere mål af enten modificerede histoner eller transkriptionsfaktorer fire. Efter immunopræcipitation af histoner eller transkriptionsfaktorer, kan bindes DNA være enten amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) eller sekventeret. chip har teknisk overvundet mere udfordrende gel retarderingsassays 5. chip betyder imidlertid ikke, at direkte binding af en transkriptionsfaktor til DNA, en fordel ved gelforsinkelsesassay. på den anden side, ChIP kombineres til DNA-sekventering har åbnet en ny genom-dækkende perspektiv på genregulering.

ES-celler (ES-celler) rekapitulere inden embryoide legemer (dvs.., Celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trin i hjerte- udvikling 6 og tilvejebringer i princippet tilstrækkeligt materiale til chip. Endvidere humane ES-celler repræsenterer en human celle model af cardiogenesis selvom deres kardiogent potentiale afhænger af deres epigenetisk signatur 7. På senere stadier af udvikling, mus embryonale væv mulighed for at undersøge specifikke epigenetiske landskaber kræves til bestemmelse af celle identitet. Imidlertid er genomet transkriberes i en tids- og celletype-specifik måde 8. Epigenetisk regulering af gentranskription der skal læses inden lokaliserede regioner. Heri beskriver vi protokoller chip, sekventiel chip efterfulgt af PCR eller sekventering ved hjælp ES-celler, embryoide organer og hjerte-specifikke embryonale regioner. Disse protokoller gør det muligt at undersøge epigenetisk regulering af hjerte gentranskription.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA-protein Tværbinding

  1. Fix i 15 ml rør høstet-ES-celler (2 x 10 6 celler til regelmæssig chip, 2 x 10 5 celler til mikrochip), embryoide organer (EBS), der genereres fra ES-celler og embryonale hjerte væv dissekeret fra E9.5 musefostre (AV kanalen, udstrømning tarmkanalen og ventrikel) under anvendelse af 1% formaldehyd i PBS i celler eller i permeabilisering PB2 buffer for embryonale væv. Anbring glassene på orbitalryster ved en hastighed på 60 rpm ved stuetemperatur i nøjagtig 10 min.
  2. Stop tværbindingen reaktionen ved tilsætning glycin til en slutkoncentration på 125 mM og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur på orbitalryster ved en hastighed på 60 rpm.

2. Cell Lysis og chromatin Fragmentering

  1. Vask to gange tværbundne celler resuspenderet i 10 ml PBS 1x eller embryoniske væv resuspenderet i 1 ml PB2. Centrifuger ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Kassér supernatanterne. </ Li>
  2. Tilføj proteaseinhibitorer til buffer PB1 eller PB2 (2 ug / ml leupeptin, 1 ug / ml aprotinin og 0,1 mM PMSF) (tabel 1). Resuspender cellepelleten eller fostervæv fra trin 2.1 i 1 ml buffer PB1 eller PB2 henholdsvis. Pipette op og ned og udeluk cellerne eller væv. Brug en 1 ml sprøjte med en 21 gauge nål for at homogenisere celler eller væv. Der inkuberes ved 4 ° C (på et hjul) i 10 minutter.
  3. Spin ned ved 3.000 x g i 5 min ved 4 ° C og supernatanten.
  4. Pellet resuspenderes i 300 pi af respektive SB buffere (tabel 1) suppleret med proteaseinhibitorer i et rent rør (certificeret RNase-, DNase- og pyrogenfrit) for at forhindre DNA-nedbrydning. Inkuber i 15 til 30 minutter på is.
  5. Sonikeres prøverne ved 4 ° C for at forskyde chromatin under anvendelse af en sonikator ifølge programmer opført i tabel 2 for hvert materiale. Juster sonikering varighed afhængigt af den næste ansøgning (<em> dvs PCR eller sekventering). Skåret DNA størrelse bør være omkring 500 bp til PCR og 300 bp til sekventering.
  6. Centrifuger sonikeret cellelysatet i 10 minutter ved 6.000 xg ved 4 ° C, overføres supernatanten (kromatin) i et rent 1,5 ml rør og kassér pelleten.
  7. Fortynd kromatin i opløsning (supernatant buffer B) i 10 gange med vand og vurdere den optiske densitet under anvendelse af 1,5 pi i en nano-spektrofotometer. Få koncentrationen af proteiner i pg / pl ved hjælp af følgende formel: 1,55 x OD 280 til 0,76 x OD 260.
Buffer Udnyttelse Sammensætning Materialer
EN permeabilisering PB1: 5 mM PIPES pH 8; 85 mM KCI; 0,5% NP40 Alle
PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCI2 60 mM KCI, 0,5% Triton X-100 fostervæv
B Lyse / Sonikering SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCI pH 8 ESC
SB2: 50 mM HEPES-KOH pH 7,9; 140 mM; 1 mM EDTA; 0,1% deoxycholat; 0,1% SDS EB
SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCI, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% TRITON-X100, 0 .1% SDS, 0,5% laurylsarcosin fostervæv
C chip buffer 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCI pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% TRITON-X100. Alle
D DNA / protein Eluering D1: 1% SDS; 100mM NaHCO3
D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E DNA-bindende beads forberedelse E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCI pH 8; 1 mM EDTA

