Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En finjustering regulering av gentranskripsjon ligger under embryonal celle skjebne beslutning. Heri beskriver vi kromatin immunoutfellingsstudier analyser som brukes til å undersøke epigenetisk regulering av både hjerte differensiering av stamceller og hjerte utvikling museembryoer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jebeniani, I., Leschik, J., Puceat, M. Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues. J. Vis. Exp. (112), e53874, doi:10.3791/53874 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spesifikk gentranskripsjon er en viktig biologisk prosess som ligger bak celle skjebne beslutning under embryonal utvikling. Den biologiske prosessen er mediert av transkripsjonsfaktorer som binder genomisk regulatoriske regioner, inkludert forsterkere og arrangører av hjerte konstitutive gener. DNA blir pakket rundt histoner som er utsatt for kjemiske modifikasjoner. Modifikasjoner av histoner videre føre til undertrykte, aktivert eller rustet gentranskripsjon, og dermed bringe et annet nivå av finjustering regulering av gentranskripsjon. Embryonale stamceller (ES-celler) rekapitulere innen embryoid organer (dvs. celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trinnene i hjerte utvikling. De gir i prinsippet nok materiale til kromatin immunopresipitering (chip), en teknologi bredt anvendt for å identifisere genet regulatoriske områder. Videre humane ES-celler representerer en human cellemodell cardiogenesis. På senere stadier av utvikling, mus embryonale vev tillateundersøker spesifikke epigenetiske landskap som kreves for bestemmelse av celle identitet. Heri beskriver vi protokollene chip, sekvensiell ChIP fulgt av PCR eller brikke-sekvensering ved hjelp av ES-celler, embryoid organer og hjertespesifikke embryonale regioner. Disse protokollene tillater å undersøke epigenetisk regulering av hjerte gentranskripsjon.

Introduction

Hjertet er den første organ som skal dannes og til å bli funksjonell i embryo. Hjertet er bygget fra mange celle linjene som oppstår fra den første og andre embryonale hjerte felt 1. Fra post-fertilisering blastocyststadiet opp til formet hjerte, embryonale celler har dermed gjøre mange celle skjebne beslutninger. Gene transkripsjon er regulert i en tids- og plassavhengig måte og er en viktig biologisk prosess som ligger bak celle skjebne beslutning under embryonal utvikling. En slik prosess er mediert av spesifikke transkripsjonsfaktorer som bindes regulatoriske områder i genomet inkludert stimulerende midler og aktivatorer av hjerte konstitutive gener. DNA blir pakket rundt histoner som er utsatt for modifikasjoner slik som acetylering, metylering, ubiquitinylation, og / eller fosforylering. Histone modifikasjon fører til undertrykte, aktivert eller rustet gentranskripsjon avhengig av hvilken lysinresidiet av histon er endret 2.

jove_content "> Chromatin immunoprecipitation assay (chip) har blitt satt opp år siden 3 og er i dag den mest bredt brukt teknologi for å identifisere mål for enten modifiserte histoner eller transkripsjonsfaktorer fire. Etter immunoprecipitation av histoner eller transkripsjonsfaktorer, kan bindes DNA være enten forsterket ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR) eller sekvensert. Brikken er teknisk overvinne mer utfordrende gelretardasjon assays 5. Men ChIP innebærer ikke direkte binding av en transkripsjonsfaktor på DNA, en fordel ved gelretardasjon assay. på den annen side, spon kombineres for å DNA-sekvensering har åpnet en ny genom-wide perspektiv på genregulering.

ES-celler (ES-celler) rekapitulere innen embryoid organer (ie., Celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trinn av hjerte utvikling 6 og gir i prinsippet nok materiale for chip. Videre humane ES-celler representerer en human cellemodell på ca.rdiogenesis selv om deres kardio potensial avhenger av deres epigenetisk signatur 7. På senere stadier av utvikling, mus embryonale vev tillate for å undersøke bestemte epigenetiske landskap som kreves for bestemmelse av celleidentitet. Imidlertid er genomet transkribert i en tids- og celletype-spesifikk måte 8. Epigenetisk regulering av gentranskripsjon har til å bli studert innenfor lokale områder. Heri beskriver vi protokollene chip, sekvensiell ChIP fulgt av PCR eller sekvensering ved hjelp av ES-celler, embryoid organer og hjertespesifikke embryonale regioner. Disse protokollene tillater å undersøke epigenetisk regulering av hjerte gentranskripsjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA-protein Cross-linking

  1. Fix i 15 ml rør høstet-ES-celler (2 x 10 6 celler for vanlig chip, 2 x 10 5 celler for microchip), embryoid organer (EBS) generert fra ES-celler og embryonale hjerte vev dissekert fra E9.5 museembryoer (atrioventrikulær kanalen, utløpskanalen og ventrikkel) ved anvendelse av 1% formaldehyd i PBS i celler eller i permeabiliseringen PB2 buffer for embryonale vev. Plasser røret på orbital ristemaskin ved en hastighet på 60 opm ved romtemperatur i nøyaktig 10 min.
  2. Stoppe den tverrbindingsreaksjonen ved tilsetning av glycin til en sluttkonsentrasjon på 125 mM og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur på orbital ristemaskin ved en hastighet på 60 rpm.

2. Cell Lysis og Kromatin Fragmentering

  1. Vask to ganger kryssbundne celler resuspendert i 10 ml PBS 1x eller embryonale vev resuspendert i 1 ml PB2. Sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C. Kast supernatantene. </ Li>
  2. Legg proteaseinhibitorer for å bufre PB1 og PB2 (2 ug / ml leupeptin, 1 ug / ml aprotinin, og 0,1 mM PMSF) (tabell 1). Cellepelleten suspenderes eller embryonale vev fra trinn 2,1 i 1 ml buffer PB1 eller PB2 hhv. Pipettes opp og ned og resuspender cellene eller vev. Bruke en 1 ml sprøyte med en 21 gauge nål for å homogenisere celler eller vev. Inkuber ved 4 ° C (på et hjul) i 10 minutter.
  3. Spinne ned ved 3000 xg i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
  4. Resuspender pelleten i 300 ul av de respektive SB buffere (tabell 1) supplert med protease-inhibitorer i et rent rør (sertifisert RNase-, DNase-, og pyrogen-fritt) for å forhindre en hvilken som helst DNA-degradering. Inkuber i 15 til 30 minutter på is.
  5. Sonikere prøvene ved 4 ° C for å skjære kromatin ved anvendelse av en sonikator i samsvar med programmer som er oppført i tabell 2 for hvert materiale. Juster ultralyd varighet avhengig av neste program (<em> dvs. PCR eller sekvensering). Skåret DNA størrelse bør være rundt 500 bp for PCR og 300 bp for sekvensering.
  6. Sentrifuger sonikert cellelysat i 10 minutter ved 6000 xg ved 4 ° C, overfør supernatanten (kromatin) i et rent 1,5 ml rør og kast pellet.
  7. Fortynn kromatin i oppløsning (supernatant buffer B) til 10 ganger med vann og vurdere den optiske tettheten ved hjelp av 1,5 ul i en nano-spektrofotometer. Skaff konsentrasjonen av proteiner i ug / ul ved hjelp av følgende formel: 1,55 x OD 280 til 0,76 x OD 260.
Buffer utnyttelse sammensetning materialer
EN permeabilization PB1: 5 mm rør pH 8; 85 mM KCl; 0,5% NP40 Alle
PB2: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCI, 0.5% Triton X-100 embryonic vev
B Lysis / Ultralyd SB1: 1% SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8 ESC
SB2: 50 mm HEPES-KOH pH7.9; 140 mm; 1 mM EDTA; 0,1% deoxycholate; 0,1% SDS EBS
SB3: 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl; 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA; 1% Triton-X100, 0 0,1% SDS, 0,5% laurylsarcosine embryonic vev
C ChIP buffer 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 5 mM EDTA; 0,5% NP40; 1% Triton-X100. Alle
D DNA / protein Eluering D1: 1% SDS; 100mM NaHCO3
D2: 50 mM Tris pH 7,6 / 5 mM EDTA, 15 mM DTT, 2% SDS
E DNA bindende perler forberedelse E: 20% PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM EDTA

Tabell 1. Chip buffere.

Materiale lydbehandling program
Embryonale stamceller 15 sykluser med 30 sek ON og 30 sek OFF
embryoid organer 30 sykluser med 30 sek ON og 30 sek OFF
embryonale vev 21 sykluser med 30 sek ON og 30 sek OFF

Tabell 2. lydbehandling programmer.

