Determinación de la supervivencia en el tiempo

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

Los rotíferos son microscópicos zooplancton cosmopolita (<1 mm) que constituyen el filo rotíferos 1. Tienen un plan simple cuerpo compuesto de aproximadamente 1.000 células somáticas, así como un aparato ciliar rueda-como característica llamada la corona, que se utiliza para la locomoción y la alimentación. La mayoría de los rotíferos pertenecen a clases monogononta o Bdelloidea, que contienen alrededor de 1.600 y 500 especies, respectivamente 2. Rotíferos monogononta generalmente tienen dos fases de reproducción sexual y asexual (partenogénesis cíclica), mientras que los rotíferos bdelloid reproducen por partenogénesis obligatoria 3. Por tanto, es posible obtener individuos de rotíferos genéticamente idénticos, lo que garantiza una alta reproducibilidad en los experimentos. Además, tienen otras ventajas como organismos modelo, como una vida útil corta, la facilidad de la cultura, la disponibilidad de datos de la secuencia genómica y transcriptómica 4-7, y una posición filogenética única distante de unarthropods 8 y nematodos. Por lo tanto, los rotíferos son prometedores modelos de invertebrados en ecológicos, toxicológicos y estudios de envejecimiento 9-12.

El tiempo de supervivencia en virtud de la exposición al estrés ambiental o de productos químicos es un parámetro medido con frecuencia en estos campos de investigación 13-19. Sin embargo, es necesario tener precaución cuando se mide el tiempo de supervivencia de los rotíferos porque es susceptible a las condiciones ambientales de sus madres. A saber, en el monogononta Manjavacas rotíferos Brachionus, la descendencia femenina de madres mayores tienen una vida más corta que las de las madres jóvenes; Sin embargo, la restricción calórica materna (CR) compensa parcialmente los efectos deletéreos de avanzada edad materna 20. En B. plicatilis, CR materna proporciona la longevidad descendencia, el tiempo de supervivencia durante mucho tiempo bajo la inanición, y alta resistencia al estrés oxidativo asociado con una mayor expresión de enzimas antioxidantes 21,22. El efecto de la edad maternaTambién se ha observado en los rotíferos bdelloid 23. Por lo tanto, las condiciones de rotíferos experimentales deben ser sincronizados cuidadosamente durante varias generaciones antes de las mediciones de tiempo de supervivencia.

Aquí proporcionamos un protocolo para la medición del tiempo de supervivencia en rotíferos Brachionus siguiente sincronización de condiciones de cultivo durante varias generaciones. Ayuno intermitente (SI), una variación de CR, donde rotíferos se alimentan periódicamente, se aplicó a revelar el efecto de la sincronización debido a los efectos conocidos de SI sobre la longevidad 22,24.

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Protocol

1. Preparación de Medios

Nota: Use la mitad diluida Brujewicz agua de mar artificial de la salinidad de 16,5 partes por mil (PSU). Otros aguas marinas artificiales también se utilizan con frecuencia para cultivo de rotíferos Brachionus 25,26.

  1. Añadir NaCl 454 mM, 26 mM MgCl 2, 27 mM MgSO4, se mM KCl 10, y 10 mM CaCl 2 a 4,5 L de agua destilada (volumen final será de 5 L). Como alternativa, utilizar agua de dilución desionizada en lugar de agua destilada. Añadir CaCl 2 después de disolver todas las otras sales.
  2. Preparar la solución de bicarbonato sódico 0,48 M 3 stock (concentración 200x). Añadir 25 ml de la misma a la solución anterior. La concentración final de NaHCO 3 es de 2,4 mM.
  3. Preparar la solución de NaBr 0,4 M de valores (concentración 500x). Añadir 10 ml de la misma a la solución anterior. La concentración final de NaBr es de 0,8 mM. Completar hasta 5 l con agua destilada.
  4. Se filtra la solución con un filtro de membrana de 0,45 micras.Diluir dos veces con agua estéril antes de su uso (v / v).
    Nota: Es posible hacer una concentración 2x ​​de Brujewicz agua de mar artificial como una solución madre.

2. generales Condiciones de cultivo

  1. laboratorio planteado Cultura o rotíferos-salvajes capturados en un vaso de precipitados de 100 ml estéril entre 20 y 30 ° C. Las temperaturas más altas dan lugar a esperanzas de vida más cortos y la reproducción acelerada. Usar 25 ° C para la comodidad de los experimentos. La densidad de rotíferos o el volumen de agua de mar artificial no es un gran problema aquí.
  2. Cultivo de especies de microalgas alimenticias en agua de mar artificial 11. Ver Snell et al. (2014) 11 para más detalles. Por lo general, utilizar Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 células / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 células / ml 25,29), y oculata Nannochloropsis (~ 7 x 10 6 células / ml 30,31). Dado que las algas dieta (especie, Condit culturaiones, composiciones bioquímicas) influye significativamente el tiempo de supervivencia de los rotíferos Brachionus, utilice la misma cantidad de microalga en todos los grupos experimentales.
  3. Mantener una población social de rotíferos en un cultivo por lotes mediante la alimentación y el cambio de vez en cuando los medios de comunicación (por ejemplo, alimentar cada 2 días e inocular cada semana). Muchos recién nacidos y adultos que llevan 2-3 huevos pueden ser observadas cuando rotíferos están en condiciones óptimas.
    Nota: Una forma alternativa de obtener rotíferos experimentales es para eclosionar huevos de descanso. Los rotíferos son considerados nacidos de huevos de descanso para estar bien sincronizados, y su esperanza de vida no es significativamente diferente de la de los rotíferos nacidos de huevos amictic 11. Sin embargo, los rotíferos de huevos de descanso de inicio de reproducción antes que los de los huevos amictic. Por lo tanto, es necesario tener precaución para las mediciones de sus características reproductivas.

3. La sincronización de rotíferos por Pre-cultura

  1. Seleccione una única rotíferos del stpoblación y cultura rebaño como se describe en 2.1 a 2.3 para establecer una sub-población que será utilizado para los experimentos. Típicamente cultura durante dos semanas.
  2. Recoger rotíferos grávidas de la subpoblación (por cobrar un doble número de personas que serán utilizados para el experimento). Cultura como una sola cohorte (densidad: ~ 50 individuos / ml) en una placa de cultivo de 6 pocillos como se describe en 2.1 a 2.3 en un fresco de comunicación bajo la alimentación ad libitum. El control de la densidad de población es importante porque el medio condicionado afecta a la fisiología reproductiva de los rotíferos Brachionus 32,33.
  3. Transferir los neonatos nacidos de primeros huevos de los adultos a los medios de cultivo recién preparada. Repita este procedimiento durante 2-3 generaciones.
  4. Utilice neonatos nacidos dentro de un período de tiempo determinado (por ejemplo, <3 hr) para medir el tiempo de supervivencia. Para evitar un posible sesgo en la selección de un solo individuo, aunque muy improbable, comprobar la reproducibilidad utilizando varios indesubpoblaciones colgantes.
    Nota: Como rotíferos por lo general sólo se reproducen asexualmente, en estas condiciones, asegurar que no los machos están presentes durante todo el experimento. Los machos son más pequeños que los recién nacidos y por lo general se mueven más rápido que las mujeres. Mictic hembras tienen diferentes esperanzas de vida de las mujeres amictic bajo ciertas condiciones 29.

4. Las mediciones de tiempo de supervivencia

  1. Coloque los recién nacidos en placas de plástico (típicamente de 24 ó 48 pocillos, conteniendo cada pocillo con 1 ml de agua de mar artificial).
  2. A intervalos de 24 horas, transferir los rotíferos a medios de cultivo recién preparadas o a intervalos de 12 horas si la temperatura más alta (30 ° C o superior). Registre el número de crías y si cada individuo está vivo o muerto. Registre el rotíferos como muertos cuando el movimiento de los cilios de la corona se haya detenido completamente.
    Nota: Los rotíferos a menudo se adhieren a las paredes laterales de los pocillos. pipeteo suave del agua ayuda a encontrarlos. Si no se encuentran o ar rotíferose dañado accidentalmente por el pipeteo, grabarlas como "censurado", no como "muerto".
  3. Retire los recién nacidos cuando rotíferos experimentales se están reproduciendo activamente. Los neonatos crecen rápidamente y es a veces difícil de distinguirlos de los rotíferos experimentales.

Análisis 5. Datos

  1. Crear la curva de supervivencia de Kaplan-Meier (Figuras 1 y 2) mediante el trazado de tasa de supervivencia acumulada en el eje Y y el tiempo en el eje X. Esta es la representación más común de los datos de supervivencia. Utilice la prueba no paramétrica de rangos logarítmicos (también llamada prueba de Mantel-Cox) para la comparación estadística del tiempo de supervivencia 34. La prueba de log-rank se incluye también en otros paquetes estadísticos estándar como JMP y R.
    Nota: No utilice t-test o análisis de la varianza (ANOVA) seguido de comparación múltiple de Student paramétrica porque la distribución normal es por lo general no se reunió con los datos de supervivencia 35. Además, estos methods no toman en cuenta los individuos censurados. Mann-Whitney U test se puede utilizar si no hay datos censurados.

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Representative Results


La Figura 1 muestra las curvas de supervivencia de las poblaciones representativas mal sincronizados (de un total de dos repeticiones). En este experimento, los rotíferos fueron alimentados todos los días, ya sea [ad libitum grupo (AL)] o cada dos días (si el grupo). La mediana de supervivencia fue de 13 y 18 días en el AL y si los grupos, respectivamente. Aunque es bien conocido que si se extiende la vida útil de la rotíferos, este experimento no pudo detectar una diferencia estadísticamente significativa entre la vida útil de la AL y si los grupos. Empíricamente, la insuficiencia de resultados de sincronización en la mortalidad temprana y disminuciones graduales en la tasa de supervivencia como se ha observado en este experimento. El daño a los rotíferos causados ​​por el tratamiento inadecuado o baja calidad del agua para la sub-población tiende a producir resultados similares.

Cuando las condiciones son óptimas rotíferos y bien sincronizada, la mortalidad temprana y apenas se observa accordingli rotíferos tienden a morir de una manera sincronizada durante la última fase del experimento (Figura 2). La mediana de supervivencia fue de 13 y 20 días en el AL y si los grupos, respectivamente. Aunque el número de animales se utilizaron que el experimento en la figura 1, la diferencia de vida útil entre estos grupos fue estadísticamente significativa. Se trata de los resultados representativos de más de cinco experimentos que se han publicado previamente 22.

Figura 1
Figura 1:. Las curvas de Kaplan-Meier para las personas mal sincronizados sometidos a ayuno intermitente (SI) El grupo AL fue alimentado ad libitum durante todo el experimento, mientras que el grupo SI fue alimentado cada dos días. N = 11 y N = 12 para el AL y si los grupos, respectivamente (N se refiere al número de individuo utilizada en el experimento). El experimento se PERFORmed a 25 ° C. No se detectó ninguna diferencia significativa en la vida cuando se utilizó la prueba de log-rank (p = 0,1207). Sin embargo, estos datos son difíciles de interpretar porque log-rank test no debe utilizarse para comparar dos curvas de supervivencia de cruce aunque la prueba es conocido por ser robusto 36. No hay métodos establecidos están actualmente disponibles para el cruce de las curvas de supervivencia con datos censurados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Las curvas de Kaplan-Meier para los individuos sometidos a sincronizados SI La cohorte de rotíferos, obtenido por pre-cultivo, se sometió a la misma si el horario (alimentados cada dos días). N = 6 y N = 8 para AL y si los grupos, respectivamente. El experimento se realizó a 25 ° C. Iniciar sesión-rank test, p = 0,0057. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo actual describe un método para medir el tiempo de supervivencia en rotíferos Brachionus. El paso crítico es la sincronización de las condiciones de rotíferos lo largo de varias generaciones. Cuando rotíferos experimentales están bien sincronizados, una curva de supervivencia de tipo I típico se observa con muy poca mortalidad temprana como se informó en varios estudios anteriores 18,24,37,38. Las desviaciones estándar de su tiempo de supervivencia, por lo tanto se hacen más pequeños en comparación con los rotíferos mal sincronizados, lo que resulta en alta potencia estadística. También se espera de sincronización para aumentar la reproducibilidad de las mediciones del tiempo de supervivencia - porque las madres se cultivan en condiciones óptimas, el protocolo actual compensa los posibles efectos perjudiciales de las generaciones maternas. Si la mortalidad temprana aún se observa después de la sincronización cuidadosa, considerar el uso de medios de cultivo recién preparado, otra gran cantidad de algas alimentación, o una cohorte experimental de reciente creación (es decir,empezar de protocolo 3.1).

Una limitación de este protocolo es que los rotíferos bien sincronizados son potencialmente más sensibles. Por ejemplo, tras la detección de sustancias químicas que se extienden la vida útil, algunos productos químicos seleccionados por este protocolo pueden no detectar efectos significativos en la vida útil de los rotíferos mal sincronizados (por ejemplo, individuos de las poblaciones silvestres y cultivadas por lote). Por lo tanto, los resultados de dichos experimentos deben ser interpretados con precaución.

El efecto de la edad materna en el tiempo de supervivencia descendencia también ha sido reportado en otros modelos de invertebrados, incluyendo la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el nematodo Caenorhabditis elegans 39,40. Aunque es más tiempo en estos modelos de larga vida, el procedimiento de sincronización a través de varias generaciones sería útil para estos animales para disminuir las variaciones experimentales en la medición del tiempo de supervivencia.

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Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a George Jarvis, Martha Bock, y Bette Hecox-Lea, Laboratorio de Biología Marina, por su ayuda en la filmación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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