Tabel 1. CHIP buffere.

Materiale sonikering program
Embryonale stamceller 15 cykler af 30 sek ON og 30 sek OFF
embryoide legemer 30 cykler af 30 sek ON og 30 sek OFF
embryonale væv 21 cykler af 30 sek ON og 30 sek OFF

Tabel 2. Sonikering programmer.

3. Immunpræcipitation ogvasker

  1. Vask 3 gange Protein A-konjugeret perler med buffer C. Tag 100 pi perler i et rent 1,5 ml rør, og der tilsættes 1 ml af puffer C (tabel 1). Røret overføres derefter til en magnet; Vent i 1 minut og aspirere supernatanten. Gentag to gange vasketrinet.
  2. Inkuber antistof rejst mod modificerede histoner eller transkriptionsfaktor (koncentrationer angivet i tabel 3) med 20 pi vasket Protein A konjugerede perler og 1 ml puffer C suppleret med proteaseinhibitorer i et rent 1,5 ml rør. Indstil prøverne på en rotator ved 40 rpm i mindst 2 timer ved 4 ° C.
  3. Vask antistof-perler komplekser 3 gange med 1 ml puffer C (manipulation beskrevet i 3.1).
  4. Forbered 2 rør, det ene indeholdende 150 ug kromatin og antistof-perler komplekser og det andet rør indeholdende 150 ug kromatin og 20 pi vaskede perler; Der tilsættes 1 ml puffer C suppleret med proteaseinhibitorer til hvert rørog inkuber prøverne på et roterende hjul ved 40 rpm natten over ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Koncentrationen af ​​kromatin skal være mindst 300 ug til immunpræcipitere en transskriptionsfaktor eller til sekventiel chip.
Standard koncentration (ng / pl) Volumen (pi) Totalt DNA-koncentration (ng)
EN 10,0 1 10,0
B 5.00 1 5.00
C 2.50 1 2.50
D 1.25 1 1.25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
G 0,156 1 0,156
H 0,0 1 0,0

Tabel 3. Standarder koncentrationer.

4. DNA Eluering, Cross-link Reversal og proteinase K fordøjelse

  1. Sæt prøverne i det magnetiske stativ. Opsaml supernatanten indeholdende ubundet antistof kromatin.
    BEMÆRK: Prøver kan hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen ved det trin og opbevaret ved -80 ° C. Kromatin kan anvendes i andre immunopræcipitationsanalyser med andre antistof. Vask hver prøve 3 gange med 1 ml puffer C (manipulation beskrevet før).
  2. Eluere antistoffet-bundne protein ved tilsætning 150 pi puffer D1 eller D2 hvis sekventiel chip har skal gøres (tabel 1) til vaskede chip materialer og inkuber prøverne i 20 min ved 50 ° C i en varmeblok.
  3. Fjern rør fravarmeenheden og sætte prøver i den magnetiske rack, genvinde supernatanten i et rent 1,5 ml rør (certificeret RNase-, DNase-, og pyrogenfrit) og kassér perlerne.
  4. Brug supernatanten til en sekventiel chip tilsætning af 1 til 3 ug af det andet antistof i 2 volumener puffer C eller omvendt krydsbinding ved tilsætning af 5 M NaCl til opnåelse af en slutkoncentration på 200 mM.
  5. Forbered et input prøve af kromatin i et rent 1,5 ml rør (certificeret RNase-, DNase- og pyrogenfrit) tager den samme mængde chromatin som den for IP prøve (150 ug) i et endeligt volumen på 150 pi vand (RNase DNase frit vand). Tilføj 5M NaCI til en slutkoncentration på 200 mM. Inkuber prøverne natten over ved 65 ° C.
  6. Næste dag, fjerne prøver fra varmeblokken, tilsættes 250 mM EDTA til opnåelse af en slutkoncentration på 12,5 mM og proteinase K til opnåelse af en slutkoncentration på 250 ug / ml i chippen materiale og fordøje ved 55 ° C i 2 timer i varmeblok.

  1. Fremstilling af perler
    1. Begynd at bringe perlerne ved stuetemperatur i mindst 30 min, vortex perlerne meget grundigt. Perler slå sig ned, så arbejder hurtigt, når pipettering. Overfør 1 ml perler i rent 1,5 ml rør (certificeret RNase-, DNase-, og pyrogenfrit).
    2. Set på magnet, vent til 2 - 3 min for løsningen at afklare, discard supernatant. Fjern fra magnet, tilsættes 1 ml 0,5 M EDTA og bland ved kort vortexing.
    3. Gentag trin 5.1.2 to gange, og kassér supernatanten ved udgangen.
    4. Fjern fra magnet, tilsættes 1 ml puffer E og langsomt resuspender perlerne. Overfør hele mix (perler i puffer E) i 50 ml puffer E. Place på et rysteapparat og lad det blandes langsomt ved stuetemperatur i 1 time.
    5. Test-DNA-bindende beads følge fremgangsmåden beskrevet nedenfor under anvendelse af 3 forsøgsbetingelser oprensningsprotokol: 50 pi perler / 50 pi DNA (1 volumen / 1 volumen), 100 pi perler/ 50 pi DNA (2 volumener / 1 volumen) og 125 pi perler / 50 pi DNA (2,5 volumener / 1 volumen). Lad migrere oprenset DNA på en 1,5% agarosegel for at kontrollere størrelsen af fragmenterne (figur 1A).
  2. DNA Oprensning
    1. Tilføj 425 pi (2,5 volumener) af DNA-bindende magnetiske perler til hver DNA-prøve (ca. 170 pi). Resuspender langsomt ved pipettering op og ned (ca. 10 gange), og der inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
    2. Sted på magnet i 5 minutter, derefter aspireres supernatanten og kassér (på magnet).
    3. Tilføj 600 ul frisklavet 80% ethanol til røret på magneten, vent 1 minut, aspireres supernatanten og kassér og derefter gentage det forrige trin en gang mere.
    4. Giv en hurtig tur, i 5 sek (mikrocentrifuge), placer røret på magneten og fjerne de sidste dråber af ethanol. Lad tørre i 1 min ved stuetemperatur
    5. Eluering af DNA ved tilsætning af 20 pi DNase RNase-frit vand. Fjern fra magnet og vortex prøven.
    6. Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur og derefter placere prøver på magnet. Aspirat eluerede DNA i et nyt rør (certificeret RNase-, DNase- og pyrogenfrit).
    7. Kør DNA'et fra input fraktion på en 1,5% agarosegel for at kontrollere størrelsen af DNA-fragmenter (figur 1b).

6. DNA Kvantificering Ved hjælp af en Fluorescence Detection Instrument

  1. Serielt fortyndet i vand 1 ug DNA (1 kb ladder), hvilket gav i alt 7 fortyndinger plus en no-DNA punkt (fortyndinger indsamlet i tabel 3).
  2. Forbered en opløsning af PCR Green I farvestof, tilstrækkelig for alle prøver (renset DNA og standard fortyndinger AH): fortynd 10.000 x den grønne farvestof i 1x TE-buffer.
  3. Tilsæt 1 pi af hver DNA-prøver (oprenset DNA og standardfortyndinger Ah) til 10 pi 1x grønt farvestof mix i kapillærer kuvetter at blive læst i et fluorimeter ved 488 nm bølgelængde. For no-DNA assay bruge 1 pi af 1 x TE-buffer.
  4. Bygen kalibreringskurve ved hjælp af en grafisk software og bestemme de relative koncentrationer til den række af DNA-prøver i ng / pl. DNA'et er derefter klar til PCR eller gøre sekventering biblioteker.

7. PCR

  1. Udvælgelse af primere
    1. Design primere af interesse at afhøre de genomiske regioner af interesse. Design primere til amplifikation enhancer regioner af gener under anvendelse UCSC genom browser. Enhancers er yderligere forudsagt ved hjælp H3K4me1 eller p300 chip-seq 9 data tilgængelige i GEO datasæt.
  2. PCR
    1. Kør PCR reaktioner for 45 cykler (8 sec 95 ° C, 8 sek 60 ° C, 8 sek 72 ° C) under anvendelse af en real-time PCR thermocycler i 25 pi grønt farvestof mix, 2 ng DNA og 0,5 pi primer mix (20 uM stamopløsning) 10.
  3. Analyse af berigelse
    1. Beregn Absolute berigelse antagelse, at højst 1% af nukleosom blev immunpræcipiteret 11.
    2. consider den genomiske som beriget hvis 10 ng IP prøverne viser en større berigelse sammenlignet med 0,1 ng indført DNA.
    3. Udtrykke resultaterne som den fold stigning i berigelse over en ikke-beriget region efter normalisering til input og justering med en ikke-specifik kontrolprøve.
    4. Overvej input DNA, der skal fortyndes med 100 (fortyndingsfaktor eller DF).
    5. Normalisere input ved hjælp af følgende ligning 2 -ΔCt x 100%, hvor -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
    6. Juster kontrol ved hjælp af følgende ligning (ACt [IP] -ΔCt [NS]), hvor IF er den ikke-specifikke prøve (ingen antistof IP, eller IgG IP).
    7. Beregn fold berigelse af prøven som 2 -ΔΔCt. En fil herunder alle trin i beregninger med formler, hvor kun hver PCR prøve kan indtastes, vil lette analysen af ​​resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser først fremstillingen af DNA-bindende perler og kvalitetskontrol under anvendelse af DNA fra forskellige størrelser (1 kb stige). 0ne, 2 og 2,5 voluminer (1 til 3) af perler blev tilsat til et volumen af ​​prøven til oprensning med høj og lav molekylær størrelse DNA-fragmenter.

Figurerne 1 B, C, D er typiske eksempler på DNA-geler fra hele sonikeret DNA ekstraheret fra muse ES-celler, embryoide legemer eller en hjerte embryonisk region (poolet 25 E9.5 ventrikler) hhv.

Når ES-celler differentierer mod en hjerte-celle skæbne, transit de først gennem en mesendodermal og derefter en mesodermal tilstand. Sådan en udviklingsmæssig rejsen omfatter et trin, hvor epitelceller nødt til at gennemgå en epithelio-mesenkymale overgang

Figur 2

Differentieringsfaktorer gener har bivalente domæner i ES-celler 12. Deres 5 'UTR regioner tæt på deres promotorer faktisk besat af både H3K4me3 en kromatin aktiverende mærke og H3K27me3, en undertrykt mærke. Disse mærker er ændret, når celler udfordres af morfogener såsom BMP-2 7. Disse mærker er dog variabel afhængigt af humane ES-celler linjes sandsynligvis på grund af den oprindelige blastocyst de stammer fra, selv når udifferentieret (figur 3).

Protokollerne beskrevet ovenfor er egnede til chip sekventering selv begynder fra en lav mængde materiale; Chip blev udført fra kromatin udvundet af AVC, OFT og ventrikler E9.5 musefostre for at afdække nye gener og forstærkere spiller en rolle i at definere identiteten af disse specifikke hjerte-regioner. Figur 4 viser 2 genomiske regioner af myokardie gener i den E9.5 muse ventrikel beriget af en acetyleret H3K27 og en pacemaker-specifik (dvs.., ikke ventrikulære)-genet ikke beriget af acetyleret H3K27.

figur 1
Figur 1. Elektroforese Data: DNA-bindende perler Kontrol og Lydbehandling Validation. (A) DNA oprenset ved DNA-bindende beads, 1 volumen perler / 1 volumen DNA (1) og 2 volumener perler / 1 volumen DNA (2) og 2,5 volumen af perler / 1 volumen DNA (3). Størrelse af DNA-fragmenter opnået efter revers krydsbinding af input fraktioner af muse ES-celler (B), embryoide legemer (C), og embryonale hjertevæv (D). Prøverne blev kørt på to% agarose elektroforesegeler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. chip Data Analysis. (A) Berigelse af H3K27ac epigenetisk præg på E-cadherin forstærkere / promotor (A - E-regioner) (b) tilsætning af H3K4me1, H3K36me3 og H3K9me2 epige.tiske mærker på Twist forstærkere / promotor (AC regioner). Genomiske regioner forstærkes af qPCR at måle histon berigelse vs input efter chip. Resultaterne er middel ± SEM fra 3 eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Sekventiel chip. Kromatin- blev ekstraheret fra 4 humane ES-cellelinjer og chip blev udført sekventielt bruge anti H3K4me3 og derefter anti-H3K27me3 antistoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. hjerte-gener Nkx2.5 og Tbx5 beriget i den modificerede histon og en genomisk region af Shox2 pacemaker-specifikt gen ikke beriget og ikke udtrykkes i ventriklen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetik er blevet et vigtigt forskningsområde i udviklingsmæssige biologi. Hvordan et genetisk program aktiveres i embryonale celler for at give cellerne erhverve særlige identitet i en embryonal slægt har været i lang tid et centralt spørgsmål for udviklingsmæssige biologer.

Chip har været bredt anvendt inden for de sidste år, og kombineres til DNA-sekventering efter forbedring i opløsning på sekventering. Dette er blevet en kraftfuld teknik for at undersøge i et genom bred afhængig måde den epigenetiske landskab af celler eller specifikke embryonale og voksne væv. Chippen assay buffere og lydbehandling betingelser er blevet væsentligt forbedret til at tillade assays for lille mængde biologisk materiale. Dette omfatter specifikke områder af embryonale hjerter fremstillet ved mikrodissektion eller ved FACS-sorteret celler, der udtrykker et fluorescerende reporter protein. Faktisk chip udført på heterogene cellepopulationer 13 14 kanføre til misvisende resultater, der er vanskelige at fortolke. De epigenetiske signatur mærker meget præcist cellepopulationer. At signatur giver dem en bestemt potentiale differentiering og bestemmer deres skæbne. Det er derfor vigtigt at arbejde med oprensede (sorteret) celle populationer eller dissekeret embryonale væv.

Vi har beskrevet ovenfor robuste protokoller for at opnå disse mål. Vi har anvendt disse protokoller til chip-PCR, chip på chip 7, 10 eller chip-sekventering (fig 4, manuskript under udarbejdelse). Årsagen til robusthed lægger på permeabilisering og cellelyse buffere, der er optimeret for at sikre en komplet celle og nuklear lysis og effektiv kromatin lydbehandling. Protokollerne kan således anvendes til lille mængde væv fra fostre.

Begrænsninger af disse protokoller er uløseligt forbundet med chip. Mere specifikt den rumlige opløsning ikke er meget høj med DNA størrelser omkring 500 bp. Hvordannogensinde, det giver os mulighed for at undersøge dynamikken i bivalente domæner differentiere ES-celler 7 og til at afsløre forskelle i berigelse af modificerede histoner om regulatoriske regioner EMT gen i vildtype eller gen-muterede celler. (Figur 2). Dyb sekventering af immunopræcipiteret DNA (figur 4) delvist overvinder denne begrænsning.

Berigelse af en specifik genomisk region efter immunpræcipitation af en transskription faktor indikerer ikke sikkert, at den faktor, direkte binder DNA. Det kunne kun være en del af komplekse fabrik bundet til DNA. Dette er et vigtigt punkt at være bevidst om. I modsætning hertil kunne gelforsinkelsesassay bruges til at behandle spørgsmålet.

At have teknologi i hænderne kombineret med dyb sekventering gør det muligt at overvåge genom bred de genomiske regioner besat af en transkriptionsfaktorer eller en specifik histon mærke. Teknologien er i bedring, og gør det muligt at afhøre kun small cellepopulationer 15. Det åbner derfor nye veje i dynamikken i specifikke epigenetiske landskaber under fosterudviklingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics