Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Medicine

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Summary

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

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Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor. J. Vis. Exp. (132), e54107, doi:10.3791/54107 (2018).

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Abstract

Anastasis ("ressurreição para a vida" em grego) é um fenômeno de recuperação celular recentemente descoberto pelo qual as células a morrer pode reverter processos de morte celular do tarde-estágio que geralmente são considerados intrinsecamente irreversível. Promoção anastasis poderia no resgate de princípio ou preservar feridos células que são difíceis de substituir tais como cardiomyocytes ou neurônios, facilitando assim a recuperação do tecido. Por outro lado, suprimindo anastasis em células de câncer, passando por apoptose após terapias contra o cancro, pode assegurar a morte de células de câncer e reduzir as chances de recorrência. No entanto, estes estudos foram dificultados pela falta de ferramentas para controlar o destino das células que passam por anastasis em animais vivos. O desafio é identificar as células que reverteram o processo de morte celular apesar de sua aparência morfologicamente normal após a recuperação. Para superar esta dificuldade, nós desenvolvemos Drosophila e sistemas de biosensor CaspaseTracker mamíferos que podem identificar e controlar permanentemente o anastatic células in vitro ou in vivo. Aqui, apresentamos os protocolos na vivo para a geração e utilização do sistema CaspaseTracker dual biosensor para detectar e rastrear anastasis em Drosophila melanogaster após exposição transitória aos estímulos de morte celular. Enquanto biosensores convencionais e protocolos podem rotular as células ativamente submetidos à morte de células apoptóticas, o biosensor CaspaseTracker permanentemente pode rotular as células que se recuperaram após a ativação de caspase - uma marca registrada da apoptose do tarde-estágio, e simultaneamente identifica processos apoptotic ativo. Este biosensor também pode acompanhar a recuperação das células que tentou outras formas de morte celular que directa ou indirectamente envolvidas caspase atividade. Portanto, este protocolo permite-nos acompanhar continuamente o destino dessas células e seus descendentes, facilitando estudos futuros da funções biológicas, mecanismos moleculares, fisiológicas e patológicas consequências e implicações terapêuticas de anastasis. Também discutimos os controles adequados para distinguir células que passam por anastasis daqueles que exibem não-apoptotic caspase atividade in vivo.

Introduction

Programado a morte celular, tais como apoptose, desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário e homeostase normal, eliminando indesejadas, feridas ou perigosas de células em organismos multicelulares1,2,3. A perda do equilíbrio entre a morte celular e sobrevivência pode levar a consequências fatais como câncer, insuficiência cardíaca, auto-imunidade e degeneração4,5,6,7,8. Ativação de carrasco caspases tem sido tradicionalmente considerada como o "ponto sem retorno" em apoptose9,10,11, que provoca rápida e maciça demolição celular12, 13,14,15,16. Desafio este dogma geral, temos demonstrado que culturas de células primárias moribundos e células cancerosas podem recuperar a não somente após a ativação de caspase, mas também seguir célula importante marcas de morte, incluindo blebbing de membrana plasmática, encolhimento celular, mitocondrial fragmentação, liberação de mitocondrial citocromo c no citosol, nuclear e condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, célula superfície exposição de fosfatidilserina (PS) e formação de corpos apoptotic 17 , 18 , 19 , 20 , 21. propomos que anastasis é um fenómeno de recuperação de célula intrínsecas, como células morrendo podem recuperar após a remoção da célula morte estímulos17,18,19,20, 21. cunhou o termo "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "subir de vida" em grego, para descrever este fenômeno de recuperação celular inesperado. Nossa observação de anastasis mais é suportada por recentes estudos independentes que também revelam a recuperação das células após a fosfatidilserina exteriorização22,23,24, limitado mitocondrial externa membrana de permeabilização25, ativação de linhagem mista como quinase (MLKL) e de encolhimento de célula26.

Caracterizar os mecanismos de regulação anastasis terá implicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas mudança de paradigma. Anastasis poderia representar um mecanismo previamente desconhecido tilacoides para resgatar ou preservar importantes postmitotic células e tecidos que são difíceis de substituir e possivelmente conta para reversão de insuficiência cardíaca por descarga ventricular com ventricular esquerda assistir dispositivos (LVADs)27,28, recuperação de células fotorreceptoras após exposição transitória de luz excessiva29,30,31, ou reparação de neurônios depois de lesão cerebral32. Se então promover anastasis poderia reforçar a recuperação de células e tecidos. Por outro lado, anastasis pode ser uma tática de fuga inesperada, usada por células cancerosas a sobreviver a terapia de indução de morte celular, causando câncer recorrência17,18. Portanto, suprimindo o anastasis na morte de células cancerosas durante e após o tratamento do câncer pode ser uma romance estratégia terapêutica para curar o câncer, impedindo sua recaída.

