Måling af overlevelse Tid i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Hjuldyr er mikroskopiske kosmopolitiske dyreplankton (<1 mm), der udgør den phylum Rotifera en. De har en simpel krop plan sammensat af cirka 1.000 somatiske celler såvel som en karakteristisk hjul-lignende ciliære apparat kaldet koronaen, som anvendes til brug og fodring. De fleste hjuldyr tilhører klasserne Monogononta eller Bdelloidea, som indeholder omkring 1.600 og 500 arter, henholdsvis 2. Monogonont hjuldyr har generelt både seksuelle og aseksuelle reproduktive faser (cyklisk partenogenese), mens bdelloid hjuldyr reproducere ved obligatorisk partenogenese 3. Det er således muligt at opnå genetisk identiske hjuldyr individer, hvilket sikrer høj reproducerbarhed i forsøg. Derudover har de flere andre fordele som modelorganismer, såsom en kort levetid, let kultur, tilgængelighed af genomiske og transkriptomisk sekvensdata 4-7, og en unik fylogenetiske position fjernt fra enrthropods og nematoder 8. Hjuldyr er derfor lovende hvirvelløse modeller i økologiske, toksikologiske og aldrende undersøgelser 9-12.

Overlevelsestiden under udsættelse for stress eller kemikalier er en ofte målt parameter i disse forskningsområder 13-19. Imidlertid er forsigtighed nødvendig, når måling overlevelsestiden af ​​hjuldyr, fordi det er modtagelig for miljøforhold deres mødre. Nemlig, i monogonont hjuldyr Brachionus manjavacas, kvindelige afkom fra alderen mødre har en kortere levetid end dem fra unge mødre; dog maternal kalorieindhold begrænsning (CR) delvis udligner de skadelige virkninger af fremskreden moderens alder 20. I B. plicatilis, maternal CR giver afkom levetid, lang overlevelsestid under sult, og høj oxidativt stress modstand forbundet med øget udtryk af antioxidant enzymer 21,22. Den moderens alder effekter også blevet observeret i bdelloid hjuldyr 23. Derfor bør betingelserne for eksperimentelle hjuldyr nøje synkroniseret over flere generationer, før målinger af overlevelsestid.

Her giver vi en protokol til måling af overlevelsestid i Brachionus hjuldyr efter synkronisering af dyrkningsbetingelser over flere generationer. Intermitterende fastende (IF), en variation af CR hvor hjuldyr fodres regelmæssigt, blev påført afsløre virkningen af synkronisering som følge af de velkendte virkninger af IF på levetiden 22,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af Media

Bemærk: Brug halvt fortyndet Brujewicz kunstigt havvand af saltholdigheden 16,5 ppt (PSU). Andre kunstige havvande også ofte brugt til kultur Brachionus hjuldyr 25,26.

  1. Tilføj 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCI og 10 mM CaCl2 til 4,5 I destilleret vand (slutvolumen vil være 5 I). Alternativt kan du bruge demineraliseret vand til fortynding i stedet for destilleret vand. Tilføj CaCl2 efter opløsning alle andre salte.
  2. Forbered 0,48 M NaHCO3 stamopløsning (200x koncentration). Tilsættes 25 ml det til den ovennævnte opløsning. Slutkoncentrationen af NaHCO3 er 2,4 mM.
  3. Forbered 0,4 M NaBr stamopløsning (500x koncentration). Der tilsættes 10 ml det til den ovennævnte opløsning. Slutkoncentrationen af ​​NaBr er 0,8 mM. Der fyldes op til 5 liter med destilleret vand.
  4. Opløsningen filtreres med et 0,45 um membranfilter.Fortynde det to gange med sterilt vand inden brug (v / v).
    Bemærk: Det er muligt at lave en 2x koncentration af Brujewicz kunstigt havvand som en stamopløsning.

2. Generelle kultur betingelser

  1. Kultur laboratorium-hævet eller vilde-fanget hjuldyr i et sterilt 100 ml bægerglas mellem 20 og 30 ° C. Højere temperaturer resulterer i kortere livslængde og accelereret reproduktion. Brug 25 ° C til hjælp for eksperimenter. Den hjuldyr tæthed eller mængden af ​​kunstigt havvand er ikke et stort problem her.
  2. Kultur kosten mikroalger arter i kunstigt havvand 11. Se Snell et al. (2014) for detaljer 11. Typisk bruge Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 celler / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 celler / ml 25,29) og Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 celler / ml 30,31). Da kost alger (arter, kultur conditioner, biokemiske kompositioner) påvirker signifikant overlevelsestid på Brachionus hjuldyr, bruge den samme masse makroalgen i alle forsøgsgrupper.
  3. Hold en bestand population af hjuldyr i en batch-kultur ved at fodre og skiftende medier lejlighedsvis (fx foder hver 2 dage og pode hver uge). Mange nyfødte og voksne, der bærer 2-3 æg kan observeres, når hjuldyr er i optimale betingelser.
    Bemærk: En alternativ måde at opnå eksperimentelle hjuldyr er at klække hvilende æg. Hjuldyr udklækket af hvilende æg anses for at være godt synkroniseret, og deres levetid er ikke signifikant forskellig fra den af hjuldyr udklækket af amictic æg 11. Men hjuldyr fra hvilende æg starter reproduktion tidligere end dem fra amictic æg. Således er der behov for forsigtighed for målinger af deres reproduktive træk.

3. Synkronisering af hjuldyr ved Pre-kultur

  1. Vælg en enkelt hjuldyr fra stock befolkning og kultur som beskrevet i 2,1-2,3 at etablere en sub-population, der vil blive anvendt til eksperimenter. Typisk kultur i to uger.
  2. Saml æg-bærende hjuldyr fra delpopulation (indsamle en dobbelt antal individer, der vil blive brugt til forsøg). Kultur dem som et enkelt kohorte (densitet: ~ 50 individer / ml) i en 6-brønds kulturplade som beskrevet i 2,1-2,3 i et frisk medium under ad libitum fodring. Styring befolkningstæthed er vigtigt, fordi det konditionerede medium påvirker reproduktive fysiologi Brachionus hjuldyr 32,33.
  3. Overfør nyfødte udklækket fra voksnes første æg til nyligt forberedt kulturmedier. Gentag denne procedure i løbet af 2-3 generationer.
  4. Brug nyfødte udklækket inden for en vis tidsperiode (f.eks <3 timer) til måling af overlevelsestiden. For at undgå en mulig skævhed i udvælgelsen enkelt individ, selv om meget usandsynligt, check reproducerbarhed ved hjælp flere uafhængige delpopulationer.
    Bemærk: Som hjuldyr normalt reproducere kun ukønnet under denne betingelse, sikre, at ingen mænd er til stede under hele forsøget. Hannerne er mindre end nyfødte og bevæge sig typisk hurtigere end hunnerne. Mictic hunner har forskellige levetider fra amictic hunner under visse betingelser 29.

4. Målinger af Survival Time

  1. Place nyfødte i plastplader (typisk 24- eller 48-brønds plader, med hver brønd indeholdende 1 ml kunstigt havvand).
  2. Ved 24 timers intervaller, overføre hjuldyr til nyligt fremstillede dyrkningsmedier eller ved 12 timers intervaller, hvis ved højere temperatur (30 ° C eller derover). Notér antal afkom, og om hver enkelt er død eller levende. Optag hjuldyr som døde, da cilier bevægelse af koronaen er standset helt.
    Bemærk: hjuldyr ofte tillægger sidevægge brøndene. Forsigtig pipettering af vand hjælper med at finde dem. Hvis hjuldyr ikke fundet eller are uheld beskadiget af pipettering, indspille dem som "censureret", ikke som "død".
  3. Fjern nyfødte når eksperimentelle hjuldyr aktivt gengive. Nyfødte vokse hurtigt, og det er nogle gange svært at skelne dem fra eksperimentelle hjuldyr.

5. Data Analysis

  1. Opret Kaplan-Meier overlevelse kurve (figur 1 og 2) ved at afbilde den kumulative overlevelsesrate på Y-aksen og tid på X-aksen. Dette er den mest almindelige repræsentation af overlevelsesdata. Brug ikke-parametriske log-rank test (også kaldet Mantel-Cox test) til statistisk sammenligning af overlevelsestid 34. Log-rank test er også inkluderet i andre standard statistiske pakker såsom JMP og R.
    Bemærk: Brug ikke t-test eller variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af parametrisk multipel sammenligning fordi normalfordeling er normalt ikke dækkes af overlevelsesdata 35. Også disse methods tager ikke censureret individer i betragtning. Mann-Whitney U test kan anvendes, hvis der ikke er nogen censureret data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figur 1 viser repræsentative overlevelseskurverne for dårligt synkroniserede populationer (ud af to gentagelser). I dette forsøg hjuldyr blev enten fodret hverdag [ad libitum (AL) gruppe] eller hver anden dag (IF gruppe). Median overlevelse var 13 og 18 dage i AL og IF grupper, hhv. Selv om det er velkendt, at IF forlænger levetiden for hjuldyr, dette eksperiment ikke påvise en statistisk signifikant forskel mellem livslængde i AL og IF grupper. Empirisk utilstrækkelige synkronisering resulterer i tidlig dødelighed og gradvise fald i overlevelsen som observeret i dette forsøg. Skader på hjuldyr forårsaget af uhensigtsmæssig behandling eller dårlig vandkvalitet for delpopulationen tendens til at give lignende resultater.

Når hjuldyr er optimale og godt synkroniseret, er tidlig dødelighed næppe observeret og accordingly hjuldyr tendens til at dø på en synkroniseret måde under den senere fase af forsøget (figur 2). Median overlevelse var 13 og 20 dage i AL og IF grupper, hhv. Selvom færre dyr blev anvendt end eksperimentet i figur 1, er forskellen i levetid mellem disse grupper var statistisk signifikant. Dette er de repræsentative resultater fra mere end fem eksperimenter, der tidligere 22 er blevet offentliggjort.

figur 1
Figur 1:. Kaplan-Meier-kurver for dårligt synkroniserede individer udsat for intermitterende fastende (IF) AL gruppe blev fodret ad libitum under hele forsøget, mens IF gruppe blev fodret hver anden dag. N = 11 og N = 12 til AL og IF grupper, henholdsvis (N betegner antallet af individuelle anvendt i forsøget). Eksperimentet blev forbedre præstationenwith ved 25 ° C. Ingen signifikant forskel i levetid blev påvist ved log-rank testen blev anvendt (P = 0,1207). Men disse data er vanskelig at fortolke på grund log-rank test ikke bør anvendes til at sammenligne to passage overlevelseskurverne skønt testen vides at være robust 36. Ingen etablerede metoder er i øjeblikket tilgængelige til passage overlevelseskurverne med censurerede data. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Kaplan-Meier-kurver for synkroniserede individer udsat for, hvis hjuldyr kohorte, opnås ved præ-kultur blev udsat for den samme, hvis tidsplanen (fodret hver anden dag). N = 6 og N = 8 for AL og IF grupper hhv. Eksperimentet blev udført ved 25 ° C. log-rank test, P = 0,0057. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol beskriver en fremgangsmåde til måling af overlevelsestid i Brachionus hjuldyr. Det kritiske skridt er synkroniseringen af ​​hjuldyr forhold over flere generationer. Når eksperimentelle hjuldyr er godt synkroniseret, er en typisk type I overlevelse kurve observeret med meget lidt tidligt dødelighed som rapporteret i flere tidligere undersøgelser 18,24,37,38. Standardafvigelser af deres overlevelsestid således blevet mindre i forhold til dårligt synkroniserede hjuldyr, hvilket resulterer i høj statistisk styrke. forventes også Synkronisering at øge reproducerbarheden af ​​overlevelse tidsmålinger - fordi mødre dyrkes under optimale betingelser, den nuværende protokol udligner mulige skadelige virkninger af maternelle generationer. Hvis tidlig dødelighed stadig observeres efter nøje synkronisering, overveje at bruge frisklavet kulturmedier, andet parti fodre alger, eller et nyetableret eksperimentel kohorte (dvs.starte fra protokol 3.1).

En begrænsning af denne protokol er, at de godt synkroniserede hjuldyr er potentielt over-følsomme. For eksempel, når screening af kemikalier, der udvider levetid, kan nogle kemikalier screenes af denne protokol ikke opdager væsentlig indvirkning på livslængde af dårligt synkroniserede hjuldyr (f.eks individer fra vilde og batch-dyrket populationer). Således bør resultaterne af disse forsøg fortolkes med forsigtighed.

Effekten af moderens alder på afkom overlevelsestid er også blevet rapporteret i andre hvirvelløse modeller, herunder frugt flyve Drosophila melanogaster og nematode Caenorhabditis elegans 39,40. Selvom det er mere tidskrævende i disse langlivede modeller, vil synkroniseringen procedure over flere generationer være nyttige for disse dyr at falde eksperimentelle variationer i målingen af ​​overlevelsestiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for George Jarvis, Martha Bock, og Bette Hecox-Lea, Marinbiologisk Laboratorium, for deres hjælp i optagelserne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288, (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662, (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500, (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452, (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136, (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101, (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649, (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77, (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19, (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13, (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67, (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25, (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2, (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253, (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662, (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68, (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68, (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667, (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8, (2), e57186 (2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6, (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, (5), 927-935 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics