Meting van overlevingstijd bij

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Raderdiertjes zijn microscopisch kleine kosmopolitische zoöplankton (<1 mm) die de stam Rotifera 1 vormen. Ze hebben een eenvoudige bouwplan bestaat uit ongeveer 1000 somatische cellen en een karakteristieke wielvormige ciliaire inrichting genoemd corona, die wordt gebruikt voor vervoer en voeding. De meeste raderdiertjes behoren tot klassen monogononta of bdelloidea, die ongeveer 1.600 en 500 soorten, respectievelijk 2 bevatten. Monogononta raderdiertjes hebben over het algemeen zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting fasen (cyclische parthenogenese), terwijl bdelloid raderdiertjes reproduceren door verplichte parthenogenese 3. Het is dus mogelijk om genetisch identieke rotifeer individuen, die een hoge reproduceerbaarheid zorg draagt ​​voor experimenten te verkrijgen. Bovendien hebben ze een aantal andere voordelen modelorganismen, zoals een korte levensduur, gemakkelijk cultuur, beschikbaarheid van genomische en transcriptoom sequentiegegevens 4-7, en een unieke fylogenetische positie op afstand van eenrthropods en nematoden 8. Raderdiertjes zijn dus veelbelovend ongewervelde modellen in ecologische, toxicologische en veroudering studies 9-12.

Het voortbestaan ​​tijd onder blootstelling aan omgevingsfactoren stress of chemicaliën is een vaak gemeten parameter in deze onderzoeksgebieden 13-19. Toch is voorzichtigheid geboden bij het meten van de overlevingstijd van raderdiertjes, want het is gevoelig voor milieu-omstandigheden van hun moeders. Namelijk, in de monogononta raderdiertje Brachionus manjavacas, vrouwelijke nakomelingen van de leeftijd van de moeders hebben een kortere levensduur dan die van de jonge moeders; echter maternale calorie restrictie (CR) gedeeltelijk compenseert de nadelige effecten van maternale leeftijd 20. In B. plicatilis, moeder CR biedt nakomelingen levensduur, lange overlevingstijd onder honger, en een hoge oxidatieve stress weerstand geassocieerd met een verhoogde expressie van antioxidant enzymen 21,22. De leeftijd van de moeder effectis ook waargenomen in bdelloid raderdiertjes 23. Daarom moeten de voorwaarden van experimentele raderdiertjes zorgvuldig gesynchroniseerd over verschillende generaties voor metingen van overlevingstijd.

Hier bieden we een protocol voor het meten van overlevingstijd bij Brachionus raderdiertjes na synchronisatie van kweekomstandigheden over meerdere generaties. Intermitterende vasten (IF), een variant van CR waarbij raderdiertjes periodiek worden toegevoerd, werd toegepast om het effect van synchronisatie onthullen door de bekende effecten van IF op levensduur 22,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media

Opmerking: Gebruik half-verdund Brujewicz kunstmatig zeewater van het zoutgehalte 16,5 ppt (PSU). Andere kunstmatige zeewater wordt ook vaak gebruikt om de cultuur Brachionus raderdiertjes 25,26.

  1. Voeg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl en 10 mM CaCl 2-4,5 L gedestilleerd water (uiteindelijk volume 5 L zijn). U kunt ook gebruik maken van gedemineraliseerd water verdunnen in plaats van gedestilleerd water. Voeg na oplossing CaCl2 alle andere zouten.
  2. Bereid de 0,48 M NaHCO3 voorraad-oplossing (200x concentratie). Voeg 25 ml aan de bovenstaande oplossing. De eindconcentratie van NaHCO3 is 2,4 mM.
  3. Bereid de 0,4 M NaBr voorraad-oplossing (500x concentratie). Voeg 10 ml aan de bovenstaande oplossing. De eindconcentratie van 0,8 mM NaBr is. Vul aan tot 5 L met gedestilleerd water.
  4. Filtreer de oplossing door een 0,45 urn membraanfilter.Verdunnen twee keer met steriel water voor gebruik (v / v).
    Opmerking: Het is mogelijk een 2x concentratie van Brujewicz kunstmatig zeewater zo een voorraadoplossing.

2. Algemene Voorwaarden Cultuur

  1. Cultuur laboratoriumschaal verhoogd of wild gevangen raderdiertjes in een steriele 100 ml bekerglas tussen 20 en 30 ° C. Hogere temperaturen resulteren in een kortere levensduur en versnelde weergave. Gebruik 25 ° C voor het gemak van experimenten. De rotifer dichtheid of het volume van kunstmatig zeewater is niet een groot probleem hier.
  2. Cultuur dieet microalgen soorten in kunstmatig zeewater 11. Zie Snell et al. (2014) voor meer informatie 11. Gewoonlijk gebruiken Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellen / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellen / ml 25,29), en Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellen / ml 30,31). Sinds dieet algen (species, cultuur Conditionen, biochemische composities) beïnvloedt significant overlevingstijd van Brachionus raderdiertjes, maken gebruik van dezelfde veel microalg in alle experimentele groepen.
  3. Houd een voorraad populatie van rotiferen in een batch cultuur door het voeren en het veranderen van de media af en toe (bijvoorbeeld voeden om de 2 dagen en te enten per week). Veel pasgeborenen en volwassenen dragen 2-3 eieren kunnen worden waargenomen wanneer raderdiertjes in optimale omstandigheden.
    Opmerking: Een alternatieve manier om experimentele raderdiertjes te verkrijgen is om rust eieren uitbroeden. Raderdiertjes uitgebroed uit rusteieren worden geacht goed te synchroniseren, waardoor de levensduur ervan is niet significant verschillend van die van raderdiertjes uitgebroed uit eieren amictic 11. Echter, raderdiertjes van rusteieren start reproductie eerder dan die uit amictic eieren. Zo, is voorzichtigheid geboden voor het meten van hun reproductieve eigenschappen.

3. Synchronisatie van Raderdiertjes door Pre-culture

  1. Selecteer één rotifer van de stock bevolking en cultuur zoals beschreven in 2.1-2.3 een subpopulatie die wordt gebruikt voor experimenten vastgesteld. Typisch kweek gedurende twee weken.
  2. Collect-ei-dragende raderdiertjes uit de sub-populatie (het verzamelen van een dubbele aantal mensen dat zal worden gebruikt voor het experiment). Cultuur ze als één cohort (dichtheid: ~ 50 personen / ml) in een 6-well cultuur plaat zoals beschreven in 2.1-2.3 in een vers medium onder ad libitum voeden. Beheersing van de bevolkingsdichtheid is belangrijk omdat het geconditioneerde medium van invloed op de reproductieve fysiologie van Brachionus raderdiertjes 32,33.
  3. Transfer pasgeborenen uitgebroed uit eerste eieren van de volwassenen om nieuw bereide voedingsbodems. Herhaal deze procedure op 2-3 generaties.
  4. Gebruik pasgeborenen uitgebroed binnen een bepaalde periode (bijvoorbeeld <3 uur) voor het meten van de overlevingstijd. Om een ​​mogelijke vertekening in de selectie van het individu te vermijden, hoewel zeer onwaarschijnlijk, kijk reproduceerbaarheid met behulp van verschillende indehangende subpopulaties.
    Opmerking: Zoals raderdiertjes meestal alleen reproduceren ongeslachtelijk onder deze voorwaarde, zodat er geen mannetjes gedurende het experiment aanwezig zijn. Mannetjes zijn kleiner dan neonaten en typisch sneller bewegen dan vrouwen. Mictic vrouwtjes hebben verschillende levensduur van amictic vrouwen onder bepaalde voorwaarden 29.

4. Metingen van Survival Time

  1. Plaats neonaten in kunststofplaten (kenmerkend 24- of 48-putjes, waarbij elk putje 1 ml kunstmatig zeewater).
  2. Op 24 uur intervallen overdragen raderdiertjes om nieuw bereide kweekmedia of 12 uur intervallen of bij hogere temperatuur (30 ° C of hoger). Noteer het aantal nakomelingen en of ieder individu is dood of levend. Noteer de rotifer als dood toen cilia beweging van de corona volledig tot stilstand is gekomen.
    Opmerking: Raderdiertjes hechten vaak de zijwanden van de putjes. Gentle pipetteren van het water helpt om ze te vinden. Als raderdiertjes niet worden gevonden of are ongeluk beschadigd door het pipetteren, hen op te nemen als "gecensureerd", niet als "dood".
  3. Verwijder pasgeborenen wanneer experimentele raderdiertjes actief reproduceren. Pasgeborenen groeien snel en het is soms moeilijk om ze te onderscheiden van experimenteel raderdiertjes.

5. Data Analysis

  1. Maak de Kaplan-Meier survival curve (figuren 1 en 2) door het uitzetten cumulatieve overleving op de Y-as en de tijd op de X-as. Dit is de meest voorkomende representatie van overlevingsdata. Gebruik de niet-parametrische log-rank test (ook wel Mantel-Cox test) voor statistische vergelijking van de overlevingstijd 34. De log-rank test wordt ook in andere standaard statistische pakketten zoals JMP en R.
    Opmerking: t-toets of variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door meervoudige vergelijkingstest parametrische gebruiken omdat normale distributie gewoonlijk niet voldoet overlevingsdata 35. Bovendien zijn deze methods niet censureerde individuen rekening te houden. Mann-Whitney U test kan worden gebruikt als er geen gecensureerde data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figuur 1 toont vertegenwoordiger survival curves van slecht gesynchroniseerde bevolking (van twee herhalingen). In dit experiment, raderdiertjes waren ofwel dagelijks gevoed [ad libitum (AL) groep] of om de dag (IF groep). De mediane overleving was 13 en 18 dagen in de AL en IF groepen, respectievelijk. Hoewel het bekend is dat IF verlengt de levensduur van de rotifer dit experiment niet een statistisch significant verschil tussen de levensduur van de AL en IF groepen detecteren. Empirisch onvoldoende synchronisatie resultaten in de vroege sterfte en geleidelijke daling van de overlevingskansen zoals waargenomen in dit experiment. Schade aan raderdiertjes veroorzaakt door ongepaste behandeling of lage kwaliteit van het water voor de sub-bevolking de neiging om soortgelijke resultaten op.

Wanneer rotifer omstandigheden optimaal zijn en goed gesynchroniseerd, is vroege mortaliteit nauwelijks waargenomen en accordingly raderdiertjes neiging op een gesynchroniseerde manier om te sterven tijdens de latere fase van het experiment (figuur 2). De mediane overleving was 13 en 20 dagen in de AL en IF groepen, respectievelijk. Hoewel minder dieren werden dan experiment in figuur 1, het verschil in levensduur tussen deze groepen was statistisch significant. Dit is de representatieve resultaten uit meer dan vijf experimenten die eerder 22 gepubliceerd.

Figuur 1
Figuur 1:. Kaplan-Meier curves voor slecht gesynchroniseerde personen onderworpen aan intermitterende vasten (IF) De AL-groep werd ad libitum gedurende het experiment, terwijl de IF groep om de andere dag werd gevoed. N = 11 en N = 12 voor de AL en IF groepen, respectievelijk (N verwijst naar het aantal individuele gebruikt in het experiment). Het experiment werd Performed bij 25 ° C. Geen significant verschil in levensduur werd ontdekt toen log-rank test werd gebruikt (p = 0,1207). Echter, deze gegevens moeilijk te interpreteren omdat logranktoets niet worden gebruikt om twee elkaar kruisende overlevingscurves vergelijken hoewel de test robuust is bekend 36 zijn. Geen gevestigde methoden beschikbaar voor het oversteken van de overleving bochten met gecensureerde data. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Kaplan-Meier curves voor gesynchroniseerde individuen blootgesteld aan IF The rotifeer cohort, verkregen door voorkweek was onderworpen aan dezelfde IF programma (gevoerd om de dag). N = 6 en N = 8 voor AL en IF groepen, respectievelijk. Het experiment werd uitgevoerd bij 25 ° C. logrank test, p = 0,0057. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige protocol beschrijft een werkwijze voor het meten van de overlevingstijd bij raderdiertjes Brachionus. De kritische stap is de synchronisatie van rotifer voorwaarden over meerdere generaties. Wanneer experimentele raderdiertjes goed worden gesynchroniseerd, is een typisch type I survival curve waargenomen met zeer weinig vroege mortaliteit zoals gerapporteerd in een aantal eerdere studies 18,24,37,38. Standaarddeviatie van hun overlevingstijd dus kleiner geworden in vergelijking met slecht gesynchroniseerde raderdiertjes, wat resulteert in hoge statistische power. Synchronisatie wordt ook verwacht dat de reproduceerbaarheid van de overleving tijd metingen te verhogen - omdat moeders zijn gekweekt onder optimale omstandigheden, het huidige protocol compenseert mogelijke schadelijke effecten van maternale generaties. Als vroegtijdige sterfte nog steeds wordt waargenomen na zorgvuldige synchronisatie, kunt u overwegen nieuw bereide voedingsbodems, een andere partij van het voeden van algen, of een nieuw opgerichte experimentele cohort (dat wil zeggen,uitgaan van protocol 3,1).

Een beperking van dit protocol is dat het goed gesynchroniseerde raderdiertjes potentieel overgevoelig. Bijvoorbeeld, bij het ​​screenen van chemische stoffen die de levensduur te verlengen, sommige chemicaliën gescreend door dit protocol mogelijk te maken met significante effecten op te sporen op de levensduur van slecht gesynchroniseerde raderdiertjes (bijvoorbeeld personen uit wilde en batch-gekweekte populaties). Zo moeten de resultaten van dergelijke experimenten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

Het effect van de ouderdom van de moeder op nakomelingen overlevingstijd is ook beschreven in andere ongewervelde modellen zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster en de nematode Caenorhabditis elegans 39,40. Hoewel het tijdrovende deze langlevende modellen, zou de synchronisatie procedure gedurende verschillende generaties nuttig dat deze dieren experimentele schommelingen afname gemeten overlevingstijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor George Jarvis, Martha Bock, en Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, voor hun hulp bij het filmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288, (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662, (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500, (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452, (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136, (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101, (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649, (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77, (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19, (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13, (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67, (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25, (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2, (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253, (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662, (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68, (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68, (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667, (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8, (2), e57186 (2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6, (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, (5), 927-935 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics