적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

Bioengineering

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Nazari, M., Bokhart, M. T., Muddiman, D. C. Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI). J. Vis. Exp. (109), e53942, doi:10.3791/53942 (2016).

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Abstract

질량 분석 (MS)에 대한 주변 이온화 소스는 지난 10 년간 많은 관심의 대상이되어왔다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 전기 분무 이온화 (MALDESI)는 이러한 방법의 일례이다 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) (예를 들어, 탈착 펄스 특성)과 전기 분무 이온화 (ESI) (예를 들어, 소프트 - 이온화 기능 ) 결합된다. MALDESI의 주요 이점 중 하나는 고유의 다양성이다. MALDESI 실험에서 자외선 (UV) 또는 적외선 (IR​​) 레이저로 공진 내인성 또는 외인성 매트릭스를 여기 시키는데 사용될 수있다. 행렬의 선택은 피 분석 물에 의존하지 않고, 여기에 사용되는 레이저 파장에 전적으로 의존한다. IR-MALDESI 실험에서 얼음의 얇은 층은 에너지 흡수 매트릭스 시료 표면에 증착된다. 적외선 - MALDESI 소스 형상은 통계 액체 샘플의 분석을위한 실험 (DOE)의 디자인뿐만 아니라 B​​IOL를 사용하여 최적화 된ogical 조직 표본. 또한, 강력한 IR-MALDESI 촬상 소스는 가변 중간 IR 레이저는 컴퓨터 제어 XY 병진 스테이지 및 고분해능 질량 분석 장치와 동기화되는 경우, 개발되었다. 커스텀 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)는 레이저의 반복률의 사용자 선택을 허용 복셀마다 촬영, 시료 스테이지의 스텝 크기 및 탈착 사이의 지연 소스를위한 이벤트를 검색 번호. IR-MALDESI는 생체 조직 절편의 섬유와 염료 및 MSI의 법의학 분석과 같은 응용 프로그램의 다양한 사용되어왔다. 내인성 대사에서 조직 절편 내에 외래 생체 이물질에 이르는 상이한 분석 물의 분포를 측정하고,이 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 이 논문에 제시된 프로토콜은 전신 조직 섹션의 IR-MALDESI MSI에 필요한 주요 단계를 설명합니다.

Introduction

마이크로 프로브 모드에서 질량 분석 이미징 (MSI)는 샘플의 표면에 분리 위치에서, 빔 (레이저 또는 이온)에 의해 표면으로부터 시료의 탈착을 포함한다. 각 래스터 지점에서, 질량 스펙트럼을 생성하고, 획득 된 스펙트럼들은 수집되었던 공간 위치와 함께 동시에 수많은 샘플 내 분석을 매핑하는데 사용될 수있다. 감도와 질량 분석의 특이성에 결합 이미징이 레이블없는 방식 MSI는 질량 분석 1, 2에서 가장 빠르게 발전하는 분야 중 하나가 도왔다.

매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI)는 MSI 분석에 사용되는 가장 일반적인 이온화 방법이다. 그러나, 유기 매트릭스에 대한 필요성 및 MALDI의 진공 요구 재현성 샘플 처리량 및 방법을 이용하여 분석 될 수있는 샘플의 유형에 상당한 제한을 야기. 대기압 (AP) IO의 수그러한 조직 방법은 이러한 제한을 피하기 위해 3 최근 개발되어왔다. 이러한 주변 이온화 방법은 자연 상태에 매우 가까운 분석에 앞서 샘플 제조 단계를 단순화하는 환경에서 생체 시료의 분석을 허용한다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화가 일렉트로 (MALDESI)은 이러한 이온화 방법 -4,5-의 일례이다.

IR-MALDESI 실험에서 얼음의 얇은 층은 에너지 흡수 매트릭스 조직 표면 상에 증착된다. 미드 IR 레이저 펄스는 얼음 행렬에 의해 흡수 및 물 신장 모드로 공진을 여기하여 OH 표면으로부터 중성 물질의 탈착을 용이하게한다. 직교 전기 분무의 대전 방울에 탈착 중성 파티션 후 이온화 ESI 같은 방식으로 4-6에 있습니다. 외인성 얼음 행렬의 첨가는 AC 도움 때문에 조직 내의 내생 물에만 의존보다 선호다른 조직 구획에서 물 함량의 변화를 계산하고, ~ 티슈 이미징 실험 7,8 15 배 이온 풍부 탈착 6을 강화하고 개선하는 것으로 나타났다.

이 작품에서 우리는 IR-MALDESI MSI는 신생아 마우스 온 몸의 여러 장기에서 대사 산물의 분포를 유도하기 위해 사용한다. Ir이 MALDESI 소스 조정 파라미터의 개요가 부여되며, 조직 절편을 성공적으로 이미징을위한 필요한 단계가 증명된다.

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Protocol

참고 : 다음 프로토콜은 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 필요한 모든 단계를 설명합니다. 에서 심층 최적화 된 IR-MALDESI 소스의 형상과 레이저, 무대와의 동기화 및 질량 분석기에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 5,6 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 동물 조직 샘플은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 노스 캐롤라이나 주립 대학의 규정에 따라 얻었다.

1. 조직 준비

  1. 흄 후드에서 드라이 아이스의 보조 용기 내부에 깨끗한 비커에 ~ 이소 펜탄 200 ㎖를 배치하여 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕을 준비합니다. 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕조와 조직을 취급 할 때는 항상 보호 장갑과 보안경을 사용하십시오.
    1. AVERTIN 과다에 의한 2 일된 전체 신생아 마우스 새끼 (7.5 밀리그램 / g 체중)를 안락사하고 조직 구조를 보존하기 위해 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 조직을 동결. 미리 청소를 사용집게의 에드 쌍을 배치하고 이소 펜탄 / 드라이 아이스 욕에서 cryomold에 마우스 강아지를 제거합니다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 플래시 냉동 조직을 저장합니다.
  2. 보호 장갑을 사용하여, 40mm의 시험편 저온 유지 디스크에 최적 절단 온도 OCT () 실장 매체의 층을 적용한다. 조심스럽게 절편에 대해 원하는 방향으로 디스크에 마우스를 부착하려면 OCT 코팅 시편 홀더에 고정 된 전체 마우스를 놓습니다.
    참고 : 2009 년 10 월 단독 절편에 대한 표본 디스크에 조직을 부착하기 위해 사용된다. OCT에서 완전하게 삽입 조직을 수행 간섭 단층은 MSI 분석에 해로운 영향을 미칠 것으로 알려져으로 초과하지 마십시오. 젤라틴과 같은 다른 매체는,도 9를 슬라이싱 전에 조직을 포함-크라이하는데 사용될 수있다.
  3. 저온 유지 장치를 눌러 펠티어 전원 버튼에 펠티에 샘플 홀더에 OCT (및 조직 섹션) 디스크를 넣습니다. 시료가 열 평형에 와서 10 분 정도 기다립니다.
  4. 조직이에 장착와 (시편 디스크를 배치디스크 홀더 내부 IT) 및 분석을 위해 원하는 평면까지 조직에 직면한다. 그라 이오 스탯 (10)의 내부에 수납 로터리 마이크로톰을 사용하여 -20 ° C에서 원하는 두께의 섹션으로 조직을 조각입니다.
    주 : 전신 분석을 위해, 조직의 무결성을 유지하기 위해 25 μm의 두께의 부분에 조직 조각. 작은 영역 (예를 들어, 간, 뇌, 신장)의 경우, 10 μm의 두께 섹션으로 조직을 슬라이스.
    1. 롤로부터 분리 된 조직 절편을 방지 티롤 유리판을 사용한다. 원치 않는 조직 파편을 제거하기 위해 저온 유지 장치 진공 호스와 브러시를 사용합니다. 조직을 절개 한 후에, 개인적인 부상을 방지하기 위해 날카로운 마이크로톰 블레이드를 덮도록 날 가드를 사용한다.
  5. 오리엔트 마우스 시험편 판 섹션과 열을 건드리지 않고, 조직 절편에 최대한 가깝게 슬라이드를 가져와 사전 세정 된 유리 현미경 슬라이드 위에 해동 - 장착.
    주 : 정량적 MSI의 체험관은사항, 코트 전에 조직을 설치에 자동 공기 분무기를 사용하여 내부 표준 슬라이드 및-해동 마운트 코팅 된 슬라이드 (11)에 조직 섹션을.
  6. 블레이드 이젝터를 사용하여 조직을 절편에 사용되는 마이크로톰 블레이드를 제거하고 안전하게 적절한 "날카로운 폐기물"컨테이너에서 블레이드를 폐기합니다.
  7. 조직의 동결을 유지하기 위해 단계 3.2까지 저온 유지 장치 내부의 유리 슬라이드를 유지합니다.

2. IR-MALDESI 준비 / 교정

  1. 중반 IR 레이저를 켜고 컴퓨터의 레이저 제어 응용 프로그램을 실행합니다. 제조자에 의해 공급되는 레이저 제어 프로그램을 사용하여 원하는 파장을 선택한다. IR-MALDESI 실험은 일반적으로 2,940 nm에서 수행된다.
    참고 : 최근 실험은 중간 IR 레이저 파장의 의존성 8 특정 분석 것으로 보인다 주목 차이 얼음 행렬을 조사 하였다.
  2. 사슴을 켭니다전자 컨트롤러는 사용자 정의 사용자 제어 프로그램 (RASTIR)를 시작하고, 홈 버튼을 사용해서 스테이지의 위치를​​ 조정.
  3. 전기 분무 솔루션을 준비합니다. 일반적으로, 긍정적 인 이온 모드에서 전기 분무 용매 0.2 % 포름산 50:50 (v / v)의 메탄올 / 물을 사용합니다. 실험에 따른 전기 분무 용매 구성을 선택합니다. 예를 들어, 음 이온 모드에서 촬상 애플리케이션 일렉트로 개질제로서 5 mM의 수산화 암모늄을 사용한다.
    , IR-MALDESI MSI 전환 극성을 위해 수정으로 1 mM의 아세트산을 사용합니다. 이 수정은 포지티브 및 네거티브 이온 모드 (12) 모두에서 안정적이고 재생 가능한 신호를 얻기위한 최적의 발견되었다.
  4. 전기 분무 용매로 1 ML의 주사기를 입력하고 새로운 용매로 실리카 모세관을 세척하십시오.
  5. 이러한 ESI 스폿 거리가 소스 매개 변수를 사용하여 MS 유입구 축 상 ESI 터 정렬 통계적 DO를 이용하여 최적화 된 거리 샘플 높이 및 용매 유량 흡입구 자리 조직 섹션 6의 분석을위한 E. 참고 : 조직 섹션의 MSI에 대한 개략적 인 묘사를 위해 이러한 매개 변수 최적화 값을 그림 1을 참조하십시오.
  6. 전기 분무를 시작하고,이 시점에서, 전적으로 주위 화합물로 구성되어 총 이온 전류 (TIC)를 모니터링하여 안정성 (> 10 분)을 평가한다. 전형적으로, <10 % 이상 ~ 15 분의 TIC 변형 안정성 좋은 지표이다.

그림 1
그림 1. IR-MALDESI 회로도 및 매개 변수. IR-MALDESI 소스 설정 (축척되지 않은) 및 조정 가능한 매개 변수의 (A) 도식. (B) 최적화 된 매개 변수 값은 조직 섹션의 이미징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

얼음 매트릭스의 제목 "> 3. 증착

  1. 주의 : 무대에 샘플을 배치하기 전에 전기 분무의 전원을 끄십시오.
  2. 카메라 뷰 내의 IR-MALDESI 샘플 플레이트 상에 해동 장착 된 조직을 놓습니다.
  3. 확실히 손이 ESI 이미 터의 명확하고 전기 분무를 다시 시작합니다.
  4. 조직의 표면에 물이 응축을 방지하기 위해 건조 질소로 IR-MALDESI 소스와 퍼지 인클로저의 액세스 도어를 닫습니다. 엔클로저 내부에 도달하면, 상대 습도 <3 %, 샘플 플레이트를 냉각한다 펠티에 판에 DC 전원 (~ 12 V)를 켜. 참고 : 펠티어 냉각 단계에서 냉각 과정이 다른 곳에서 13 자세히 설명합니다.
  5. C °에 -9 무대를 냉각 및 장착 된 조직이 열 평형 (~ 5 ~ 10 분)에 올 수 있습니다.
  6. 질소 퍼지를 중지하고 소스 액세스 도어를 열고 주변 상대 습도에 조직을 노출. 얼음의 얇은 층이 공동에 증착 될LD의 펠티에 단계의 표면으로 인해 공기에서 물 desublimation에 조직 섹션을 탑재.
    주 : 실험실에서 상대 습도 10 ~ 15 % 미만이면, 얼음 매트릭스 층의 형성을 용이하게하기 위해 시스템 내부의 온수를 비커에 배치.
  7. 얼음 매트릭스 층을 형성 한 후, 덮개를 닫고 10 ± 2 %의 상대 습도를 감소시키기 위해, 건조 질소의 흐름을 다시 시작. 이 수준의 상대 습도를 유지하는 질소 유량을 조정 경험적 실험 6 걸쳐 얼음이 일정한 층을 유지하는 결빙 승화 균형 것으로 밝혀.

4. 질량 분석 이미징 데이터 수집

  1. RASTIR GUI (그림 2)를 사용하여 "LASER 위치"버튼을 클릭하여 분석 위치로 무대를 이동합니다. 오프 조직 영역이 절제 될 수 있도록, 레이저의 조정 다이오드를 사용한다. 오프 조직 재에 레이저 총을 발사기온은 카메라 뷰에 대한 오프셋 (offset) 레이저를 교정합니다. 레이저의 위치를​​ 업데이트하기 위해 "레이저 테스트 화재"버튼을 클릭하십시오.
  2. "카메라 위치"로 돌아 레이저 절제 자리 (그림 2-1)에 레이저 정렬 레티클을 배치하여 RASTIR에서 레이저의 위치를 업데이트합니다.
  3. (그림 2-2) 관심 (ROI) 버튼의 영역을 클릭하고 분석되고 조직 섹션에 대한 ROI의 크기와 위치를 조정합니다. 입력 적절한 실험 등의 X 및 (mm)에 Y 방향 (그림 2-3)에서 스텝 크기 매개 변수, "프로젝트 이름"상자 (그림 2-4)에서 MSI 파일 이름을 지정합니다.
    1. 투자 수익 (ROI)을 그릴 때, 제어 역할을 오프 조직의 일부를 포함한다. 피크 피킹이 오프 조직 섹션 (5.4 단계)를 사용합니다.
      주 : 조직상의 레이저 탈착 직경 (스폿 크기)은 약 150 ㎛의이며; 그러나, 높은 공간 해상도가 USI 얻을 수있다오버 샘플링 방법 14, 15을 ng를.
  4. 드롭 다운 상자 복셀마다 레이저 펄스 (정수 값)의 개수, 레이저 트리거 질량 분광계 신호 획득 (도 2-5) 사이의 지연에서 적절한 레이저 주파수를 선택한다. 일반적으로 측정 5 질량 분석기에 도달하는 이온 생성을 허용하기 위해 10 밀리 초 지연 시간으로 완전히 IR-MALDESI MSI 실험에서 물질 탈리 20 Hz에서 복셀마다 2 개의 레이저 펄스를 사용한다.
    주 : 레이저가 작동 할 수있는 가장 높은 반복율을 선택. 또한 최근에는 더 높은 반복율을 사용하여 분석 물 검출 가능성 (16)을 향상시킬 것으로 나타났다.

그림 2
IR-MALDESI MSI 동작 그림 2. 사용자 인터페이스를 제공합니다. RASTIR 스캔 제어 프로그램의 스크린 샷이 표시됩니다. 퍼포 레이션하는 단계(5) 적절한 개수를 선택하는, (1), 레이저 스폿의 위치 (2) ROI 드로잉, (3) (mm 단위) 단계의 스텝 사이즈를 선택하는, (4) 파일에 이름을 부여되는 MSI 실험 orming 이미징 및 MS 설정에 대한 목록을 확인 원하는 반복 속도, (6)과 함께 복셀 당 펄스의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 이러한 이온화 모드, 전기 분무 전압 용매 유속, 모세관 온도, 질량 분석 소프트웨어의 분사 시간과 질량 분석기의 파라미터를 선택한다. 전신 IR-MALDESI MSI에서 사용되는 매개 변수의 예는 표 1을 참조하십시오.
    참고 : 인해 생물학적 시료와 MSI 분석에서의 분리 방법의 부족의 복잡성 때문에, IR-MALDESI 소스는 높은 해상력 및 높은 질량 정확도 기기에 결합된다. 취득 방법은 분석가로드 할 수 있습니다이러한 MSI (12) 스위칭 병렬 반응 모니터링 (PRM) 7 극성 말이지.
  2. 일단 모든 매개 변수 (레이저, 무대, 그리고 질량 분석기)가 선택되었다, 동기화를위한 "악수"모드에서 MS를 배치하고, MS의 인수를 시작합니다.
  3. 상자를 선택하여 완료 모든 단계 체크리스트 (그림 2-6)를 확인하고 프로그램을로드 RASTIR 이미징 소프트웨어를 사용하여. 프로그램이로드되면, "실행"버튼을 사용할 수 있습니다. 를 눌러 실행 MSI 신호 획득을 시작합니다.
  4. 이미징 실험이 완료되면, 질량 분석기 수집을 중지하고 대기 모드에서 기기를 배치합니다. 인클로저에 질소 퍼지를 끄고 펠티에 판에 전원 공급 장치를 끄고 무대 컨트롤러와 레이저를 끄십시오.
  5. 액세스 도어를 열고 소스 인클로저 내부에서 전기 분무 터 팁을 제거하고 보호 장갑을 사용하여 확장 된 가열 된 금속 MS 입구를 제거합니다. 주의 : 확장 금속 MS 입구는 매우 뜨겁습니다.
  6. 장갑 보안경 착용, 10 분 동안 HPL​​C 등급 메탄올 마지막 10 분 동안 HPL​​C 등급의 물에 10 분 동안 15 % 질산 초음파 욕으로 확장 금속 모세관 입구를 닦고. 질소 기류 하에서 금속 모세관 입구를 건조하고, MS에 다시 삽입합니다. 주 : 이후 적절한 폐기물 용기에 용매 폐기 할 것.
R "스타일 ="너비 : 216px; "> 3.8-4.2 kV의 폭 : 216px; "> 140,000
매개 변수
이온화 모드
전기 분무 전압
용매 유량 2 μL / 분
모세관 온도 275 ° C
검색 범위 m / z 250-1,000
스캔 유형 전체 검사
분사 시간 110 밀리 초
해결 전원

전신 IR-MALDESI MSI에서 사용되는 표 1. 악기 매개 변수를 설정합니다.

5. 데이터 분석

  1. 이러한 MSConvert 17 imzML 컨버터 (19)와 같은 무료 소프트웨어를 사용하여 이러한 mzXML 17 imzML (18)과 같은 데이터 형식으로 악기에 의해 생성 된 원시 데이터 파일을 변환합니다.
  2. MSiReader v1.0을 전용 처리 시스템에 높은 분해능 MSI 데이터 (20)의 분석을 위해 개발 된 오픈 소스 소프트웨어를 시작합니다. MSiReader 상에 이미지 파일을로드합니다. 사용자 MSiReader의 인터페이스와 내장 된 기능 중 일부를 들어, 그림 3을 참조하십시오.
  3. 자신의 m / z를 입력하여 관심의 분석의 이온지도를 생성하고 만 당 부분에 적절한 m / z 창 (PPM) 또는 톰슨 (목) (그림 3-1)을 선택합니다. 높은 분해능 (RP) 악기낮은 ppm의 범위에서 창을 선택합니다.
    주 : 해당 m / z 윈도우가 IR-MALDESI 소스가 결합되어 기기의 RP 질량 측정 정도 (MMA)에 의존한다.
  4. 또한 이러한 보간 (도 3-2), 정규화 (도 3-3), 광학 이미지 오버레이 (도 3-4) 및 최고 (도 3-5) 20 따기와 같은 기본 기능을 이용하여 데이터 해석한다.

그림 3
그림 3. MSiReader의 사용자 인터페이스; V1.0 20. 파일이 소프트웨어에로드되면, 관심있는 분석의 이온지도 (1) ppm으로 또는 목의 m / z와 관용을 입력하여 표시됩니다. 이러한 (2) 혹은 보간 ​​(3)과 같은 정규화 추가 분석도 행할 수있다. 조직의 광학 이미지는 수입과 중첩 될 수있다이온지도 (4) 더 나은 시각화를위한. 타겟이 불분명 한이 조직 (마젠타 라인)의 영역과 기준 영역 오프 조직 (녹색 박스)를 선택하여 조직 특이 적 피크를 추출하는 데 사용할 수있는 기능 (5) 따기 피크를 분석하십시오. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

  1. 사용자 정의 기준을 이용한 조직 - 특이 m / z 값의리스트를 생성하는 피크 피킹 함수를 사용한다. 주 : PeakFinder 알고리즘은 두 영역의 평균 질량 스펙트럼의 차이를 이용한다. 이러한 m / z 값은 다음과 같은 METLIN 21 지질 MAPS와 같은 대사 데이터베이스에 대해 검색 할 수 있습니다. (22)
    1. 심문 조직 영역 (마젠타 다각형 ROI) 및 오프 조직 참조 영역 (녹색 다각형 ROI를) 선택의 예 3을 참조하십시오.

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Representative Results

도 4에 제시되는 이미지는 전신 조직 절편의 여러 장기에서 대사 산물의 공간적 분포를 나타낸다. 신체의 특정 영역에 고유의 m / z 값은 이미지 생성을 위해 일괄 처리 한 후, MSiReader PeakFinder를 이용하여 발견되었다. 화상 오버레이 도구 (도 3-4) 얻어진 이온 맵 얼음 행렬 증착 전에 촬영 한 광학 이미지를 정렬하는 데 사용 하였다. 동물 세포막 (도 4a)에 구조적 역할에서 예상대로 다른 대사 물질은 특정 장기 나 조직 구획 (도 4B-D) 내의 별개의 분포를 나타내는 반면, 콜레스테롤은 모든 조직 유형에 걸쳐 관찰된다.

그림 4
그림 4. 대표 IR-MALDESI MSI 이미지; AD. 네 metaboli전체 마우스 섹션 내에서 화합물의 현지화를 보여주는 테 이온지도. 지질 클래스는 각 이미지의 오른쪽 하단에 주석된다. 조직 섹션의 광학 이미지는 기관의 시각화 지원하기 위해 이온지도 내에서 중첩되고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

프로토콜은 위의 IR-MALDESI MSI 실험을 수행하기위한 주요 단계를 설명한다. 매트릭스 신청 절차 (제 3 장)은 로봇 분무기를 사용하여 코팅 스프레이 승화 또는하여 MALDI MSI 실험의 일반적인 매트릭스 응용 프로그램 프로세스와 유사 약 20 분 걸립니다. 또한, IR-MALDESI 매트릭스의 결정 (6)에 분석 물의 분할에 의존하지 않고, 얼음 행렬 보편적 관계없이 질량, 크기, 화학적 성질의 분석 모두에 사용될 수있다. 또한, 얼음의 사용은 전형적인 MALDI 실험 23에서 관찰 된 낮은 m / z 범위에서 매트릭스 관련 이온을 제거한다.

실험에서의 모든 단계는 품질 MSI 데이터를 생성 할 필요가 있지만, 실험 과정 동안 전기 분사 안정성 재현성 IR-MALDESI 이온 생성에 필수적이다. 상대 습도는 촬상 실험 과정에 걸쳐 모니터 될 필요일정한 얼음 매트릭스 층을 유지한다. Ir이 MALDESI 탈착 얼음 (6)의 두께에 상대적으로 불 투과성이고; 그러나, 일부 실험 영상 감시하지 않으면 얼음 층이 번잡해질 수있는 다수의 시간이 걸릴 수있다. 이를 위해, 비례 - 적분 - 유도체 (PID) 제어기 최근 내부의 온도 및 상대 습도를 모니터링하고 필요에 따라 조정하기 위해 소스에 통합되었다.

MSI는 표면으로부터 분석 물의 직접 샘플링을 수반하기 때문에, 크로마토 그래피 분리는 스펙트럼의 복잡성을 감소시키기 위해 사용될 수 없다. 또한, 실험실 환경에 존재하는 주변 이온은 관심의 분석 (들)에서 신호를 방해 할 수 있습니다. 생물학적 샘플 내의 화합물의 다양한 조합을 주위에서 이온 스펙트럼 복잡도가 높은 질량 정밀도와 높은 분해능 질량 분석기에 IR-MALDESI (및 다른 주변 MSI 소스)의 결합을 요구이야UCH 정확하고 상세한 이온 맵의 생성을 용이하게하기 위해서,이 실험에서 사용한 것과.

이 연구에서, IR-MALDESI 전체적으로 마우스의 여러 장기에서 내인성 대사의 다양한 공간 분포를 나타 내기 위해 사용되었다. MSiReader에서 알고리즘을 따기 피크는 다른 클래스에서 지질이었다 중 많은 500 개 이상의 조직 특이 이온을 식별 할 수 있었다. 이 프로토콜은 동시에 다른 기관 (24, 25)에서와 같은 약물 및 약물 대사 산물과 같은 외인성 화합물의 분포를 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 전신 약물 분포 연구에 대한 금 표준 전신자가 방사선 (24)이다. 그러나,이 방법은 시간 소모적이며 방사성 표지 된 화합물을 필요로하고, 그 분석의 분자 구조에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에, 모 약물 및 그 대사 산물 구별 할 수있다. 또한 가능하게하면서 IR-MALDESI와 전신 MSI는 이러한 문제를 우회분석은 유기 기질을 첨가하지 않고, 주위의 환경에서 수행된다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
IR-MALDESI Source Custom-made N/A Please refer to references 4 and 12 for an in-depth discussion of IR-MALDESI source development.
Q Exactive Plus  Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer
Water, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH365-4
Methanol, HPLC Grade Burdick & Jackson  AH230-4
Formic Acid Sigma Aldrich  56302
Tunable mid-IR Laser Opotek Inc. IR Opolette Tunable 2,700-3,100 nm IR OPO laser
Nitrogen Gas Arc3 Gases AG S-NI300-5.0 Grade 5.0 high purity nitrogen gas cylinder (300)
Cryostat Leica Biosystems CM 1950 Cryomicrotome
High Profile Microtome Blades Leica Biosystems 3802123 Leica DB80HS
Mounting Medium (OCT) Leica Biosystems 3801480 Surgipath FSC 22 mounting medium
Cryostat Specimen Disc Leica Biosystems 14047740045 40 mm diameter
Glass Microscope Slides VWR 48312-003 Frosted, selected, pre-cleaned

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References

  1. Mcdonnell, L. A., Heeren, R. M. A. Imaging Mass Spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 606-643 (2007).
  2. Chughtai, K., Heeren, R. M. A. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem. Rev. 110, (5), 3237-3277 (2010).
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