Mesure de temps de survie dans

Biology

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Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

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Abstract

Introduction

Les rotifères sont microscopiques zooplancton cosmopolite (<1 mm) qui constituent le phylum rotifères 1. Ils ont un plan de corps simple composé d'environ 1000 cellules somatiques, ainsi qu'un appareil de ciliaire de roue comme caractéristique appelée la couronne, qui est utilisé pour la locomotion et l'alimentation. La plupart des rotifères appartiennent à des classes Monogononta ou Bdelloidea, qui contiennent environ 1.600 et 500 espèces, respectivement 2. Rotifères Monogonont ont généralement deux phases de la reproduction sexuée et asexuée (parthénogenèse cyclique), tandis que les rotifères bdelloides reproduisent par parthénogenèse obligatoire 3. Il est ainsi possible d'obtenir des individus de rotifères génétiquement identiques, ce qui assure une grande reproductibilité des expériences. En outre, ils ont plusieurs autres avantages comme organismes modèles, comme une courte durée de vie, la facilité de la culture, la disponibilité des données de séquences génomiques et transcriptomiques 4-7, et une position phylogénétique unique , distante d'unerthropods et nématodes 8. Les rotifères sont donc prometteurs modèles d'invertébrés dans écologiques, toxicologiques et études sur le vieillissement 9-12.

Le temps de survie en cas d' exposition au stress ou à des produits chimiques de l' environnement est un paramètre fréquemment mesurée dans ces domaines de recherche 13-19. Toutefois, la prudence est nécessaire lors de la mesure de la durée de survie des rotifères parce qu'il est sensible aux conditions environnementales de leurs mères. A savoir, dans le monogonont Manjavacas rotifères Brachionus, progéniture femelle de mères âgées ont une durée de vie plus courte que celles des jeunes mères; Cependant, la restriction calorique maternelle (CR) compense partiellement les effets délétères de 20 l' âge maternel avancé. Dans B. plicatilis, CR maternelle fournit la progéniture de la longévité, le temps de survie longtemps sous la famine, et de haute résistance au stress oxydatif associé à l' expression accrue des enzymes antioxydantes 21,22. L'effet de l'âge maternela également été observée dans les rotifères bdelloides 23. Par conséquent, les conditions de rotifères expérimentales doivent être soigneusement synchronisées sur plusieurs générations avant que les mesures de temps de survie.

Ici , nous fournissons un protocole pour la mesure du temps de survie en rotifères Brachionus suivant la synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations. Le jeûne intermittent (SI), une variation de CR où rotifères sont nourris régulièrement, a été appliquée pour révéler l'effet de la synchronisation en raison des effets bien connus du SI sur la longévité 22,24.

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Protocol

1. Préparation des milieux

Remarque: Utilisez la moitié diluée Brujewicz eau de mer artificielle de la salinité de 16,5 ppt (PSU). Autres seawaters artificiels sont aussi fréquemment utilisés pour la culture Brachionus rotifères 25,26.

  1. Ajouter du NaCl 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM de KCl et 10 mM de CaCl2 à 4,5 litres d' eau distillée (volume final sera de 5 L). Vous pouvez également utiliser l'eau de dilution désionisée au lieu de l'eau distillée. Ajouter CaCl 2 après dissolution de tous les autres sels.
  2. Préparer le M NaHCO3 solution stock 0,48 (concentration 200x). Ajouter 25 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaHCO 3 est de 2,4 mM.
  3. Préparer le M NaBr solution mère 0,4 (concentration 500x). Ajouter 10 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaBr est de 0,8 mM. Compléter à 5 litres avec de l'eau distillée.
  4. On filtre la solution avec un filtre à membrane de 0,45 um.Diluer deux fois avec de l'eau stérile avant utilisation (v / v).
    Note: Il est possible de faire une concentration de 2x de Brujewicz eau de mer artificielle comme une solution de stock.

2. Conditions générales Culture

  1. Culture laboratoire surélevé ou rotifères sauvages capturés dans un bécher de 100 ml stérile entre 20 et 30 ° C. Des températures plus élevées se traduisent par une durée de vie plus courte et la reproduction accélérée. Utiliser 25 ° C pour la commodité des expériences. La densité ou le volume d'eau de mer artificielle rotifères est pas un gros problème ici.
  2. Culture espèces de microalgues alimentaires dans l' eau de mer artificielle 11. Voir Snell et al. (2014) pour plus de détails 11. En règle générale, utilisez Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellules / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellules / ml 25,29), et Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellules / ml 30,31). Depuis le régime alimentaire des algues (espèces, culture conditions, des compositions biochimiques) influe de manière significative le temps de survie des rotifères Brachionus, utiliser le même lot de microalgue dans tous les groupes expérimentaux.
  3. Gardez une population stock de rotifères dans une culture discontinue en alimentant et en changeant les médias à l' occasion (par exemple, nourrir tous les 2 jours et ensemencer chaque semaine). Beaucoup de nouveau-nés et les adultes portant 2-3 œufs peuvent être observés lorsque les rotifères sont dans des conditions optimales.
    Remarque: Une autre façon d'obtenir des rotifères expérimentales est de faire éclore des oeufs de repos. Rotifères éclos à partir d' oeufs de repos sont considérés comme étant bien synchronisés et leur durée de vie ne soit pas sensiblement différente de celle de rotifères à partir d' œufs éclos amictiques 11. Cependant, rotifères à partir d'œufs de repos commencent reproduction plus tôt que ceux des œufs amictiques. Ainsi, la prudence est nécessaire pour les mesures de leurs traits de reproduction.

3. Synchronisation des rotifères par pré-culture

  1. Sélectionnez un seul rotifères de la stla population et la culture ock comme décrit dans 2.1-2.3 pour établir une sous-population qui sera utilisé pour des expériences. Typiquement culture pendant deux semaines.
  2. Collecter rotifères oeuvées de la sous-population (collecter un nombre double de personnes qui seront utilisés pour l'expérience). Culture comme une seule cohorte (densité: ~ 50 individus / ml) dans une plaque de culture à 6 puits tel que décrit dans 2,1-2,3 dans un nouveau média dans l' alimentation ad libitum. Contrôle de la densité de population est importante parce que le milieu conditionné affecte la physiologie de la reproduction des rotifères Brachionus 32,33.
  3. Transfert des nouveau-nés éclos à partir des premiers oeufs des adultes aux milieux de culture nouvellement préparé. Répétez cette procédure sur 2-3 générations.
  4. Utiliser le nouveau - né éclos dans un laps de temps donné (par exemple, <3 h) pour mesurer le temps de survie. Pour éviter un biais possible dans le choix du seul individu, bien que très improbable, vérifier la reproductibilité en utilisant plusieurs indépensous-populations pendantes.
    Remarque: Comme les rotifères se reproduisent généralement asexuée sous cette condition, assurez-vous pas de mâles sont présents tout au long de l'expérience. Les mâles sont plus petits que les nouveau-nés et se déplacent généralement plus vite que les femelles. Femelles Mictic ont des durées de vie différentes des femelles amictiques sous certaines conditions 29.

4. Les mesures de temps de survie

  1. La place dans les nouveau-nés des plaques en plastique (en général 24 ou 48 puits des plaques, avec chaque puits contenant 1 ml d'eau de mer artificielle).
  2. A intervalles de 24 heures, transférer les rotifères aux milieux de culture nouvellement préparés ou à des intervalles de 12 h si, à une température plus élevée (30 ° C ou au-dessus). Notez le nombre de descendants et si chaque individu est mort ou vivant. Notez le rotifères comme mort lorsque le mouvement des cils de la couronne est complètement arrêté.
    Nota: Les rotifères se fixent souvent sur les parois latérales des puits. pipetage doux de l'eau aide à les trouver. Si rotifères sont introuvables ou are accidentellement endommagé par le pipetage, les enregistrer comme «censuré», non pas comme «mort».
  3. Retirer les nouveau-nés lorsque rotifères expérimentales reproduisent activement. Les nouveau-nés grandissent rapidement et il est parfois difficile de les distinguer des rotifères expérimentales.

Analyse 5. Données

  1. Créer la survie courbe de Kaplan-Meier (figures 1 et 2) en traçant le taux de survie cumulatif sur l'axe et le temps Y sur l'axe des X. Ceci est la représentation la plus courante de données de survie. Utilisez le test log-rank non-paramétrique (aussi appelé test de Mantel-Cox) pour comparaison statistique du temps de survie 34. Le test du log-rank est également inclus dans d'autres progiciels statistiques standards tels que JMP et R.
    Note: Ne pas utiliser le test t ou une analyse de variance (ANOVA) suivie par comparaison multiple paramétrique de Student parce que la distribution normale est généralement pas satisfaite par les données de survie 35. En outre, ces méthods ne prennent pas les individus censurés en compte. test de Mann-Whitney U peut être utilisé s'il n'y a pas de données censurées.

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Representative Results


La figure 1 montre les courbes de survie représentatives des populations mal synchronisées (sur deux répétitions). Dans cette expérience, les rotifères étaient soit tous les jours nourris [groupe ad libitum (AL)] ou tous les autres jours (IF groupe). La médiane de survie était de 13 et de 18 jours dans l'AL et si des groupes, respectivement. Bien qu'il soit bien connu que IF prolonge la durée de vie du rotifères, cette expérience n'a pas réussi à détecter une différence statistiquement significative entre la durée de vie de l'AL et si les groupes. Empiriquement, les résultats de la synchronisation insuffisants dans la mortalité précoce et une baisse progressive du taux de survie observés dans cette expérience. Les dommages aux rotifères causés par un traitement inapproprié ou de faible qualité de l'eau pour la sous-population a tendance à donner des résultats similaires.

Lorsque les conditions de rotifères sont optimales et bien synchronisé, la mortalité précoce est à peine observée et accordingly rotifères ont tendance à mourir d'une manière synchronisée au cours de la dernière phase de l'expérience (figure 2). La médiane de survie était de 13 et 20 jours dans le AL et si des groupes, respectivement. Bien que moins d' animaux ont été utilisés à l'expérience de la figure 1, la différence de durée de vie entre ces groupes est statistiquement significative. Ce sont les résultats représentatifs de plus de cinq expériences qui ont été publiées précédemment 22.

Figure 1
Figure 1:. Les courbes de Kaplan-Meier pour les individus mal synchronisés soumis au jeûne intermittent (SI) Le groupe AL a été nourri ad libitum tout au long de l'expérience, alors que le groupe IF a été nourri tous les jours. N = 11 et N = 12 pour les groupes AL et IF, respectivement (N se réfère au nombre de particuliers utilisés dans l'expérience). L'expérience a été PERFORmed à 25 ° C. Aucune différence significative dans la durée de vie a été détectée lorsque le test du log-rank a été utilisé (P = 0,1207). Cependant, ces données sont difficiles à interpréter car log-rank test ne doit pas être utilisé pour comparer deux courbes de survie de passage bien que le test est connu pour être robuste 36. Aucune des méthodes établies sont actuellement disponibles pour le franchissement des courbes de survie avec des données censurées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Les courbes de Kaplan-Meier pour les personnes synchronisées soumises à IF La cohorte de rotifères, obtenu par pré-culture, a été soumis à la même IF horaire (alimenté tous les jours). N = 6 et N = 8 pour AL et si des groupes, respectivement. L'expérience a été réalisée à 25 ° C. Bûche-test de rang, P = 0,0057. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole actuel décrit un procédé pour mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus. L'étape critique est la synchronisation des conditions de rotifères sur plusieurs générations. Lorsque rotifères expérimentaux sont bien synchronisés, une courbe I de survie de type typique est observé avec très peu de mortalité précoce comme rapporté dans plusieurs études antérieures 18,24,37,38. Les écarts-types de leur temps de survie deviennent donc plus petit par rapport à rotifères synchronisés mal, ce qui entraîne une puissance statistique élevée. est également prévu de synchronisation pour augmenter la reproductibilité des mesures de temps de survie - parce que les mères sont cultivées dans des conditions optimales, le protocole actuel compense les effets délétères possibles des générations maternelles. Si la mortalité précoce est encore observée après la synchronisation attention, pensez à utiliser des milieux de culture nouvellement préparé, un autre lot d'algues alimentation, ou une cohorte expérimentale nouvellement créée (ie,commencer par le protocole 3.1).

Une limitation de ce protocole est que les rotifères bien synchronisés sont potentiellement plus sensibles. Par exemple, sur le dépistage de produits chimiques qui prolongent la durée de vie, certains produits chimiques projetés par ce protocole peuvent ne pas détecter des effets significatifs sur la durée de vie des rotifères mal synchronisés (par exemple, les individus de populations sauvages et cultivées par lots). Ainsi, les résultats de ces expériences doivent être interprétées avec prudence.

L'effet de l' âge maternel sur le temps de survie de la descendance a également été rapporté dans d' autres modèles d' invertébrés , y compris la mouche Drosophila melanogaster et le nématode Caenorhabditis elegans 39,40. Bien qu'il soit plus de temps dans ces modèles à long terme, la procédure de synchronisation sur plusieurs générations serait utile pour ces animaux pour diminuer les variations expérimentales de la mesure du temps de survie.

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Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à George Jarvis, Martha Bock, et Bette Hecox-Lea, Laboratoire de biologie marine, pour leur aide dans le tournage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

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References

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