전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

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Xie, D., Ju, D., Speyer, C., Gorski, D., Kosir, M. A. Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (114), e54074, doi:10.3791/54074 (2016).

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Abstract

Introduction

생존에 필요한 영양분을 얻기 위해, 악성 종양 환자의 혈류에 대한 액세스를 필요로한다. 이 액세스하기 위해, 종양 세포는 혈관 신생 따라서이 알려져 정상 생리적 과정을 하이재킹, 종양으로의 새로운 혈관의 성장을 자극하는 화학적 신호를 방출. 그것은 전이 (즉, 다른 장기 암의 확산)이 발생할 수있는 혈관을 통해 생성 된 혈관을 통해도. 혈관 신생 과정은 암과 같은 다양한 종류의 진행에 매우 중요하기 ​​때문에, 항암 치료 연구 (3)에서 매력적인 표적이다.

혈관 생성을 정량화하기 위해 사용되는 하나의 방법은 세포 외 매트릭스 상에 배치 할 때 튜브를 형성하는 혈관 내피 전구 세포의 능력을 측정하는 것이다. 이러한 관의 형성은 환경 조건 (소정 주식의 존재 또는 부재를 테스트 혈관 신생에 중요한 초기 단계이기 때문에,mpound) 자극 또는 억제 할 수있는 관 형성은 혈관 신생을 억제하는 대상이 될 수있는 특정 단계에 대한 통찰력을 제공합니다. 내피 세포의 관 형성 분석법은 튜브를 형성하는 세포의 능력을 측정하는 가장 널리 사용되는 4 시험 관내 방법 중 하나이다. 그것은 상대적으로 적은 부품 및 짧은 배양 기간 5를 필요로 간단한 분석이다. 아마도 가장 중요한 것은, 분석이 유형에서 얻은 데이터를 정량화 점이다.

관 형성 어 세이를 사용하는 예를 저감 성장 인자 (GFR) 외 기질 대 외 매트릭스상에서 성장한 혈관 내피 세포의 튜브의 개발을 비교 포함한다. 라미닌, IV 형 콜라겐, 성장 인자 및 프로테오글리칸은 세포 외 기질이 육종 세포의 주요 구성 요소에서 고립 된 기저막과 같은 소재입니다. 일부 화합물의 튜브를 형성하는 세포의 능력에 상이한 효과를 가질감소 된 성장 인자 감소 헤파 란 황산 프로테오글리칸 (HSPGs)와 환경. HSPGs 크게 GFR 외 기질이 감소되는 세포 외 매트릭스의 구성 요소이다. 예로서, 상기 가정은 HSPGs이 풍부한 관 형성을 방해하기 위해 상당히 강한 능력을 차단 CXCR2 수용체, SB225002와 같은 혈관 신생 억제제는 다음 세포 외 기질 및 GFR 외 매트릭스의 관 형성 활성의 비교임을인지 HSPGs의 제어를 통해 혈관 신생 억제 가능성 탐구 중요.

일반적으로 혈관에서의 화합물의 효과를 결정하기 위해 사용되는 다른 분석은 생체 내 방법에있다. 이 중 주목할만한 예는 닭 계란을 사용하여 병아리 융모 막 (CAM) 분석 (6), 그리고 생체 내 마트 리겔은 마우스를 사용하여 혈관 신생 분석 (7)를 연결합니다. 생체 내 방법은 t에서 혈관 신생을 측정하는 동안HREE 치수 및 관내 관 형성 분석법에 비하여 인체에 더욱 대표적인, 그들은 훨씬 더 많은 시간을 필요로한다는 결점을 겪고 상당히 더 수행하기 어렵다. 캠 분석 및 세포 플러그 분석 모두 비하여 관 형성 분석법은 하루에 수행 될 수 있지만, 이렇게하는 적어도 하나의 주 8 가지고 그것은 동물 사용을 요구하지 않는다.

이 보고서에서 사용한 혈관 내피 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이들 세포는 혈관 새싹 및 혈관의 성장에 중요한 역할을하고, 충분한 양의 시험 관내생체실험 9 항 - 혈관 형성 활성을 평가하는데 사용될 암에서 내피 세포 유사하다. 일차 미세 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포도 사용될 수있다.

낮은 갖는 외에주의하는 것도 중요하다정상 세포 외 기질에 비해 HSPGs 수준은 또한 GFR 외 매트릭스는 여러 요소 레벨을 감소시켰다. 이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다 : EGF, IGF-1, PDGF와 TGF 베타. 혈관 신생 관련 화합물의 중요성을 공부하고 그 수행하는 실험은 GFR 세포 외 기질을 사용하여에 관심이있을 수 있습니다.

Protocol

1. 세포 배양

  1. 시드 3 × 75 센티미터 플라스크에서 완전 배양 배지 (10)의 10 mL의 5 HUVEC 세포.
  2. 70~80%의 합류로 CO 2 5 %에서 37 ° C에서 세포를 품어.

2. 세관 형성의 분석

  1. 4 ° C에서 얼음에 하룻밤 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스 또는 정상 세포 외 기질 중 하나를 해동.
    주 : "세포 외 기질 '간결성을 위해 이하, GFR 정상 세포 외 기질 모두를 참조하는 데 사용된다. 이를 제조하는 방법은 동일하다.
  2. 얼음에 96 웰 배양 플레이트를 유지하고 잘 사전 냉각 팁을 사용하여 당 차게 세포 외 기질의 50 μl를 추가합니다. 만 정상 세포 외 기질을 포함하는 5 우물 세중를 준비합니다. 만 GFR 세포 외 기질을 포함하는 5 우물의 또 다른 세중를 준비합니다.
  3. 30 분 동안 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션.
  4. HUVEC를 씻어한 번 인산 완충 칼슘, 마그네슘 (PBS)없이 솔루션 및 1 ml의 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 대부분의 세포가 반올림 때까지 세포 분마다 확인, 1-5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 한 번 플라스크를 눌러 셀을 제거.
    1. 5 ㎖를 기본 배지 담기 % 소 태아 혈청 (FBS)과 (아무것도하지 않고 즉, 내피 세포 성장 배지 (예 : 첨가제)를 첨가). 피펫으로 플라스크에서 세포를 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다.
    2. 2 ml의 기초 배지로 재 정지 혈구를 이용하여 세포 수를 계산하고, 2-3 × 105 세포 / ml의 세포 농도를 조절한다.
  5. 기저 매체에 CXCR2 억제제 SB225002 다음의 10 배 농도의 100 μl를 준비 : 11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM (제어).
  6. 각 5 MICR에 HUVEC 정지 300 μl를 피펫ocentrifuge 튜브. 억제제 농도의 33 μl를 추가 (11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM) 하나의 튜브에 HUVECs를, 그리고 소용돌이를 포함하는 각.
  7. 피펫 외 매트릭스의 각각의 웰에 세포 현탁액 (1.5 × 104 세포)를 각각 50 μL. 세중 각 서스펜션 플레이트, 37 ° C, 5 % CO 2에서 4-16 시간 동안 배양한다.
  8. 4-16 시간 후, 잘 거꾸로 현미경 카메라 (11) (원래 배율 × 100)를 사용하여 당 형성된 튜브 (4) 사진을 찍을.

3. 세관 혼란의 분석

  1. 튜브 형성 분석은 (2.3-2.1 단계)와 동일한 사양에 따라 세포 외 기질과 접시를 준비합니다.
  2. 단계에 설명 된대로 2.4 관 형성 분석법 및 분취 2.4.2 세포 외 기질을 포함하는 96 웰 플레이트에 웰 당 50 μL로 HUVEC 현탁액을 준비한다.
    참고 : 충분한 웰의 플레이트그 O를 약물 치료 당 3 우물이있다.
  3. 37 ℃에서 4 시간 동안 세포 외 기질에 세포 성장, 5 % CO 2. 약물 치료의 시작 전에 이미지를 가져 가라.
  4. 관 형성 어 세이의 단계 2.5에 기재된 바와 같이 CXCR2 억제제 SB225002의 2 배 농도를 준비하고 된 HUVEC를 함유하는 96 웰 플레이트의 웰 당 각 농도의 50 μL를 추가한다. 세중의 각 농도 플레이트.
  5. 37 ° C에서 또 다른 2-12 시간 동안 접시를 품어, 5 % CO 2.(11) (100 × 원래 배율) 거꾸로 현미경 카메라를 사용하여 각각에 형성된 튜브 (4) 이미지를 가져 가라.

4. 정량 데이터

  1. 현미경 카메라 소프트웨어를 사용하여 네 개의 랜덤 현미경 분야에서 튜브의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써, 이미지 캡처 관 형성을 평가한다.
  2. 현미경 카메라 소프트웨어에서 이미지를 열고 '주석 및 측정을 클릭합니다9 ;. '길이'섹션 아래에있는 '간단한 라인'도구를 선택합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭.
    주 : 소프트웨어가 자동 픽셀 라인의 길이를 계산하고, 파일에 데이터를 입력한다.
  3. '간단한 라인'도구를 선택하여 이미지의 모든 튜브 라인에 대해이 절차를 반복합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭.
    주 : 소프트웨어가 각 라인의 길이를 기록하고, 화면의 데이터를 표시한다.
  4. 사진에있는 모든 튜브를 측정 한 후, 다음, '내보내기'를 클릭 '스프레드 시트 길이'를 선택했다.
    참고 : 길이 데이터를 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다.
  5. 전체 길이의 튜브를 얻을 수있는 스프레드 시트 튜브 길이를 모두 추가합니다. 계산 및 튜브의 평균 길이를 기록합니다.
    참고 : 네 복제는 평균과 측정 표준 편차를 권장합니다.

세포 외 기질 문화 5. 복구 세포

  1. 문화 및 관 형성 어 세이를 수행하기에 충분한 세포 수를 산출하지 96 웰 플레이트로 큰 규모 (섹션 2 참조). 12 웰 플레이트를 들면, 세포 외 기질의 500 μL 및 HUVEC 세포 현탁액 500 μL (1.5 × 105 세포)를 사용한다.
  2. 튜브를 형성하기 위해, 4-16 시간 동안 세포를 인큐베이션. 그 후, 세포 배양 배지를 흡인. 칼슘 및 마그네슘이없는 냉간 1X PBS 1 ㎖로 세포를 씻어.
  3. 문화에 얼음 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 버퍼의 1 ML을 추가하고 10 분 동안 얼음에 보관하십시오.
  4. 세척 팁을 절단하여 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 접시로부터 세포 외 기질 액을 제거하고 차가운 15 ㎖의 튜브에 전송 웰 4 얼음 ㎖의 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 튜브에 넣고 .
  5. 1-4 시간 동안 얼음에 튜브를 넣고 세포 외 모든 때까지 튜브를 몇 번 반전매트릭스를 용해시킨다.
  6. 0 ° C에서 1,620 XG에 10 분 동안 원심 분리기
  7. 얼음에 1.ml 튜브에 1 ㎖의 차가운 PBS로 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
  8. 다시 0 ° C에서 3,000 XG에 5 분 후, 상층 액을 처분 원심 분리기.
  9. -80 ° C에서 세포를 저장합니다.

Representative Results

상당한 건강 내피 관 형성을 용이 현미경 이미지에서 관 형성 억제를 대조 할 수있다. 건강 관 형성은 모세 혈관 같은 구조 (그림 1)의 조직 웹으로 나타납니다. 비교, 억제 관 형성 흩어져 세포 (그림 2) 자체를 명시한다. 관 형성 어 세이 데이터 모세관 (표 1)의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써 정량한다. 전체 길이의 튜브 외에, 분기점의 평균 길이의 튜브, 튜브의 전체 개수, 또는 전체 수를 측정 할 수있다. 구조화 된 관 형성을 저해 분산 튜브의 성장보다 더 순 튜브 길이를 산출한다. 도 3에서, 투여 량 반응 곡선은 GFR 외 기질 및 CXCR2의 억제제 SB225002 된 HUVEC의 실험 조건에서 IC (50)의 계산을 허용한다.


세포 외 기질과 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질에 그림 1. 내피 t의 우베 형성. 두 이미지는 세포 외 기질 (A) 및 GFR 세포 외 기질 (B)에 성공적으로 관 형성을 보여줍니다. 튜브의 상호 연결된 네트워크는 명확 튜브의 성장이 HUVECs를 건강 있음을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
에 인자 감소 (GFR)을 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 세포 외 기질 세포와 성장. 관 형성의 그림 2. 억제 두 이미지는 튜브를 표시세포 외 매트릭스 (A) 및 GFR 외 매트릭스 (B)의 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 억제되어 형성. 이 화상 표시에서 본 HUVEC 세포의 단리는 세포 덩어리 서로 접속할 필요 튜브를 형성 할 수있는 것이 아니었다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스도 3 용량 반응 곡선. X 축은 길이의 튜브를 도시하고, Y 축은 CXCR2의 억제제의 농도를 나타낸다. 용량 반응 곡선은 GFR 외 매트릭스에서 CXCR2 저해제로 HUVEC 응답이 농도 의존적​​ 인 것을 알 수있다. 이 IC (50) (반 최대한 억제Y 농도), 예를 들어, 소프트웨어 (13)를 이용하여 세포 외 기질에 대한 투여 량 반응 곡선과 비교할 수에 의해 산출 하였다. IC (50)은 50 %에 대한 응답을 저하 억제제의 농도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질과 저해제 (4 각 복제) 총 튜브 길이 평균 (픽셀) (1 픽셀 = 0.34 μm의) 표준 편차 P
GFR 외 매트릭스 제어 2,447 168.174
GFR 세포 외 기질 + 0.56 μM의 SB225002 1422.5 185.4218 0.000395
GFR 세포 외 기질 + 1.1 μM의 SB225002 1,004 126.1784 2.14 × 10 -5
GFR 세포 외 기질 + 5.6 μM의 SB225002 519.25 129.6368 4.19 × 10 -6
GFR 세포 외 기질 + 11 μM의 SB225002 393.75 212.6857 1.21 × 10 -5

표 1. 다양한 조건에서 성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스의 총 길이의 튜브를 정량화. CXCR2 억제제를 다양한 농도로 GFR 외 매트릭스상에서 성장한 샘플에 기록 된 전체 길이의 튜브를 사용하여 테이블의 일부. 데이터는 CXCR2 억제제 관 형성을 억제하는 않는 것을 나타낸다. 이러한 네 가지 복제, 표준 편차의 평균 및 P 값과 관련된 값이 포함되어 있습니다. 보여 픽셀 단위로 측정내 보낸 데이터. IC (50)은 통계 소프트웨어 (13)를 사용하여 계산 될 수있다. (1 픽셀 = 0.34 μm의)

Discussion

이 분석을 수행 할 때, 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 상 또는 4 ℃에서 세포 외 기질을 유지하는 것이 필수적이다. 세포 외 기질을 4 ° C 이상으로 가온하는 경우는 중합되고, 상기 분석은 파괴 될 것이다. 그것은 접촉하는 것을 확인하는 것이 중요하다 (예를 들면, 피펫 팁, 플레이트) 세포 외 기질과 미리 냉각 전술 한 이유입니다. 각 웰에 파종 세포 수는 중요하다 너무 적은 세포의 대조군 샘플에서 예상되는 웹주지 너무 많은 세포 대 세포 클러스터 또는 단일 층을 형성하는 것이며, 상기 분석은 유효하지 않을 것이다. 이 분석의 성공에 또 다른 중요한 요인이 된 HUVEC 세포의 통로 번호이다. 통로의 수는 항상 그렇지 않으면 강력한 관 형성이 발생하지 않을 수 10 이하이어야한다. 또한, 하나는 사용되는 세포 배양 배지가 만료되지 않았는지 확인한다, 또는 세포 생존 수 없습니다. Alternatively, 하나 매체와 그 구성 요소와 나누어지는 유효 기간 후의 일정 기간 동안 유지하기 위해 -20 ℃에서 저장할 수있다. 물론, 유효 기한 전에 매체를 사용하는 것이 여전히 바람직

모든 절차와 마찬가지로, 내피 세포의 관 형성 어 세이를 수행하는 몇 가지 단점이있다. 하나의 주요 문제는 내피 세포와지지 매트릭스의 종류가 있기 때문에, 분석의 결과는 셀 매트릭스 타입 사용에 따라 크게 달라질 수 있다는 것이다. 사용 된 내피 세포 (HUVECs를, HAECs 또는 HMVECs)는 그들이 불멸화 세포에 비해 변동성을 얻을 가지고 비용이 많이 드는, 일차 전지이다. 기본 셀은 사용 제한 통로를 가지고, 따라서 장기 실험 혈관 (14)에 적합하지 않다. 신뢰성있는 데이터의 경우, 하나는 항상 상기 분석에 대해 동일한 유형을 사용한다. 시험 관내 분석에서 서로 같이, 관 형성 어 세이의 결과들은 콘되어야이차원 조직 배양의 제어 및 합성 조건의 결과는 항상 생체의 복잡한 바이오 시스템에 반영되지 않을 수 있기 때문에, 생체 내에서 강세. 또한, 튜브 형성 세포 분석법이 유형 단지 내피 세포의 관 형성을 입증하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하고, 다른 비 - 내피 세포를 검사하는 데 사용되어서는 안된다.

이 분석은 화합물의 혈관 가능성을 정량화 할 수있는 비교적 간단하고 빠른 방법입니다. 또한, 단독으로,이 화합물은 실제 혈관 형성 공정에 영향을하는 특정 메커니즘에 관한 정보를 생성하지 못하고, 추가 실험을위한 플랫폼을 형성한다. 그러나, 다양한 세포 외 매트릭스의 사용이 더 일반적으로 사용되지 않는 연구 질문을위한 프레임 워크를 만드는 방법의 예입니다. 구성 요소를 대상으로 특정 억제제를 포함하는 화합물의 특정 생화학 적 메커니즘을 연구하는 방법이있다혈관 신생 경로. 또 다른 방법은 내피 세포로부터 RNA를 추출하고 분석에서 관찰 된 성장 거동을 일으킬 수의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 RT-PCR (실시간 PCR) (12)를 사용할 수있다. 이 방법의 미래 응용 프로그램은 혈관 신생 경로의 특정 단계에 대한 노크 다운 분석을 생성 된 HUVEC를 형질 전환 등이 있습니다. 림프관 경로를 연구하기 위해이 방법을 적용 할 가능성이있다. 세포 외 기질 성분을 변경하여, 행렬 암에서 혈관 신생을지지 세포 과정의 상호 작용이 더 설명 될 수있다. 이러한 특정 조건하에 내피 세포로부터 RNA와 단백질의 추출은 추가적인 정량적 데이터는 데이터를 묘화에 대응 제공한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) Fisher NC9525043 HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free Fisher CB-40230 Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free Fisher CB-40234 extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use.
SB225002 Fisher 559405 CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use.
Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)  ScienCell Research Laboratories  8000 culture it according reference  10.
Trypsin 0.05%-EDTA phenol red Invitrogen 25300-054 keep in 4 °C, warm in 37 °C before use.
Nikon ECLIPSE Ti Nikon Inverted Research Microscope. 
NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit Nikon Inverted Research Microscope software
Graph-pad Prism 5 GraphPad Software, Inc. scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50.

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References

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