Durante o processo de anastasis, achamos que algumas células recuperadas adquiriram permanentes alterações genéticas e foi submetido a transformação oncogênica, provavelmente devido a danos no DNA incorridos durante a apoptose18,20,21 . Inverter o processo de morte de células com DNA danificado pode ser um mecanismo de tumorigênese, potencialmente subjacente a observação que repetidas lesões no tecido aumenta o risco de câncer em uma variedade de tecidos, tais como lesões térmicas crônica do esôfago induzida pelo consumo de bebidas muito quentes33,34,35, lesão hepática devido ao alcoolismo36,37, evolução do tumor após genotóxicos câncer terapia38, 39,40e desenvolvimento de novos cancros de tecidos normais que surgem durante os intervalos entre os ciclos de terapia anti-câncer41,42,,43,44 . Se true, alvejando anastasis poderia impedir ou prender o desenvolvimento de câncer e progressão. Nós achamos que induzida por inanição moribundos células germinativas sofrem anastasis na re-alimentados Drosophila19.  Se anastasis ocorre em células germinativas com danos no DNA, pode ser conta para a observação de que prolongado estresse ambiental promove o desenvolvimento de doenças genéticas. Por exemplo, fomes contribuam para o desenvolvimento de doenças hereditárias transgeracional, como diabetes e doenças coronarianas45. Portanto, anastasis de compreensão pode levar a estratégias para a prevenção de doenças hereditárias causadas por este mecanismo potencial de desenvolvimento.

Para aproveitar a descoberta de anastasis e direcioná-lo para desenvolver terapias inovadoras, é essencial estudar a causa e consequência de anastasis em animais vivos. No entanto, tecnicamente é um desafio para identificar e rastrear anastatic células na vivo, porque as células que se recuperou do processo de morte celular aparecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais, e não há nenhum biomarcador de anastasis identificados ainda17,18,21. Para resolver esses problemas, recentemente desenvolvemos um novo na vivo caspase biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar e localizar as células que sobrevivem a apoptose depois de19,de ativação do caspase46, o marca registrada do apoptosis10,14. Distinguindo-a dos biosensores caspase "tempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 que detecta atividade de caspases em curso, o biosensor CaspaseTracker adicionalmente apresenta a capacidade de permanentemente rotular as células nessa atividade caspase expressa mesmo transitoriamente. Portanto, o biosensor CaspaseTracker permite rastreamento de longo prazo de anastasis após reversão de caspase-mediada pilha morte processo em vivo.

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Protocol

1) preparação de moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. Anestesiar moscas com CO2e use um pincel para transferência de 7 a 10 sensíveis à caspase Gal4 (DQVD)19 virgem fêmeas e 7 a 10 G-rastreamento53 Gal4 repórter jovem masculinas moscas (ou vice-versa) no mesmo frasco com comida de mosca e colar de fermento fresco.
    Nota: Cruz de moscas Gal4 Caspase-sensível (DQVD) e G-rastreamento produzirá moscas de descendência CaspaseTracker. Cruz da Caspase -nosensível (DQVA)19 Gal4 e moscas G-rastreamento irão fornecer controle negativo voa (ver discussão). Fermento fresco colar serve como fonte de proteína para aumentar a produção de ovos, assim que aumenta o número de descendentes. Selecionar as fêmeas virgens e jovem macho voa de acordo com seus fenótipos54.
  2. Incubar as moscas a 18 graus Celsius (oC) durante a Cruz por 3 a 7 dias e depois transferir as moscas para um novo frasco para configurar uma nova Cruz a 18 ° C. Continue a incubar o frasco original a 18 ° C até a descendência voa eclose.
    Nota: Transferi o pai voa para novos frascos para evitar superlotação de progênie no frasco original. Moscas de pai podem produzir progênie com alimentos frescos e colar de levedura nos primeiro de 2 a 3 interruptores, e então a produtividade diminuirá significativamente com o tempo. Levantando moscas 18 ° C pode reduzir o sinal específico de biosensor CaspaseTracker (ver discussão).
  3. Selecione progênie voa com fenótipos correto54 para experimentos seguintes.
    Nota: Os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento aqui estão localizados no cromossomo segundo, equilibrado com balanceador CyO. Selecione a progenitura de asa não-curly (sem CyO), que tem ambos os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento.

2) a aplicação de indução de morte celular transitória para moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. Transferência de 10 a 20 recém eclosed fêmea voa para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco para 1 dia a 18 ° C, para permitir a produção de câmara de ovos pela ovogênese.
    Nota: Mantendo a fêmea com moscas machos pode aumentar a produção de câmara de ovos.
  2. Para câmaras de ovo submeter-se a apoptose por choque frio, transferência de induzir a fêmea voa para novo frasco vazio, que é então colocado a-7 ° C durante 1 h.
    Nota: choque frio fere células através da indução de55,de ruptura de membrana plasmática56.
  3. Para induzir o ovo câmaras submeter-se a apoptose por inanição de proteína, transferi as moscas fêmeas para um novo frasco com 8% de sacarose e 1% alimentos de ágar a 18 ° C durante 3 dias.
    Nota: Fome de proteínas (alimentos não proteico) pode desencadear câmaras de ovo para se submeter a apoptose57,58,59 e autofagia60,61. Interruptor voa para um novo frasco com comida de ágar de sacarose e 1% de 8% todos os dias para manter a condição ideal de sacarose a comida de mosca.
  4. Transferi as moscas estressadas volta para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco por 3 dias a 18 ° C, para permitir-lhes para se recuperar. Disse a fome e as moscas de fome-recuperado para obter câmaras de ovo de ovários como descrito62.
    Nota: Para dissecar drosófila para obter os ovários, anestesiar moscas com CO2e usar 2 pares de pinças para remover a cabeça de mosca e use a pinça para puxar a base do abdômen para remover os ovários das moscas.

3) fixação e coloração das câmaras de ovo dissecado para a imagem latente

  1. Transferi as câmaras dissecado ovo junto com ao redor de soro fisiológico 0,5 mL tamponado fosfato (PBS) para tubos de centrífuga de 1 mL. Permitir que os ovos se acalmar.
    Nota: Cubra as pontas de pipetas de plástico com 1% albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em água ou PBS para evitar que as câmaras de ovo para ficar na superfície de plástico das dicas. Execute os seguintes procedimentos no escuro para evitar fotobranqueamento de proteína fluorescente vermelha (RFP, também conhecido como DsRed) e proteína verde fluorescente (GFP) na sala do ovo.
  2. Remova a PBS pipetando e então aplique paraformaldeído 4% de 0,5 mL de PBS para corrigir as câmaras de ovo em temperatura ambiente no escuro por 20 a 30 min.
    Nota: Aplica rotação suave neste e as seguintes etapas de incubação.
  3. Remover o paraformaldeído pipetando e em seguida, lavou a câmara de ovo com 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) por 3 vezes.
    Nota: Fixação prolongada poderia reduzir os sinais RFP e GFP.
  4. Incubar as câmaras de ovo com PBST para 1 a 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, com suave rotação para permeabilize as câmaras de ovo.
    Nota: PBST também pode evitar câmaras de ovo para manter a superfície de plástico revestida não-BSA.
  5. Remover o PBST pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL de 10 μg/mL de corante azul de Hoechst nuclear em PBST ovo câmaras para 1 a 2 h à temperatura ambiente a mancha para núcleo.
    NOTA1: Evite a incubação prolongada com corante nuclear como isto irá aumentar o sinal específico.
    Obs2: Uma abordagem alternativa para manchar o núcleo sem Hoechst é adicionar 200 agente μL de montagem de antibranqueamento com DAPI (ver materiais) e incubar durante a noite,63, antes de montar os tecidos no deslizamento da tampa de vidro, conforme descrito no protocolo 3.8.
    Note3: executar a coloração e os procedimentos a seguir no escuro para evitar fotobranqueamento.
  6. Remover o corante nuclear pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL PBST lavar as câmaras de ovo em tubos de centrífuga de 1 mL por 3 vezes, com incubação de 10 a 20 min com suave rotação entre cada etapa de lavagem.
  7. Remover todos os PBST com pipeta fina e em seguida, aplicar 200 agente de montagem antibranqueamento μL (ver materiais) para incubar as câmaras de ovo em temperatura ambiente por 3 h ou durante a noite a 4 ° C até que as câmaras de ovo afundam até o fundo do tubo.
    Nota: os tecidos que absorveram plenamente o agente de montagem afundam até o fundo do tubo.
  8. Montar as câmaras de ovo manchado por transferi-los com 200 μL antibranqueamento montagem agente sobre uma lâmina de vidro previamente limpos para a imagem latente por pipetagem, cobrir as câmaras de ovo com uma lamela de vidro previamente limpos de 20 x 20 mm e selar a lamínula sobre a lâmina de vidro, colocando esmalte na borda da lamínula.
    NOTA1: Limpeza prévia a lâmina de vidro e lamínulas com água ou 70% de etanol.
    Obs2: Aplique vaselina entre a lâmina de vidro e o deslizamento da tampa para evitar destruir as câmaras de ovo por overcompression.
  9. As câmaras de ovo usando fluorescência ou microscópio confocal, usando um x 20, at 0.8 de imagem plano-Apochromat objectivo, com excitação luz de comprimento de onda 405 nm para coloração nuclear (detectar emissões ~ 461 nm), 561 nm para (sinal RFP (atividade da caspase recentes ou em curso) detectar emissões ~ 590 nm) e 488 nm para sinal GFP (passado atividade caspase) (detectar emissões ~ 518nm).
    Nota: Consulte nossos protocolos publicados para microscopia20,64.

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Representative Results

Enquanto microscopia de lapso de tempo célula viva é um método confiável para trato anastasis em pilhas cultivadas20, é um desafio para identificar quais células sofreram anastasis em animais, porque as células recuperadas parecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais que não procuraram a morte celular. Por exemplo, células de cancro do colo do útero humano HeLa exibem características morfológicas de2,apoptose1,14, como encolhimento celular, condensação nuclear e membrana plasmática blebbing em resposta à morte celular estímulo de 1 µm staurosporine17 (figura 1A, 1B figura i-ii). Depois de retirar o estímulo de morte celular e incubação em meio fresco, as células morrendo reverter o processo de morte celular por anastasis17,18, conforme indicado pela recuperação morfológica (figura 1B iii-iv), seguido de proliferação (figura 1B v-vi). Nossos estudos anteriores também utilizaram biosensores caspase "tempo real", tais como ApoAlert (NES-Cecilia-YFP-NLS) para demonstrar a inversão da apoptose após a ativação de caspase18,20. Este biosensor localiza-se para o citoplasma em células saudáveis (Figura 1, 1D e eu). Após a ativação de caspase desencadeada pelo etanol de 3,7% de estímulo de morte celular, este biosensor YFP-baseado é clivada por caspases e translocado para o núcleo, onde se acumula e a fluorescência nuclear resultante da sua tag YFP identifica células com em curso atividade da caspase (Figura 1 C, 1 D ii-iii). As células morrendo também exibem características morfológicas da apoptose durante a indução de etanol1,14,18,20, tais como a fragmentação da mitocôndria tubular, nuclear encolhimento celular, condensação e blebbing membrana plasmática (Figura 1 ii-iii). Curiosamente, após a remoção do estímulo de morte celular, as mesmas células podem recuperar e recuperar a morfologia normal (Figura 1 iv-viii). Notavelmente, a fluorescência nuclear da ApoAlert (biosensor clivada) desapareceu dentro de 1 hora nas células recuperadas (Figura 1 iv-viii), possivelmente devido a processos semelhantes que eliminam componentes danificados em anastatic células18 , como caspase-3 clivada, PARP e ICAD gerados durante a apoptose. Portanto, uma nova estratégia é necessária para acompanhamento anastasis sobre um frame de tempo mais longo, especialmente na vivo.

Para controlar o destino das células anastatic, desenvolvemos o sistema de biosensor mamíferos CaspaseTracker, que rotula permanentemente as células após ser clivado pela atividade de caspases de carrasco. Este biosensor é composto de um rtTA caspase-sensível (reversa controlado tetraciclina liberada) e um repórter baseados em Cre-LoxP rtTA atividade (Fig. 2A-B). Em células saudáveis, sem nenhuma atividade de caspase, liberada rtTA65 é amarrado a membrana plasmática âncora (Lyn11)66,67, sinal de exclusão de núcleo (NES) do mapa da quinase quinase (MAPKK)68, e receptor de estrogênio variante (ERT2)69 através de caspase-cleavable linkers de70 (Cecilia) derivado de PARP (Figura 2A, 2B). Como rtTA amarrado não pode translocar do citosol para o núcleo, isso não é possível ativar o repórter rtTA. No entanto, após a ativação em resposta a um estímulo de morte celular, caspases cleave os linkers Cecilia, liberando o rtTA para translocar para o núcleo (Figura 2B). Uma vez no núcleo, o rtTA vincula-se ao elemento de resposta tet (TRE) e gatilhos expressão transiente da Cre recombinase, que leva a um evento de recombinação irreversível que remove a gaveta de códon de parada entre o promotor CAG e as sequências de codificação para proteína fluorescente vermelha (DsRed). Isso resulta na expressão permanente de DsRed (Figura 2B), que serve como o marcador fluorescente permanente dessas células que pode permanecer vivo depois que experimentaram atividade caspase, bem como seus descendentes (Figura 2).

Para testar o biosensor CaspaseTracker mamíferos, nós introduziu em células HeLa por transfecção transiente, tratadas as células com um estímulo de morte celular (staurosporine de 1 µm) e fiscalizados recuperação das células pela microscopia confocal de célula viva de lapso de tempo que temos descreveu a20. Doxiciclina (concentração final de 1µg/mL), que é essencial para permitir rtTA atividade65,71, foi adicionada ao meio de cultura celular para ligar o biosensor durante todo o experimento. Em resposta ao estímulo de morte celular, as células tratadas exibem características da apoptose, incluindo o encolhimento da célula e a membrana plasmática blebbing como esperado (Figura 2D i-iii). Depois de retirar o estímulo de morte celular, enxaguar anastasis de camada uma vez e o meio de cultura fresco adicionando, a célula pode ser observado nas células morrendo, tal como indicado pelo seu retorno para uma morfologia normal (Figura 2D iv-vii). Para o diagnóstico, só recuperamos o DsRed marcador fluorescente durante e após o anastasis (Figura 2D iv-vii), distinguindo-os de células não-recuperado (Figura 2D iv-vii) e controle de células células express não expostos ao estímulo de morte celular (Figura 2E). Isto demonstra a aplicação e a utilidade do mamíferos CaspaseTracker como uma nova ferramenta para identificação e rotulagem permanentemente as células anastatic, recuperando-se de caspase-ativação de romance e fornece uma maneira para rastrear e estudar seu destino a longo prazo.

Para detectar e rastrear anastasis em animais vivos, os animais transgénicos do biosensor CaspaseTracker são necessários. Portanto, primeiro usamos Drosophila melanogaster como um sistema modelo19, porque como é um organismo geneticamente tractable importante para o estudo do desenvolvimento de animais e doenças humanas72,73,74 ,,75. Como modificado desde o mamíferos CaspaseTracker biosensor, o biosensor dual Drosophila pode identificar e distinguir "recentes/on-going" do "passado" atividade caspase. Esta dupla biosensor é composto por uma caspase-sensível Gal419e o repórter Gal4 G-rastreamento53 (Figura 3A). Em células sem nenhuma atividade de caspase, o fator de transcrição de levedura Gal4 é amarrado a um domínio de âncora (mCD8) de membrana plasmática através de um vinculador caspase-cleavable (DQVD), derivado de DIAP1 (Figura 3B), tendo uma mutação de 21NN/GV22 para prevenir a degradação de Gal4 pela regra N-final mediante clivagem caspase do vinculador afterAsp2076e uma mutação de D135R para abolir a jgcamaleon caspase função inibitória no domínio BIR177. Como Gal4 amarrados não pode translocar para núcleo sem clivagem por caspase para liberá-lo, o repórter Gal4 G-rastreamento permanece inativo nas células tendo nenhuma atividade de caspase19. Após a ativação de caspase, no entanto, caspases ativadas cleave o vinculador DQVD, liberando Gal4 para translocar para o núcleo para ativar o rastreamento G repórter (Figura 3A)19. Gal4 vincula específicas ativando sequências (UAS) para acionar a transcrição transitória e expressão de RFP, que então serve como um repórter fluorescente de atividade caspase recente ou atual até a Gal4 (caspase) atividade para EPorta então é proteína RFP degradado. Gal4 também desencadeia a expressão do recombinase FLP do transgene, levando a um evento de recombinação que remove a gaveta de códon de parada entre um promotor da ubiquitina (Ubi) e a sequência de código para núcleo-alvo GFP (nucGFP). Isso resulta na expressão permanente de nucGFP, que serve como marcador permanente dessas células que experimentaram atividade caspase e permanecer vivo.

Para testar o Drosophila CaspaseTracker biosensor para a detecção de apoptose e anastasis na vivo, CaspaseTracker fêmea voa foram submetidos a stress fisiológico (Figura 3), tais como19, que pode eficientemente um choque frio morte celular de gatilho, incluindo apoptose, conforme indicado pela ativação de caspase, condensação nuclear e célula encolhimento19,78e também necrose devido a refrigeração que provoca perda de integridade de membrana e escapamento de citoplasmática Sumário55,,56. Como esperado, o CaspaseTracker não foi ativado no ovo câmaras de moscas de controle onde não foi morte celular estresse induzido (Figura 3D). Em contraste, as câmaras de ovos de moscas estressadas um dia após o choque frio mostraram não só encolhimento de célula apoptótica característico e condensação nuclear, mas também RFP e GFP expressão, indicando a presença de recente ou em curso (RFP +) e últimos (GFP +) caspase atividade (Figura 3E). No entanto, em 3 dias após o retorno as moscas estressadas a condição normal não-salientando, GFP, mas sem RFP, expressão foi detectado nas câmaras de ovo recuperado (Figura 3F). Isto indica que câmaras de ovo que tinham manifestado caspase atividade após estresse foram capazes de superar o processo de morte celular e sobreviver.

Para testar a reversibilidade do processo de morte celular no ovo câmaras19, CaspaseTracker moscas fêmeas foram realçadas por inanição de proteína depois sendo alimentado a 8% de sacarose em ágar de 1% para 3 dias. Estudos anteriores demonstraram que fome de proteína pode desencadear a apoptose mediada por caspase e autofagia em tecidos com somáticas e as células germinativas, incluindo ovo câmaras57,60,61. Como esperado, CaspaseTracker foi ativado em câmaras do ovo após 3 dias de fome de proteínas (Figura 3). As câmaras de ovo moribundo exibiram tanto apoptotic morfologias e expressão dos RFP e GFP biosensor marcadores, indicando recentes ou em curso (RFP +) e passado a atividade de caspase (GFP +) (Figura 3). Para demonstrar que o CaspaseTracker pode controlar células recuperadas que experimentaram previamente a ativação de caspase após um estímulo de morte, as fome moscas foram transferidas para comida de mosca proteicos normal. Como esperado, as câmaras de ovo recuperado dessas moscas ser alimentadas faltam o repórter de caspase transiente de RFP, não indicando nenhuma atividade caspase recentes ou em curso (Figura 3-H). No entanto, as câmaras de ovo nestas moscas depois de aliviar o stress, devolvendo-as para comida normal exibido o repórter de caspase GFP (Figura 3 H), indicando que as células nestas câmaras de ovo tinham revertido o processo de morte celular iniciada em um ponto depois ativação de caspase. Verificação de que a atividade de biosensor CaspaseTracker é desencadeada por caspase foi obtida substituindo a sequência de clivagem DQVD com a sequência de DQVA, qual caspase é incapaz de se decompor e que abolir a atividade de biosensor (Figura 3B, 3I ).

Depois que o CaspaseTracker Drosophila recuperado de fome de proteínas, nós encontramos que vários tipos de células nas câmaras de ovo, como as células somáticas (folículo) e células da linha germinal (células de enfermeira e oócitos), exibido somente as boas práticas agrícolas, mas não RFP (Figura 3J )19, indicando que essas células podem sofrer anastasis após a ativação de caspase. Curiosamente, o GFP também rotulado células em germarium (Figura 3J)19, que contém as células-tronco, juntamente com suas câmaras de ovo associado na mesma cadeia de ovariole. Portanto, estas câmaras de ovo de GFP-positivo podem ter sido derivadas de células-tronco que se recuperaram de processo de morte celular após a ativação de caspase. Importante, a fêmea faminta e re-alimentada voa por ovos férteis que podem produzir GFP-expressando progênie moscas19, sugerindo que potencialmente as células inverter processo de morte celular após a ativação de caspase pode recuperar a função aparentemente normal. Futuros estudos são necessários para determinar se moscas de descendentes que sobrevivem como consequência anastasis apresentam sequelas permanentes.

Figure 1
Figura 1 . Recuperação de HeLa células após a indução de morte celular.
(A) diagrama esquemático da abordagem para induzir a morte celular e posteriormente permitir morrer células para recuperar após a remoção do indutor de morte celular.
(B) microscopia DIC de lapso de tempo ao vivo celular de células HeLa saudáveis (eu), o mesmo grupo de células após o tratamento com staurosporine de 1 µm (ii) e então lavadas e incubadas ainda mais com o meio de cultura fresco para remover o staurosporine ( III-vi). Seta branca indica uma célula em divisão.
(C) diagrama esquemático da proteína de fusão de biosensor caspase NES-Cecilia-YFP-NLS e a Localização subcellular da YFP durante a indução de morte celular e depois anastasis.
(D) microscopia confocal de lapso de tempo ao vivo celular de uma célula HeLa, expressando a proteína de fusão de biosensor caspase NES-Cecilia-YFP-NLS antes (eu), durante a exposição, 3,7% de etanol (ii - iii) e depois remoção de etanol meio de cultura (iv - viii). Aqui são mostrados imagens de só o biosensor de caspase (fluorescência verde, linha superior); fundiu-se imagens do núcleo Hoechst-manchado (fluorescência azul) e mitocôndrias (fluorescência vermelha) (linha média), e imagens na linha média, ainda mais, fundiu-se com imagens DIC (linha inferior). Setas brancas na linha superior indicam nuclear YFP localizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Sistema de biosensor mamíferos CaspaseTracker.
(A) diagrama de rtTA o caspase-sensíveis.
(B) diagrama do sistema de biosensor rtTA CaspaseTracker de mamíferos.
(C) fluxograma de usando o sistema de biosensor rtTA CaspaseTracker para detectar anastasis. Triângulo vermelho/amarelo (aplicar indutor de morte celular) e verde/azul (indutor de lavagem fora) símbolos são como na figura 1A.
(D) microscopia confocal Time-Lapse célula viva de um aglomerado de células HeLa, expressando o mamíferos CaspaseTracker rtTA biosensor antes (eu) e durante a exposição de staurosporine de 1 µm (ii - iii) e após a remoção staurosporine meio de cultura (iv - vii). Imagens mescladas de sinais DIC e DsRed. As setas indicam a célula 1 (amarelo) e 2 (verde) da pilha.
(E) microscopia confocal Time-Lapse células vivas as células de HeLa biosensor-expressando não tratada. Imagens mescladas de sinais DIC e DsRed. Setas brancas indicam divisão de células.
Doxiciclina (1ug/mL) estava presente no meio de toda as experiências mostradas nos painéis (D) e (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Drosófila CaspaseTracker sistema de dual biosensor. (Adoptado com permissão de Tang et al., 2015 de relatórios científicos, 9:9015 19 ).
(A) diagrama do sistema de biosensor Drosophila CaspaseTracker Gal4.
(B) diagrama do caspase-sensível (DQVD) e diferenciação de caspase controle (DQVA) Gal4.
(C) esquema de ovário de Drosophila e fluxograma para morte de célula-indução em moscas 1 dias de idade, seguido de recuperação de 3-dias em condições normais. Drosófila imagem fornecida por Darren Obbard.
Imagem confocal representativa de (D) das câmaras de ovo do ovário de uma mosca feminino biosensor alimentados com comida de mosca normal por 6 dias (não tratado).
E imagem confocal representativa das câmaras do ovo do ovário de uma mosca de frio chocado biosensor feminino colocado-7 ° c durante 1 h e depois mudou para condição normal de cultura para 1 dia (choque frio, CS).
(F) como painel E exceto as moscas chocados frios passaram à condição de cultura normal por 3 dias (recuperada após CS).
(G) imagem confocal representativa de ovo câmaras do ovário de um esfomeado biosensor fêmea voam alimentado com 8% de sacarose em 1% de ágar sem proteína por 3 dias (fome).
(H) como painel G , exceto as moscas tratados foram trocados para comida de mosca normal durante 3 dias após o tratamento de fome de proteínas (re-alimentado).
(I) como painel G exceto mostrando a fome do caspase emsensível moscas de biosensor feminino CaspaseTracker (DQVA), que serviram como controle negativo.
(J) imagem confocal representativa das câmaras do ovo de um esfomeado e re-alimentados feminino drosófila. As setas indicam nuclear GFP expressando nas células de enfermeira (pretas), oócitos (brancos) e células do folículo (amarelas) das câmaras de ovo e o germarium (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Implicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas de anastasis. (Adoptado com permissão de Tang et al., F1000Res 2017, 06:43 21 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O sistema de dupla biosensor CaspaseTracker é uma nova e exclusiva ferramenta que permite a detecção de recente ou atividade caspase em curso e rastreamento de células que reverteram a morte celular processar e sobrevivem depois de experimentar caspase atividade na vivo. Enquanto atividade caspase tem sido tradicionalmente assume-se como uma marca registrada da apoptose, crescentes estudos revelam que não-apoptotic caspase atividade desempenha funções potenciais em funções diversas células normais, tais como a regulação da atividade neuronal79, 80, aprendizagem e memória81,,82,83,84, supressão de necroptotic célula morte85,86, nucleologênese individualização87, 88, microRNA processamento destino célula padronização91, proliferação de célula90e89. Além de apoptose e anastasis, o sistema de biosensor CaspaseTracker, portanto, pode detectar não-apoptotic caspase atividade, que está presente no cérebro e lóbulos de óptica, cárdia, intestino, Malpighi túbulos, traqueia, músculos e outros tecidos da Drosófila19,46,64. Este sinal de biosensor também poderia representar a atividade atual ou passado anastatic durante o desenvolvimento do embrião ou homeostase normal nestes tecidos. Para estudar o anastasis após estresse ambiental induzindo a morte celular transiente em animais vivos, é essencial escolher tecidos com as células que não exibem nenhuma atividade de biosensor caspase sob condições fisiológicas normais, mas que pode ser induzido a se submeter a caspase ativação por indução de morte celular transitória. Câmaras de ovo são ideais para essa finalidade, porque normalmente não têm nenhuma atividade de caspase de germarium para a fase 10 durante a ovogênese58,59,92.

Expondo feminino drosófila para transientes estresses ambientais, tais como proteínas fome e frio, choque, pode eficientemente desencadear ativação de caspase e morte celular no ovo câmaras19,57,58, 78. Passos críticos dentro do protocolo incluem evitar a indução de morte celular prolongada para moscas. As condições otimizadas de choque frio (1 h a-7 oC) a fêmea voa e fome de proteína (8% de sacarose em ágar de 1% para 3 dias) podem desencadear o processo de morte celular caspase-ativado nas câmaras de ovo e permitir-lhes para se recuperar após as estressado moscas são retornadas para condição normal19. Tratamento prolongado com um estímulo de morte celular pode desencadear mais câmaras de ovo para se submeter ao processo de morte celular, mas a taxa de recuperação também é reduzida, presumivelmente porque as câmaras de ovo moribundo experimentam enormes danos além do reparo.

Uma etapa crítica adicional neste protocolo é reduzir o sinal de fundo CaspaseTracker em câmaras de ovo pelo cruzamento, criando e mantendo que o CaspaseTracker voa em uma temperatura mais baixa, como 18 óC. Enquanto a maioria das câmaras de ovo de forma otimizada criados moscas não exibir atividade caspase no germarium fase 10 durante a ovogênese58, cerca de 1% das câmaras de ovo poderia apresentam atividade de biosensor caspase sem indução de morte celular19 . Isso pode refletir a taxa de atrito normal devido a erros inatos ou pode ser acionado involuntariamente durante a ovogênese pelas condições padrão de laboratório. Como Gal4 exibe menos atividade em moscas em baixa temperatura93, levantar moscas 18 oC, em vez de à temperatura ambiente, pode reduzir o sinal endógeno que ativa o sistema CaspaseTracker. Alternativamente, moscas de comutação para uma temperatura mais elevada, tais como 29 óC, pode aumentar a sensibilidade do sistema de CaspaseTracker, devido a aumentar a Gal4 atividade93e potencialmente outro endógeno dependente da temperatura enzimática atividades.

É importante distinguir as células CaspaseTracker-positivo que passam por processo de morte celular ou anastasis de células que apresentam não-apoptotic caspase atividade. Células apoptóticas expressam RFP (transiente marcador para atividade de caspases em andamento ou recente) e muitas vezes de GFP (fabricante de permanente para últimos atividade caspase) no tratamento de indução de apoptose, como estas células a morrer têm atividade caspase em curso que Gal4 cleave-ativado, que, em seguida ativa o transiente (Gal4 atividade dependente RFP) e permanente (Gal4 acionado FLPase-FRT mediada GFP) repórteres do sistema G-rastreamento. A apoptose destas células pode ser confirmada por morfológicos e bioquímicos timbres tais e.u. condensação nuclear detectado pela coloração com corantes nuclear14,19,58e clivagem de caspase detectado pelo immunostaining19,94. As células que já sofreram anastasis exibem permanente expressão de GFP devido o eventos de recombinação mediada por FLPase do sistema de rastreamento-G. Estas células expressam sem RFP como eles não têm nenhuma atividade de caspases em curso, nem outras marcas da apoptose19. Estas células também exibem normal morfologia nuclear. As células têm em curso não-apoptotic caspase atividade muitas vezes exibir expressão tanto RFP e GFP, e também tem uma morfologia nuclear normal19.

Pode ser difícil de distinguir células que experimentou anastasis partir dessas células que tinham passado não-apoptotic caspase atividade, porque ambos exibir apenas as boas práticas agrícolas e não tem nenhuma marca de morte celular. Portanto, o cuidadosos controle de experimentos devem ser incluídos19. Para exemplos, para estudar o anastasis nas câmaras de ovo, é essencial para examinar a expressão de GFP em moscas salientou-se recuperou e não-forçado moscas (controle negativo). Moscas recuperadas devem mostrar mais células GFP-expressando que moscas átonas, se anastasis ocorreu após a ativação de caspase. Também é importante distinguir os sinais fluorescentes CaspaseTracker de autofluorescência inespecífica, como observado na cutícula, pigmentos e corpos de gordura19. Geramos o controlo negativo biosensor moscas, transformando o local de clivagem de caspase do biosensor (DQVD), para uma sequência não-cleavable (DQVA) e tornando o biosensor de controle não-responsivos a caspase atividade19. O sinal detectado na caspase sensível (DQVD), mas não nas moscas de biosensor de controlo negativo (DQVA) é o sinal de interesse, provocado pela atividade de caspases, em vez de autofluorescência.

Nossa atual Drosophila dual CaspaseTracker biosensor pode identificar células com atividade de caspases "recente" pela expressão de RFP e células com atividade de caspases "passado" pela expressão de GFP19. Notamos que a RFP não é um indicador de atividade da caspase "tempo real", porque demora algumas horas de tempo de reação para Gal4 dirigir a expressão de RFP, em resposta à atividade de caspases. Para adicionar uma função de "tempo real", o Drosophila CaspaseTracker biosensor pode ser combinado com o recentemente desenvolvido iCasper biosensor52, um "tempo real" e "escuro a brilhante" em vivo biosensor que mostra apenas seu sinal far-red quando é clivados por caspases.

Além de apoptose, CaspaseTracker poderia potencialmente também ser ativado durante a tipos alternativos de morte celular como células podem mudar caminhos de morte celular durante seu curso que direta ou indiretamente envolve a ativação de caspase, tais como autofagia após fome95,96, necrose pela membrana de plasma frio induzida por choque ruptura19,55,56,78e induzido por staurosporine necroptosis97, 98. Nossos estudos actuais e anteriores demonstraram que o CaspaseTracker biosensores podem rotular células obtidas estas células morte induções em vitro ou na vivo17,18,19 , 20 , 21. como estas induções de morte celular sozinhos poderiam simultaneamente ativar múltiplas vias de morte celular nas mesmas células, a recuperação destas células a morrer sugere que anastasis é um fenômeno de recuperação celular geral que pode reverter a morte celular diferente processos, incluindo apoptose, autofagia, necrose e necroptosis, individualmente ou simultaneamente.

O biosensor na vivo CaspaseTracker facilitará a busca das funções ainda desconhecidas, mecanismos e implicações terapêuticas da anastasis (Figura 4)21. Para revelar a assinatura molecular da anastasis, realizamos estudos de microarray-curso a tempo inteiro-genoma gene expressão para analisar as células do fígado primário do mouse durante a reversão da apoptose induzida pelo etanol e curiosamente, encontrei alterações marcantes no transcrição de genes envolvidos em várias vias, incluindo pro-sobrevivência, antioxidação, resposta de dano do ADN, modificação de histona, angiogênese, migração celular e transformação18,21. Esta constatação é suportada pelo nosso estudo de validação da recuperação de células de câncer de fígado humano HepG2 de apoptose18,21e, também, um estudo recente de sequenciação do ARN independente das células HeLa, na recuperação de apoptose99. Curiosamente, a regulação de alguns fatores de pro-sobrevivência encontrados em células anastatic são também observadas na reversão de insuficiência cardíaca, progressão do tumor e recorrência do câncer100,101,102, sugerindo a eventual participação de anastasis. Para estudar as potencialidades fisiológicas, patológicas e terapêuticas da anastasis, é importante identificar as células anastatic e seguir o seu destino em pequenos animais, como isso permitirá estudos terapêuticos e mecanicistas. Nossa Drosophila e mamíferos CaspaseTracker biosensores serão ferramentas úteis para testar as contribuições potenciais de anastasis no desenvolvimento normal, homeostase, recuperação de tecido, evolução do tumor, recorrência de câncer e metástase. Conclusão destes estudos vai aumentar nossa compreensão da função natural de anastasis e oferecem um potencial para identificar Revolucionárias novas abordagens terapêuticas para doenças intratáveis por mediação de morte celular e sobrevivência através de controlando anastasis.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Darren Obbard imagem de Drosophila em Figura 3 e no manuscrito de vídeo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb para discussão valiosa sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright conceder 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e o ICN K22 concedem CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang era um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de pesquisa de Ciências da vida (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield mounting medium Vector Products H-1000 Antifade mounting medium
Vectashield mounting medium (with DAPI) Vector Products H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Mitotracker Red CMXRos  Molecular Probes M-7512 Mitochondria stain
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
Bovine Serum Albumin (BAS) Sigma-Aldrich A8806 Blocking agent for immunostaining
Phosphate Buffered Saline  VWR 114-056-101 Medium for washing and immunostaining
Triton™ X-100 Sigma-Aldrich T8787 Detergent for cell permeabilization
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000  Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W AmScope WBM99316  Light source

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