3. Immunpresipitasjon ogvasker

  1. Vask 3 ganger Protein A-konjugert perler med buffer C. Ta 100 ul av perler i et rent 1,5 ml rør og tilsett 1 ml buffer C (tabell 1). Røret blir deretter overført til en magnet; vent i 1 min og aspirer supernatanten. Gjenta to ganger vasketrinnet.
  2. Inkuber antistoff dannet mot modifiserte histoner eller transkripsjonsfaktor (konsentrasjoner angitt i Tabell 3) med 20 ul av vaskede protein A-konjugerte perler og 1 ml av buffer C supplert med protease-inhibitorer i et rent 1,5 ml rør. Still prøvene på en rotator ved 40 rpm i minst 2 timer ved 4 ° C.
  3. Vasking antistoff-komplekser kuler 3 ganger med 1 ml buffer C (manipulasjon som er beskrevet i 3.1).
  4. Forbered 2 rør, en som inneholder 150 mikrogram av kromatin og antistoff-perler komplekser og annet rør som inneholder 150 mikrogram av kromatin og 20 pl vasket perler; Tilsett 1 ml buffer C supplementert med proteasehemmere til hvert rørog prøvene inkuberes på et roterende hjul ved 40 opm over natten ved 4 ° C.
    MERK: Konsentrasjonen av kromatin må være minst 300 ug for å immunoutfelle en transkripsjonsfaktor eller for sekvensiell chip.
Standard konsentrasjon (ng / mL) Volum (mL) Total DNA konsentrasjon (ng)
EN 10,0 1 10,0
B 5,00 1 5,00
C 2,50 1 2,50
D 1,25 1 1,25
E 0,625 1 0,625
F 0,3125 1 00,3125
G 0,156 1 0,156
H 0.0 1 0.0

Tabell 3. Standarder konsentrasjoner.

4. DNA Elution, Cross-link Tilbakeføring og proteinase K Fordøyelse

  1. Satt prøvene i det magnetiske stativet. Gjenopprette supernatanten inneholder ubundet antistoff kromatin.
    MERK: Prøver kan bli raskt frosset i flytende nitrogen ved at trinn og lagret ved -80 ° C. Kromatin kan brukes i andre immunoutfellingsstudier analyser med andre antistoff. Vask hver prøve 3 ganger med 1 ml buffer C (manipulasjon beskrevet tidligere).
  2. Eluer antistoff-bundet protein ved å tilsette 150 ul buffer D1 eller D2 hvis sekvensiell brikken som skal gjøres (tabell 1) for å vasket Chip materialer og prøvene inkuberes i 20 minutter ved 50 ° C i en varmeblokk.
  3. Fjern rør fravarmeblokken og sette prøvene i magnetstativ, gjenvinne supernatanten i et rent 1,5 ml rør (sertifisert RNase-, DNase-, og pyrogen-fri) og kast perlene.
  4. Bruk supernatanten for en sekvensiell brikke og adderer 1 til 3 mikrogram av det andre antistoff i 2 volumdeler av buffer C eller reversere tverrbinding ved tilsetning av 5 M NaCl for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 200 mM.
  5. Fremstille en inngang prøve av kromatin i et rent 1,5 ml rør (sertifisert RNase-, DNase-, og pyrogen-fri) tar den samme mengde av kromatin som for den IP-prøven (150 ug) i et sluttvolum på 150 ul vann (RNase DNase fritt vann). Legg 5M NaCl til en sluttkonsentrasjon på 200 mM. Inkuber prøvene over natten ved 65 ° C.
  6. Dagen fjerne prøver fra oppvarmingsblokken, tilsett 250 mM EDTA for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 12,5 mM, og proteinase K til å oppnå en sluttkonsentrasjon på 250 ug / ml i brikken materiale og fordøye ved 55 ° C i 2 timer i varmeblokk.

  1. Utarbeidelse av perler
    1. Begynn å bringe kulene ved romtemperatur i minst 30 minutter, vortex-perlene meget grundig. Perler slå seg ned, slik at arbeidet fort når pipettering. Transfer 1 ml av perler i ren 1,5 ml tube (sertifisert RNase-, DNase-, og pyrogenfrie).
    2. Sett på magnet, vent 2-3 min for løsningen for å avklare, kast supernatanten. Fjern fra magnet, tilsett 1 ml 0,5 M EDTA og bland med kort virvling.
    3. Gjenta trinn 5.1.2 to ganger, og kast supernatanten på slutten.
    4. Fjern fra magnet, tilsett 1 ml buffer E og sakte resuspender perlene. Overfør hele blanding (perler i buffer E) i 50 ml buffer E. sted på en ristemaskin, og la det blandes langsomt ved romtemperatur i 1 time.
    5. Test DNA-bindende kuler som følge av renseprotokoll som er beskrevet nedenfor ved anvendelse av 3 eksperimentelle betingelser: 50 pl av perler / 50 ul DNA (1 volum / volum 1), 100 ul perler/ 50 mL av DNA (2 volum / 1 volum) og 125 mL av perler / 50 ul av DNA (2,5 volum / 1 volum). La migrere rensede DNA på en 1,5% agarosegel for å kontrollere størrelsen av de fragmenter (figur 1A).
  2. DNA Purification
    1. Legg 425 ul (2,5 volumer) av DNA-bindende magnetiske kuler til hver DNA-prøve (ca. 170 ul). Resuspender langsomt ved å pipettere opp og ned (ca. 10 ganger) og inkuber ved romtemperatur i 10 min.
    2. Plasser på magnet for 5 min, deretter aspirer supernatanten og kast (på magnet).
    3. Legg 600 mL av rykende 80% etanol til røret på magnet, vent i 1 min, aspirer supernatanten og kast og deretter gjenta forrige trinn igjen.
    4. Gi en rask spinn, for 5 sek (microfuge), legg røret på magnet og fjerne de siste dråper etanol. La tørke i 1 min ved RT
    5. Eluer DNA ved tilsetning av 20 pl RNase-DNase fritt vann. Fjern fra magnet og virvle prøven.
    6. Inkuber i 3 minutter ved værelsestemperatur og deretter plassere prøvene på magneten. Aspirer elueres DNA inn i et nytt rør (sertifisert RNase-, DNase-, og pyrogen-fri).
    7. Kjør DNA fra innmatningsfraksjonen på en 1,5% agarosegel for å kontrollere størrelsen av DNA-fragmenter (figur 1B).

6. DNA Kvantifisering Ved hjelp av en Fluorescence instrumentering

  1. Serielt fortynnet i vann 1 ug DNA (1 kb stige) for å gi et totalt 7 fortynninger pluss en ikke-DNA-punkt (fortynninger samlet i tabell 3).
  2. Forbered en løsning av PCR Grønn jeg fargestoff, tilstrekkelig for alle prøvene (renset DNA og standard fortynninger AH): fortynne 10,000x Green fargestoff i 1x TE buffer.
  3. Tilsett 1 mL av hver DNA-prøver (renset DNA og standard fortynninger AH) til 10 mL 1x grønt fargestoff mix i kapillærer kyvetter å bli lest i en fluorimeter ved 488 nm bølgelengde. For nei-DNA-analysen, bruker 1 mL av 1x TE buffer.
  4. Byggeen kalibreringskurve ved hjelp av en grafisk programvare og bestemme de relative konsentrasjoner i området fra DNA-prøvene i ng / mL. DNA er deretter klar for PCR eller for å gjøre sekvense biblioteker.

7. PCR

  1. Valg av primere
    1. Design primere av interesse å avhøre de genomiske regioner av interesse. Design primere til å forsterke enhancer regioner av gener ved hjelp av UCSC genom nettleser. Enhancers er videre beregnet med H3K4me1 eller p300 ChIP-seq 9 data tilgjengelig i GEO datasett.
  2. PCR
    1. Drevet PCR-reaksjoner for 45 sykluser (8 sek 95 ° C, 8 sekunder 60 ° C, 8 sekunder 72 ° C) ved hjelp av en real-time PCR thermocycler i 25 ul grønt fargestoff blanding, 2 ng DNA, og 0,5 ul primer-blanding (20 iM stamløsning) 10.
  3. Analyse av berikelse
    1. Beregn Absolutt anrikning forutsatt at høyst 1% av nucleosome ble immunopresipitert 11.
    2. consider den genomiske som anriket om 10 ng IP prøver viser en større anrikning i forhold til 0,1 ng av input DNA.
    3. Uttrykke resultatene i den gangers økning i anrikning over en ikke-anriket regionen etter normalisering til inngangen og justering med et ikke-spesifikt kontrollprøve.
    4. Vurdere innspill DNA som skal fortynnes med 100 (fortynningsfaktoren eller DF).
    5. Normal inndata ved hjelp av følgende ligning 2 -ΔCt x 100%, hvor -ΔCt = Ct [IP] - Ct [Input x DF].
    6. Juster kontroll ved hjelp av følgende ligning (ΔCt [IP] -ΔCt [NS]) der NS er det ikke-spesifikke prøven (uten antistoff IP, eller IgG IP).
    7. Beregn fold berikelse av prøven som to -ΔΔCt. En fil med alle trinn i beregninger med formler hvor bare hver PCR prøven kan skrives inn vil lette analysen av resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A illustrerer første fremstillingen av DNA-bindende kuler og kvalitetskontroll ved bruk av DNA fra forskjellige størrelser (1 kb stige). 0ne, 2 og 2,5 volumer (1 til 3) av perler ble tilsatt til en volum av prøven for å rense med høy og lav molekyl størrelse DNA-fragmenter.

Figurene 1 B, C, D er typiske eksempler på DNA-geler fra hel sonikert DNA ekstrahert fra mus ES-celler, embryoid legemer eller en hjerte embryoniske region (samlet 25 E9.5 ventrikler), respektivt.

Når ES-celler differensiere mot en hjertecelle skjebne, de transitt først gjennom en mesendodermal og deretter en mesodermal tilstand. En slik utviklings reisen omfatter et trinn der epitelceller må gjennomgå en epithelio-mesenchymale overgang

Figur 2

Differensiering gener har toverdige domener i ES-celler 12. Deres 5 'UTR regioner som har sine arrangører er faktisk opptatt av både H3K4me3 en kromatin aktive mark og H3K27me3, en undertrykt mark. Disse merkene er endret når cellene blir utfordret av morphogens slike som BNIP2 7. Disse merkene er imidlertid variabel avhengig av den humane ES-celler linjeer sannsynligvis på grunn av den opprinnelige blastocyst de stammer fra selv når udifferensierte (figur 3).

Protokollene som er beskrevet ovenfor er egnet til sponsekvense selv starter fra en liten mengde materiale; Chip eksperimenter ble utført fra kromatin hentet fra AVC, OFT og ventriklene E9.5 mus embryo for å avdekke nye gener og forsterkere som spiller en rolle i å definere identiteten til disse spesifikke hjerte regionene. Figur 4 viser 2 genomiske regioner av hjerteinfarkt gener i den E9.5 mus ventrikkelen beriket av en acetylert H3K27 og en pacemaker-spesifikke (ie., ikke ventrikulær) genet ikke beriket av acetylert H3K27.

Figur 1
Figur 1. Elektroforese Data: DNA-bindende Perler Kontroll og Ultralyd Validation. (A) DNA renset ved hjelp av DNA-bindende kuler, en volum av perler / 1 volum av DNA (1) og 2 volumdeler av perler / 1 volum av DNA (2) og 2,5 volum av perler / 1 volum av DNA (3). Størrelsen på DNA-fragmentene erholdt etter reverstverrbinding av inngangs fraksjoner av mus ES-celler (B), embryoid organer (C), og embryonale hjertevev (D). Prøvene ble kjørt på 2% agarose elektroforese geler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. ChIP dataanalyse. (A) Anriking av H3K27ac epigenetisk merke på E-cadherin Forsterker / promoter (A - E regioner) (B) berikelse av H3K4me1, H3K36me3 og H3K9me2 epige.magnetiske merker på Twist Forsterker / promoter (AC regioner). Genomiske regioner blir forsterket av qPCR å måle anrikningen histon vs inngangs følgende chip. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra 3 eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Sekvensiell chip. Chromatin ble ekstrahert fra 4 humane ES cellelinjer og chip ble utført sekvensielt ved hjelp av anti H3K4me3 og deretter anti-H3K27me3 antistoffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. gener Nkx2.5 og Tbx5 beriket i den modifiserte histone og en genomisk region av Shox2 pacemaker-spesifikke genet ikke beriket og ikke uttrykt i ventrikkelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epigenetikk er blitt et viktig forskningsfelt i utviklingsbiologi. Hvor en genetisk program blir aktivert i embryonale celler til å tillate cellene å anskaffe en spesifikk identitet innenfor en embryonisk linjen har i lang tid et viktig spørsmål for utviklings biologer.

Brikken er bredt anvendt i løpet av de siste årene, og kombineres for å DNA-sekvense følgende forbedring i oppløsningen av sekvensering. Dette har blitt en kraftig teknikk for å undersøke i et genom bred avhengig måte epigenetisk landskapet av celler eller spesifikke embryonale og voksne vev. Brikken analyse buffere og lydbehandling forholdene har blitt kraftig forbedret for å tillate analyser for liten mengde av biologisk materiale. Dette inkluderer spesifikke regioner av embryonale hjerter innhentet av mikrodisseksjon eller ved FACS-sorterte cellene uttrykker en fluorescerende reporter protein. Faktisk ChIP utført på heterogene cellepopulasjoner 13 14 kanføre til misvisende resultater som er vanskelige å tolke. De epigenetiske signatur merkene svært nøyaktig celle populasjoner. Det signatur overfører dem en bestemt potensial for differensiering og avgjør deres skjebne. Det er derfor viktig å jobbe med rensede (sortert) celle populasjoner eller dissekert embryonale vev.

Vi har beskrevet ovenfor robuste protokoller for å oppnå disse målene. Vi har brukt disse protokollene for chip-PCR, spon på chip 7, 10, chip-sekvensering (figur 4, manuskript under forberedelse). Grunnen til robusthet legger på permeabilization og cellelyse buffere som har blitt optimalisert for å sikre en komplett celle og atomlyse og effektiv kromatin lydbehandling. Protokollene kan således anvendes for liten mengde av embryonale vev.

Begrensninger av disse protokollene er iboende til chip. Mer spesifikt, er den romlige oppløsningen ikke er veldig høy med DNA størrelser rundt 500 bp. Hvordannoensinne, gjør det oss til å undersøke dynamikken i toverdige domener i differensiere ES-celler 7 og for å avdekke forskjeller i anriking av modifiserte histoner på EMT genet regulatoriske regioner i villtype eller gen-muterte celler. (Figur 2). Dyp sekvensering av immunopresipitert DNA (figur 4) delvis overvinner denne begrensningen.

Anrikning av en bestemt genomisk region følgende immunoprecipitation av en transkripsjonsfaktor angir ikke sikkert at faktoren binder DNA direkte. Det kan bare være en del av komplekset fabrikk bundet til DNA. Dette er et viktig poeng å være klar om. I motsetning til dette kunne gelretardasjon assay brukes for å løse spørsmålet.

Å ha teknologien i hendene kombinert med dyp sekvensering gjør det mulig å overvåke genome wide de genomiske regioner okkupert av en transkripsjonsfaktorer eller en bestemt histone mark. Teknologien blir bedre, og gjør det mulig å avhøre bare small cellepopulasjoner 15. Det åpner dermed for nye veier i dynamikken i spesifikke epigenetiske landskap under embryonal utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formaldehyde  Sigma F8775 Cell Fixation 
Glycine Sigma G8898 Cross-link stop
Aprotinin Fluka 10820 Proteases inhibitor
Leupeptin hemisulfate Sigma L2882 Proteases inhibitor
PMSF Sigma P7626 Proteases inhibitor
Protein A magnetic beads  Life technologies 10001D Immunoprecipitation
SPRI magnetic beads Thermo Scientific 15002-01 DNA purification
Proteinase K Life technologies 25530-015 Protein digestion 
DNA BR standard  Life technologies Q32850 Calibration range 
Syber green Molecular Probes S-11484 DNA quantification
TE buffer  Invitrogen P7589 DNA quantification
PBX 1x Life technologies 14190-094 Washing
DNase RNase free water Life technologies 10977-035 Dilution
Axygen tube Axygen MCT-175-C ChIP purifiction
Antibody  Company Reference ChIP concentration
H3K27ac Abcam ab4729 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me1 Diagenode C15410194 (pAb-194-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K36me3 Diagenode C15410058 (pAb-058-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K9me2 Diagenode C15410060 (pAb-060-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K4me3 Diagenode C15410030 (pAb-030-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues
H3K27me3 Diagenode C15410069 (pAb-069-050) 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
  2. Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
  3. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  4. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
  5. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  6. Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
  7. Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
  8. Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  9. Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
  10. Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
  11. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
  12. Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
  13. Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
  14. Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
  15. Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics