Измерение выживания Время
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Коловратки являются микроскопическими космополитичный зоопланктона (<1 мм) , которые составляют филюмом Rotifera 1. Они имеют простой план тело состоит из примерно 1000 соматических клеток, а также характерным реснитчатого аппарата колесного типа называют коронным, который используется для передвижения и кормления. Большинство коловраток принадлежат к классам Monogononta или Bdelloidea, которые содержат около 1600 и 500 видов, соответственно 2. Monogonont коловратки обычно имеют как половое и бесполое репродуктивные фазы (циклический партеногенез), в то время как bdelloid коловратки размножаются обязательным партеногенеза 3. Таким образом, можно получить генетически идентичных особей коловраток, что обеспечивает высокую воспроизводимость в экспериментах. Кроме того, у них есть ряд других преимуществ в качестве модельных организмов, таких как короткий срок жизни, простота культуры, доступность геномных и транскриптомных последовательности данных 4-7 и уникальной филогенетического позиции , удаленные отrthropods и нематоды 8. Rotifers поэтому перспективные модели беспозвоночными в экологические, токсикологические и старения исследований 9-12.

Время выживания под воздействием нагрузки на окружающую среду или химических веществ является часто измеряемым параметром в этих областях исследований 13-19. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность при измерении времени выживания коловраток, поскольку он чувствителен к условиям окружающей среды их матерей. А именно, в monogonont коловраток Brachionus manjavacas, женское потомство от матерей в возрасте имеют более короткую продолжительность жизни , чем те , от молодых матерей; Однако, ограничение материнской калорий (CR) частично компенсирует вредные эффекты передовой возраст матери 20. В B. plicatilis, материнская CR обеспечивает долговечность потомство, долгое время выживания в условиях голода , и высокой окислительной устойчивость к стрессу , связанный с повышенной экспрессии антиоксидантных ферментов 21,22. Возрастной эффект материнскойтакже наблюдается в bdelloid коловраток 23. Таким образом, условия эксперимента коловратках должны быть тщательно синхронизирована в течение нескольких поколений, прежде чем измерения времени выживания.

Здесь мы приводим протокол для измерения времени выживания в Brachionus коловраток следующей синхронизации условий культивирования в течение нескольких поколений. Периодическое голодание (КРП), изменение CR , где коловратки подают периодически, наносили выявить эффект синхронизации из - за известных эффектов IF на продолжительность жизни 22,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка средств массовой информации

Примечание: Используйте половину разбавленный Brujewicz искусственную морскую воду с соленостью 16,5 п.п. (PSU). Другие искусственные морские воды также часто используются для культивирования Brachionus коловраток 25,26.

  1. Добавить 454 мМ NaCl, 26 мМ MgCl 2, 27 мМ MgSO 4, 10 мМ КСl, и 10 мМ CaCl 2 до 4,5 л дистиллированной воды (конечный объем будет 5 л). В качестве альтернативы, используйте деионизованной воды для разбавления вместо дистиллированной воды. Добавить CaCl 2 после растворения всех других солей.
  2. Приготовьте 0,48 М NaHCO 3 исходного раствора (200x концентрации). Добавить 25 мл нее к указанному выше раствору. Конечная концентрация NaHCO 3 составляет 2,4 мМ.
  3. Подготовить 0,4 М NaBr исходного раствора (500x концентрации). Добавьте 10 мл нее к указанному выше раствору. Конечная концентрация NaBr составляет 0,8 мМ. Изготавливают до 5 л дистиллированной водой.
  4. Фильтр решение с мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.Разбавить его два раза стерильной водой перед использованием (об / об).
    Примечание: Можно сделать концентрацию 2x из Brujewicz искусственной морской воды в качестве исходного раствора.

2. Общие условия культивирования

  1. Культура лабораторно-поднятый или дикие захваченное коловраток в стерильной 100 мл стакане от 20 до 30 ° С. Более высокие температуры приводят к более коротким и продолжительности жизни ускоренного размножения. Используйте 25 ° C для удобства экспериментов. Плотность коловраток или объем искусственной морской воде не является большой проблемой здесь.
  2. Культура диетических видов микроводорослей в искусственной морской воде 11. См Снелл и др. (2014) для деталей 11. Как правило, используют Tetraselmis tetrathele (~ 2 х 10 5 клеток / мл 27,28), Т. Suecica (~ 6 × 10 5 клеток / мл 25,29) и Nannochloropsis oculata (~ 7 х 10 6 клеток / мл 30,31). Так как диета водорослей (виды, культура Кондитионы, биохимические композиции) существенно влияет на время выживания Brachionus коловраток, используют один и тот же много микроводоросли во всех экспериментальных группах.
  3. Держите запаса популяции коловраток в периодической культуре путем подачи и изменения средств массовой информации время от времени (например, кормить каждые 2 дня и прививать каждую неделю). Многие новорожденные и взрослые, имеющие 2-3 яйца можно наблюдать, когда коловратки находятся в оптимальных условиях.
    Примечание: альтернативный способ получения экспериментальных коловраток является люк покоящиеся яйца. Rotifers вылупившиеся из яйца покоящихся считаются хорошо синхронизированы, и их продолжительность жизни существенно не отличается от коловраток вылупились из яиц amictic 11. Тем не менее, коловратки из покоящихся яиц начинают воспроизведение раньше, чем те из amictic яиц. Таким образом, необходимо проявлять осторожность при измерении их репродуктивных признаков.

3. Синхронизация коловраток путем предварительной культуры

  1. Выберите один коловраток из стOck населения и культуры, как описано в 2.1-2.3 создать подгруппу, которая будет использоваться для экспериментов. Обычно культуру в течение двух недель.
  2. Собирают икряных коловраток из субпопуляции (собрать удвоенное количество лиц, которые будут использоваться для эксперимента). Культура их как одну когорту (плотность: ~ 50 особей / мл) в культуральной пластины 6-луночный , как описано в 2.1-2.3 в свежем средах при неограниченном кормлении. Контроль плотности населения имеет важное значение , так как кондиционированная среда влияет на репродуктивную физиологию Brachionus коловраток 32,33.
  3. Передача новорожденные вылупились из первых яиц для взрослых "вновь подготовленной культуральной среды. Повторите эту процедуру в течение 2-3 поколений.
  4. Используйте новорожденные , заштрихованные в течение определенного периода времени (например, <3 ч) для измерения времени выживания. Для того, чтобы избежать возможного смещения при выборе одного человека, хотя и очень маловероятно, проверить воспроизводимости с использованием нескольких незасвисающие субпопуляции.
    Примечание: Как правило, коловратки размножаются только бесполым при этом условии, гарантировать, что никакие мужчины не присутствуют на протяжении всего эксперимента. Самцы имеют меньшие размеры, чем у новорожденных и, как правило, движутся быстрее, чем у женщин. Mictic самки имеют различные продолжительность жизни от amictic самок при определенных условиях 29.

4. Измерения времени выживания

  1. Место новорожденные в пластиковых пластин (как правило, 24- или 48-луночные планшеты с каждой лунки, содержащих 1 мл искусственной морской воды).
  2. Через 24 ч интервалами, передают коловраток вновь подготовленных средств массовой культуры или на 12 интервалов час, если при более высокой температуре (30 ° C или выше). Запишите число потомков и будет ли каждый человек мертв или жив. Запись коловраток, как мертвый, когда реснички движение короны полностью прекратилось.
    Примечание: Коловратки часто прилипают к боковым стенкам лунки. Нежный пипеткой воды помогает найти их. Если коловратки не найдены или аре случайно повреждены пипеткой, записывать их как "цензуру", а не как "мертвые".
  3. Удалить новорожденные, когда экспериментальные коловратки активно воспроизведения. Новорожденные быстро растут, и это иногда трудно отличить их от экспериментальных коловраток.

5. Анализ данных

  1. Создать кривую выживаемости Каплана-Мейера (рисунки 1 и 2) путем построения кумулятивный показатель выживаемости по оси Y и времени на оси X. Это является наиболее распространенным представлением данных по выживаемости. С помощью непараметрического лог-рангового (также называемый тест Mantel-Cox) для статистического сравнения выживаемости 34. Лог-рангового также входит в других стандартных статистических пакетов, таких как JMP и R.
    Примечание: Не используйте Стьюдента или дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим параметрической множественного сравнения Стьюдента , так как нормальное распределение, как правило , не могут быть удовлетворены данными выживаемости 35. Кроме того, эти метоDS не принимают цензурированным лиц во внимание. тест Манна-Уитни U можно использовать, если нет цензурированных данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


На рисунке 1 показаны типичные кривые выживаемости слабо синхронизированных популяций (из двух повторностей). В этом эксперименте, коловратки были либо кормили каждый день [вволю (AL) , группа] или через день (ЕСЛИ группа). Медиана выживаемости составила 13 и 18 дней в AL и IF групп соответственно. Несмотря на то, как хорошо известно, что если продлевает срок службы коловратки, этот эксперимент не удалось обнаружить статистически значимую разницу между продолжительностью жизни АЛ и если группы. Эмпирически, недостаточные результаты синхронизации в ранней смертности и постепенным снижением выживаемости, как наблюдалось в этом эксперименте. Повреждение коловраток, вызванных неадекватной обработкой или низким качеством воды для субпопуляции, как правило, дают сходные результаты.

Когда условия коловраток являются оптимальными и хорошо синхронизированы, ранняя смертность практически не наблюдается и Accordinглицин коловратки , как правило, умирают в синхронном образом во время поздней фазы эксперимента (рис 2). Медиана выживаемости составила 13 и 20 дней в AL и IF групп соответственно. Несмотря на то, меньше животных использовались чем эксперимента на рисунке 1, разница в продолжительности жизни между этими группами было статистически значимым. Это представительные результаты более пяти экспериментов , которые были опубликованы ранее 22.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Кривые Каплана-Мейера для плохо синхронизированных лиц , подвергнутых прерывистый поста (IF) Группа AL подавали в неограниченном количестве в течение всего эксперимента, в то время как группа ИФ подавали через день. N = 11 и N = 12 для AL и если группы, соответственно (N относится к количеству отдельных используемых в эксперименте). Эксперимент perforмед при 25 ° С. Никаких существенных различий в продолжительности жизни не было обнаружено , когда лог-рангового был использован (P = 0,1207). Тем не менее, эти данные трудно интерпретировать , поскольку лог-ранговый критерий не следует использовать для сравнения двух кривых выживаемости пересечение хотя тест , как известно, прочный 36. Нет установленных методов не существует в настоящее время доступны для пересечения кривых выживаемости с цензурой данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Кривые Каплана-Мейера для синхронизированных лиц , подвергаемых случае , если коловраток когорты, полученный предварительной культуры, был подвергнут такой же , если график (подается через день). N = 6 и N = 8 для AL и IF групп соответственно. Эксперимент проводили при температуре 25 ° C. Журнал-тестовый ранг, P = 0,0057. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Текущий протокол описывает метод измерения времени выживания в Brachionus коловраток. Важным шагом является синхронизация условий коловраток в течение нескольких поколений. Когда экспериментальные коловратки хорошо синхронизированы, типичный тип кривой выживаемости я наблюдается с очень небольшим количеством ранней смертности , как сообщалось в ряде предыдущих исследований 18,24,37,38. Поэтому стандартные отклонения времени выживания становятся меньше по сравнению с плохо синхронизированных коловраток, что приводит к высокой статистической мощности. Синхронизация также ожидается увеличение воспроизводимости измерений времени выживания - потому, что матери культивируют в оптимальных условиях, обычный протокол нивелирует возможные вредные эффекты материнских поколений. Если ранняя смертность по - прежнему наблюдается после тщательной синхронизации, рассмотреть вопрос об использовании недавно подготовленный культуральной среды, еще много кормления водорослей, или вновь созданной экспериментальной группе (т.е.исходить из протокола 3.1).

Ограничение этого протокола является то, что хорошо синхронизированные коловратки являются потенциально более чувствительны к регистру. Например, при скрининге химических веществ , которые увеличивают продолжительность жизни, некоторые химические вещества , экранированные этим протоколом может не обнаружить значительное влияние на продолжительность жизни в плохо синхронизированных коловраток (например, люди из диких и культивируемых партиями населения). Таким образом, результаты таких опытов следует интерпретировать с осторожностью.

Влияние возраста матери на время выживания потомства также сообщалось в других моделях беспозвоночных , включая плодовой мушки дрозофилы и нематоды Caenorhabditis Элеганс 39,40. Несмотря на то, что больше времени в этих долгоживущих моделей, процедура синхронизации в течение нескольких поколений были бы полезны для этих животных, чтобы уменьшить экспериментальные вариации в измерении времени выживания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы благодарны Джорджу Jarvis, Марта Бок и Бетт Hecox-Lea, морской биологической лаборатории, за помощь в съемках фильма.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288, (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662, (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500, (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452, (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136, (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101, (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649, (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77, (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19, (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13, (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67, (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25, (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2, (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253, (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662, (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68, (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68, (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667, (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8, (2), e57186 (2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6, (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, (5), 927-935 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics