שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Juusola, M., Dau, A., Zheng, L., Rien, D. Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo. J. Vis. Exp. (112), e54142, doi:10.3791/54142 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

זבוב הפרות (תסיסנית) העין מורכבת הוא מערכת מודל מצוינת לחקור את הארגון הפונקציונלי של מערכי קולטי אור ואת interneuron לדגימת תמונה עצבית ועיבוד, ועל חזון חיה. המערכת כוללת בתרשים החיווט השלם ביותר 1,2 והוא חביב כלפי מניפולציות גנטיות וניטור פעילות עצבית מדויק (של אות לרעש גבוה יחס ברזולוציה הזמן) 3-10.

עין תסיסנית היא מודולרית, המכיל ~ 750 מבנים רגילים לכאורה הכתיר עדשה נקראים האומטידיה, שביחד מספקים את לטוס שדה ראייה פנורמי המכסה כמעט לכל כיוונים סביב הראש שלה. המידע הראשוני של עין יחידות במדגם הם קולטני אור rhabdomeric שלה 7,8,11. כל אומטידיום מכיל שמונה תאי קולטי אור (R1-R8), אשר חולקים את אותה העדשה פן אבל מיושרים שבעה לכיוונים שונים. בעוד קולטני האור החיצוני ar R1-R6הדואר ביותר רגיש לאור כחול-ירוק, רגישויות הספקטרלית של התאים הפנימיים R7 ו R8, אשר שקרו על גב אחד את השני מצביע לאותו הכיוון, תערוכת שלוש תת-סוגים: חיוורות, צהוב הגבה אזור שולים (DRA) 12 15.

איור 1
איור 1. ארגון פונקציונלי של תסיסנית עיניים. (א) שני הגרעינים הראשונים אופטיים, הרשתית lamina, מודגשים באפור בתוך העין לטוס. R1-R6 רשתית photoreceptors ותאי monopolar הגדולים lamina (LMCs: L1-L3) נגיש בקלות in vivo להקלטות microelectrode חד קונבנציונליות. האלקטרודה סכמטי מדגיש את הנתיב הרגיל להקליט R1-R6 ברשתית. נתיב אחד להקליט LMCs ב lamina הוא להסיט את האלקטרודה במקביל לשמאל. (ב) Lamina הוא מטריצה ​​של איבר retinotopicallyמחסניות ized, שכל אחד מהם הוא ארוז עם נוירונים שמעבד מידע מאזור קטן ספציפי את המרחב החזותי. בשל סופרפוזיציה עצבי, שש קולטניות אור מן האומטידיה שכנות שונה לשלוח האקסונים שלהם (R1-R6) למחסנית lamina אותו, ויוצר סינפסות פלט histaminergic כדי L1-L3 ו תא amacrine (Am). (ג) הפצת המידע העצבי בין מסופי האקסון R1-R6 ואת interneurons חזותית (כולל L4, L5, Lawf, C2, C3 ו- T1), בתוך מחסנית lamina היא מורכבת. (ד) אקסונים קולטי האור R1-R6 לקבל פידבקים הסינפטי מתאי monopolar L2 ו L4. (ב) ו- (ג) שונה מן ריברה-alba ואח 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עין תסיסנית היא מן הסוג סופרפוזיציה העצבי 16. משמעות הדבר היא tכובע האותות העצביים של שמונה קולטני אור שייך שבע שכנת האומטידיה, שנראה באותה הנקודה בחלל, הם אספו יחד מחסנית עצבית אחד בשני neuropils הבא: את lamina ומדולה. בעוד שש קולטני האור החיצוני פרויקט R1-R6 מסופי האקסון שלהם לעמודות עצביות lamina (איור 1), תאי R7 ו R8 לעקוף שכבה זו וליצור קשרים סינפטיים עם המקבילים שלהם לשד עמודת 17-19. חשמלית המדויקת אלה מייצרים מצע העצבי של מיפוי retinotopic ראייה לטוס מוקדם, ואז כל lamina (איורים 1 א-ג) ועמודת לשד (מחסנית) מייצגת נקודה אחת במרחב.

תשומות ישירות מ קולטני אור R1-R6 מתקבלות על ידי תאי monopolar הגדולים (LMCs: L1, L2 ו- L3) ואת תא amacrine (Am) ב lamina 1,2,20. מתוך אלה, L1 ו- L2 הוא התאים הגדולים, בתיווך מסלולי מידע מרכזי (איור 1D), WHI ch להגיב על מאזני וחוץ-נע קצוות, ובכך יוצרים בסיס החישוב של גלאי תנועה 21,22. ניסויים התנהגותיים עולה כי ב בניגוד ביניים, שני מסלולים להקל בתפיסת התנועה של בכיוונים מנוגדים: גב אל החזית L1 וקדימה אל גב בתאים L2 23,24. קישוריות נוספת מרמזת כי נוירונים L4 עשויים לשחק תפקיד קריטי לתקשורת הצדדית בין מחסניות שכנות 25,26. סינפסות גומלין נמצאו בין תאי L2 ו L4 הממוקמים באותו שתי מחסניות סמוכות. Downstream, כל תא L2 ותאי L4 השלוש הקשורים אליו להקרין האקסונים שלהם אל יעד משותף, הנוירון TM2 ב הלשד, שם תשומות ממחסניות שכנות הם האמינו להיות משולב לעיבוד מול אל גב התנועה 27. למרות נוירונים L1 לקבל קלט מאותה מחסנית L2S באמצעות שני צמתים הפער וסינפסות, הם אינם מחוברים ישירות מחסניות lamina L4s ומכאן הסמוך.

class = "jove_content"> פידבקים Synaptic אקסונים קולטי האור R1-R6 ניתנים רק על ידי נוירונים השייכים מעגלים L2 / L4 אבל לא 1,2 מסלול L1 (1D איור). בעוד קשרים בין בני אותו מחסנית הם סלקטיבי L2 כדי R1 ו- R2 ומן L4 כדי R5, כל קולטני האור R1-R6 לקבל משוב הסינפטי מ L4 של אחד מהם או שניהם מחסניות השכנה. יתר על כן, ישנם קשרים סינפטיים חזקים בבוקר עד R1, R2, R4 ו R5, ותאי גליה הם גם synaptically מחוברים לרשת ועשויים ובכך להשתתף בעיבוד תמונה עצבי 6. לבסוף,-צומת פער אקסונלית, מקשר שכנת R1-R6 ובין R6 ו R7 / R8 קולטני אור ב lamina, לתרום ייצוג מידע אסימטרי ועיבוד בכל מחסנית 14,20,28.

הקלטות מתח תאיות מ קולטני אור פרט interneurons החזותי כמעט ללא פגע תסיסנית לספק אות לרעש גבוה ratio נתונים ברזולוציה משנה אלפית השנייה 3,5,7-10,29, אשר הוא הכרחי עבור ביצוע תחושה של חישובים עצביים במהירות בין הנוירונים המחוברים. רמת הדיוק זה בלתי אפשרית על ידי שיטות הדמיה אופטיות נוכחיות, אשר הם רועשים משמעותיים ובדרך כלל לפעול ב 10 - 100 רזולוצית msec. זאת ועוד, מאחר האלקטרודות יש מאוד טיפים קטנים וחדים, השיטה אינה מצטמצמת אך גופי תא, אבל יכולה לספק הקלטות ישירות מבנים עצביים פעילים קטנים; כמו העצים הדנדריטים 'LMCs או אקסונים קולטי האור, אשר לא ניתן להגיע על ידי טיפים הרבה יותר גדול של אלקטרודות תיקון- clamp. חשוב לציין כי השיטה היא גם מבני פחות פולשני ניזק מאשר ברוב יישומי תיקון- clamp, וכך משפיעה פחות דגימה המילייה ומידע התאית 'למדו התאים. לפיכך, טכניקות microelectrode חד קונבנציונליות תרמו, ולשמור על תורמים, תגליות בסיסיות ותובנה מקוריות לתוך אינפור עצביעיבוד mation על ציר הזמן המתאים; שיפור הבנת מכניסטית שלנו ראיית 3-10.

מאמר זה מסביר כיצד בהקלטות תאיות vivo מ תסיסנית R1-R6 קולטני אור ואת LMCs מבוצעים במעבדת Juusola. פרוטוקול זה יתאר כיצד לבנות אסדת אלקטרופיזיולוגיה מתאימה, להכין לטוס, ולבצע את ההקלטות. כמה נתוני נציג מוצגים, וכמה בעיות נפוצות ופתרונות אפשריים נדונות שעשויים להיות נתקלו בעת השימוש בשיטה זו.

Protocol

הפרוטוקול הבא עומד בכל הנחיות הטיפול בבעלי החיים של אונ' שפילד ובייג'ינג רגילה האוניברסיטה.

ריאגנטים 1. הכנת ציוד

  1. הקלטת התקנת ציוד גירוי אור
    1. בחר לפחות אזור הקלטה 2.5 x 2.5 מ 'עבור ביצוע ניסויים אלקטרו בחדר כי יש מיזוג אוויר עם לחות מוסדרת ואמצעים כדי לספק תנאי הקלטה כהים. ודא כי אזור זה הוא גדול מספיק כדי להתאים בנוחות: (i) 1 x 1 מ 'שולחן רטט-בידוד כי בתי האסדה [לעוף גירוי ומכשירי הקלטה], סטראו ומקור אור קר עם שני צווארי אווז, כל סגורים בתוך כלוב גדול> 180 ס"מ פאראדיי גבוה; (Ii) מתל ציוד 38U לדיור מחשב אישי עם צג LCD שטוח, מגבר microelectrode, נהגה LED, מסננים, יחידות בקרת טמפרטורה, אוסצילוסקופ ומכשירים חשמליים אחרים שיידרשו; ו (iii)שולחן קטן וכיסא עבור החוקר.
    2. מניח את המתקן הרחק ממקורות רעש חשמליים ומכאניים, כגון מקררים, צנטריפוגות ומעליות. השתמש מגיני ברקים נפרדים כדי להגן על מכשירי החשמל והאלקטרוניקה של האסדה מן קוצי מתח המתרחשים בקו החשמל. באופן אידיאלי, לחבר את המתקן כדי אספקת החשמל פסק משלה (סוללה UPS) כדי למזער את הרעש.
    3. Construct זבוב בעל חרוטים מתוך פליז פלסטיק שחור (איור 2). לקדוח חור קטן התחדדות דרך יחידת פליז עם היצרות השוליים החיצוניים שלה אל ~ 0.8 מ"מ קוטר (התאמת רוחב בית החזה של הזבוב אופייני).
      הערה: חור זה צריך להתחדד לכיוון הקצה של בעל-הזבוב כך גדולה מממוצע תסיסנית, אשר צפויה מלמטה על ידי זרימת אוויר, יקבל כתף עמוקה תקועה ליד השולים העליונים.
    4. עיצוב ולבנות מכאני-חזק, עדיין מדויק, לעוף גירוי ומכשירי הקלטה (איור 3). לבנות את oאלומיניום או פליז f (מתכות מוליכות גבוהות) מוט פלטפורמה הכנה זבוב וסביבו מערכת קרדן-זרוע, עם מיסבים מוטבעים, לספק x החלק ומדויק, y-מיצוב ונעילה של גירוי האור.
      הערה: עיצוב מורכב משולב זו מקטין רעידות מכאניות, היכול לסלק את קצה הקלטה אלקטרודה החוצה מהתא למד. זה יכול עוד יותר כולל מערכת בקרת הטמפרטורה מבוססת פלטייה אלמנט קרוב לולאה, מה שמאפשר לחוקרים להשתמש בונה גנטית רגישת טמפרטורה, כגון TS shibire, להערכת 9,30 חישובי מעגל הסינפטי. אנודייז המנגנון או לצבוע אותו שחור למזער פיזור גירוי האור.
      1. תקן את גירוי הזבוב ומכשירי הקלטה על קרש החיתוך של השולחן נגד הרעידות; למשל על ידי ברגי M6, באמצעות חורי הברגים מטרי שלה. השתמש קרש חיתוך שחור או לכסות אותו עם בד שחור כדי למזער פיזור אור במהלך ניסויים.
      2. position ולנעול (באמצעות בורג נעילה) מוט פלטפורמה אנכית מתכוונן זבוב הכנה במרכז מערכת קרדן-זרוע. מניח את הכנת הזבוב (בתוך-בעל הזבוב, ראה שלב 2) על מוט הפלטפורמה כך שהמקור הקל שהיה מחוברת הזרוע-קרדן רדיאלית מצביע על ראשו של הזבוב. ודא כי מרכז עיני הזבוב הוא בדיוק בנקודה בצומת (0, 0) של ה- X של קרדן הזרוע ו- Y, כמו זו מאפשרת x המדויק, y-מיצוב של גירוי אור לכל נקודה בתוך מכנסיו של שדה ראייה.
        הערה: פונקציונליות זו נחוצה למיפוי מאפייני התגובה של תאים בודדים למקומות עין ספציפיים; למשל, כאשר מחפש ראיות אלקטרו עבור עיבודים מבניים, כגון אזורים בהירים או חריפים, שהיה אמור להוכיח רגישות או ברזולוצית הגדלה, בהתאמה 31.
    5. הר סטראו מאחורי גירוי הזבוב ומכשירי הקלטה על שולחן הרטט אנטי כךכי זה מספק צפייה בהגדלה גבוהה נוחה של העין לטוס.
    6. הר מקור האור הקר על החלק העליון של המיקרוסקופ עם מדריכי אור מתכווננת חצי קשיחי הראש הכפול של מקור האור כלפי מטה לעבר בעל הכנת זבוב. תאורת קרן מטלטלין בחופשיות שני עושה את זה קל יותר לדמיין את קצה האלקטרודה ההקלטה בזמן נהיגה זה דרך פתח קטן לתוך העין לטוס.
    7. צרף x מתאים, y, סט z-micromanipulator (גס & בסדר) עבור האלקטרודה ההקלטה ואת במת הראש על השולחן נגד רעידות, בחלק הימני של מנגנון הקלטת גירוי לטוס, באמצעות M6-ברגים או מגנטיים עומד.
      הערה: מעבדת Juusola, אסדות שונות מצוידות מניפולטורים שונים; לפרטים ראה טבלה של חומרים ריאגנטים. כל אלה מספקים הקלטות תאיות באיכות גבוהה.
    8. הר micromanipulator ידנית 3 ציר קטן בעל אלקטרודה השוואתית על f אנכית מתכוונןמוט פלטפורמה הכנה ly. אוריינט אלקטרודה ההשוואתית כך שהוא פונה אל בהכנה לטוס.
    9. לבנות כלוב פאראדיי שעמד חופשי מוגן אור מתוך לוחות פלדה סביב השולחן נגד רעידות, המקיף את מנגנון הקלטת גירוי זבוב, כדי למנוע הפרעות אלקטרומגנטיות מבחוץ. השאר בחזית הפתוחה הכלוב, מתן גישה להובלת הכנת הזבוב עבור הניסויים. צרף וילונות בד שחור (שיש נחושת או-רשת אלומיניום מושתל בתוכם להארקה) בחזית לגונן קולות ואור. לצבוע את הפנים של שחור הכלוב כדי למזער פיזור האור ולנעול את הרגליים של הכלוב על הרצפה כדי למנוע תנודות.
    10. חבר את המתח ותפוקות נוכחיות של מגבר microelectrode התאי הגבוה עכבה לכניסות של שני מסננים נמוכים לעבור נפרד (Bessel או דומה) באמצעות-כבלי BNC. כמו כן, לחבר את היציאות המסנן לתוך בערוצים המתאימים של blo-המחבר לספירהcks / קרשי מערכת לאיסוף וניתוח נתונים (כרטיסי DA / AD). חבר את כרטיס DA / AD (ים) לתוך מחשב אישי באמצעות כבלים מיוחדים, על פי מדריכי ספק.
    11. התקנת תוכנת רכישה מתאימה למערכת רכישת נתונים של בחירה על המחשב האישי. ודא שמנהלי רכישת נתונים תואמים את מערכת ההפעלה על המחשב האישי.
    12. קרקע חשמלית גירוי הזבוב ומכשירי הקלטה, כלוב פאראדיי, רשת נחושת (בתוך הווילאות), מיקרוסקופ, micromanipulators, מקור אור קר, מתל ציוד 38U עם כל המכשירים שלה (המגבר התאי, מסננים, יחידת בקרת טמפרטורה, מחשב וצג LCD וכו ') עד לנקודת קרקע מרכזית אחת באמצעות חוט הארקת ציוד M6 crimp קצות הארקת טבעת. השתמש מודד חשמלי לבדוק שכל החלקים נמצאים באותו הקרקע.
      הערה: כדי להשיג את תנאי ההקלטה האפשריים רעש הנמוך ביותר, תצורות ההארקה בדרך כלל להשתנות הלוך ושובמ 'אחד הגדרה למשנו.
      1. במידת צורך, להתחבר לנקודת הקרקע המרכזית נוספים על קרקע הבניין, ו / או בשטח המרכזי של microelectrode המגבר. לאחר בדיקת המערכת לתפקוד מלא במהלך הניסויים אלקטרו אמיתי, להיות מוכנים לשנות את תצורת הארקה לפי הצורך כדי למזער את הרעש ב ההקלטות.
    13. גדר הגברת תוכנה (1 - 10X), סינון אות (מסננים נמוכים לעבור בדרך כלל נקבעו על 500 הרץ, אשר מתאימים הוא נתוני R1-R6 ו LMC), ואת קצב דגימה (לפחות KHz 1). ודא שהגדרות לציית תורת הדגימה 32; למשל, בעת רכישת נתונים כי הוא נמוך לעבור סינון ב 500 הרץ, להשתמש בתדר דגימה של 1 קילו-הרץ ומעלה כדי למזער תופעות aliasing.
      1. כתגובות מתח מאפיין של קולטני אור R1-R6 40 - 65 mV, ואלה של LMCs 20 - 45 mV, להגדיר את ההגברה ותצוגת מאזניים בהתאם כדי לאפשר sampli ברזולוציה גבוההלהדמיה ng ונתונים.

איור 2
איור 2. חרוטים Fly-למחזיק את בעל הזבוב הוא עשוי משני חלקים:. יחיד פליז מרכז מעייל הפלסטיק השחור החרוטים שלה. החור המרכזי בתוך יחידת פליז מתכנס כדי בקוטר קטן שבקושי מאפשר לטוס דרך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
סקירת איור 3. של הריג אלקטרו. את ההגדרה מכילה כלוב פאראדיי שעמד חופשי מוגן אור, השולחן נגד הרעידות, גירוי זבוב הקלטת מנגנון, וילאות בד שחורים עם נחושת או אלומיניום-רשת בפנים הַאֲרָקָה. את כל הפרטיםמתל trument מחובר חשמלי לאותה קרקע מרכזית עם כל הציוד בתוך כלוב פאראדיי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. בודה microelectrodes
    1. משוך את microelectrode הפניה בורוסיליקט filamented (קוטר חיצוני: 1.0 מ"מ; קוטר פנימי 0.6 מ"מ) או זכוכית קוורץ (קוטר חיצוני: 1.0 מ"מ; קוטר פנימי 0.5, 0.6 או 0.7 מ"מ) צינורות באמצעות מכשיר חולץ פיפטה. נסה להשיג להתחדד הדרגתי קצר.
      הערה: ההגדרות המדויקות של תוכנית פיפטה חולץ להשתנות ממכשיר למכשיר; לפרטים נוספים בטבלה של חומרים העוצרים. הגודל הנקבובי בקצה אינו חיוני משום קצה האלקטרודה ההתייחסות יישבר בטרם מוכנס לתוך הכנת הזבוב.
    2. משוך את microelectrode הקלטה מ בורוסיליקט filamented (קוטר חיצוני: 1.0 מ"מ; קוטר פנימי 0.6 מ"מ) או זכוכית קוורץ (קוטר חיצוני: 1.0 מ"מ; קוטר פנימי 0.5, 0.6 או 0.7 מ"מ) צינורות באמצעות מכשיר חולץ פיפטה. נסה להשיג ארוך (10 - 15 מ"מ) להתחדד הדרגתי בסדר.
    3. בדוק עם מיקרוסקופ אור כי אלקטרודות ההקלטה להראות התחדדות נכונה. הר אלקטרודה בשקופית זכוכית עם דבק moldable ולהשתמש מטרת אוויר 40X לבדוק קצו.
      הערה: אלקטרודה טוב מתכנס מי מנוחות עד קצו הסמוי הקטן, שסביבו כהה במקביל רציפה דפוסי התערבות מצית ניתן לראות. כמה הגדרות חולצות לייצר אלקטרודות עמידות גבוהות, אשר לא יכול להניב חדירות תא מצליחות בגלל העצות שהם דומות "חצוצרות". לפיכך, בדיקה ויזואלית של אלקטרודות חשוב.
    4. צרף אלקטרודות במאוזן על פטרי צלחת גדולה עם פלסטלינה (או דבק moldable דומה) עבור שמירה-בטוחה והסעת אסדת אלקטרופיזיולוגיה. ודא טיפים אלקטרודהמחדש תמיד באוויר ולא נגיעה ברכיבים בטעות.
    5. חזרה למלא את האלקטרודות הקלטת הפניה רק ​​לפני הניסוי עם תמיסת המלח המתאימה. השתמש מזרק 5 מ"ל קטן מחובר מסנן חלקיקים קטנים עם קצה פלסטיק משובח (כגון microloader).
      1. בניסויים קולטניים אור, למלא את האלקטרודה ההקלטה עד מלא (א צורות אגל ב סופו הגדול) עם 3 KCl M כפתרון זו מצמצם את ההשפעה של פוטנציאל צומת נוזלים למתח המוקלט.
      2. על חקירת LMCs histaminergic, אשר מגיבים הקלט הסינפטי מ קולטני האור R1-R6 משינויים מוליכות-כלוריד, למלא את האלקטרודות הקלטה עם אצטט אשלגן 3 M ו- 0.5 מ"מ KCl, כפתרון הזה יש פחות השפעה על הסוללה כלוריד של התא. מלאו את האלקטרודה התייחסות עם זבוב רינגר, המכיל מ"מ: 120 NaCl, KCl 5, 10 TES (C 6 H 15 NO 6 S), 1.5 2 CaCl, 4 MgCl 2, ו -30 סוכרוז
    6. בדוק את ההתנגדות של האלקטרודה הקלטת משך חדש במערכת ההקלטה.
      1. ודא כי חוטי הכסף בתוך מחזיקי אלקטרודה הם מצופים באופן אחיד עם כלוריד כסף (המופיע סגול-אפור - לא כסוף מבריק) כדי למזער חפצי הקלטה (כגון להיסחף בפוטנציאל החיבורים). אם לא, להחליף אותם עם חוטי chloridized כראוי.
      2. במידת הצורך, chloridize חוטי כסף חדש. בזהירות לנקות את החוטים (על ידי העברת אותם במהירות באמצעות להבה) כך אלה מופיעים כסופים מבריקים בצבע. הימנעו מלגעת בהם עם האצבעות, כדי להפקיד על שכבה אחידה של AgCl. משרה את חוטי אקונומיקה ביתית עוזה במשך 15 - 30 דקות עד שהם מופיעים בצבע סגול-אפור. לחלופין, Electroplate כל חוט (בכך שהוא חיובי ביחס תמיסה המכילה 3 M KCl ו העברת זרם דרכו בשיעור של 1 מילי-אמפר / 2 ס"מ של שטח הפנים) במשך 10 - 15 שניות עד מצופה כראוי. חבר את הקלטת בחזרה מלא ואלקטרודות התייחסות מחזיקי אלקטרודה שלהם. מניח אמבטית הפתרון של קטן רינגר על מוט פלטפורמת זבוב הכנת מתכווננת האנכית. כונן טיפי אלקטרודה לתוך התמיסה רינגר ולמדוד את התנגדות הקצה של האלקטרודה ההקלטה.
        הערה: צעד זה נחוץ רק כאשר בודקים את מאפייני resistive של אלקטרודות, אשר נמשכות מן קבוצה חדשה של צינורות זכוכית, או בעת ביצוע אופטימיזציה של תוכניות המכשיר החולצות microelectrode דרך איטרציה.
      3. לפני ביצוע מדידות התנגדות, לקרוא את ההוראות במדריך למשתמש של מגבר הייצור עבור הגדרות המידה המתאימות. עבור אלקטרודה הקלטה טובה, יש התנגדות קצה ~ 100 - 220 MΩ.

2. הכנת תסיסנית

  1. אסוף 5 - 10 ימים זבובים ישנים (לאחר eclosion) ולמקם אותם בתוך שפופרת לטוס נקיה המכילה stמזון andard. אפשר להשיג הקלטות טובות מן הצעיר טס מדי, אפילו מן "התינוקות"; אבל בגלל העיניים הרכות שלהם, חיתוך פתח קרני עבור האלקטרודה ההקלטה קשה יותר.
  2. לבנות צינור לתפוס זבוב ותכשיר זבוב לעמוד (איור 4). ראה איור 4 עבור מושג כללי על איך כלים מתוצרת עצמית אלה הורכבו.
    1. כדי להפוך צינור לתפוס זבוב, לנתק את הקצה התחתון החרוטים של צינור צנטריפוגות פלסטיק 50 מיליליטר. לאחר מכן, הכנס ודבק בקצה הרחב של קצה פיפטה 1 מ"ל על הפתיחה החדשה הזו.
    2. לבסוף, לחתוך את הקצה הקטן של פיפטה לגודל כי בקלות מאפשר זבוב ללכת דרך. התייעץ סדנה מכאנית להרכיב שלב הכנת זבוב קטן המאפשר סיבוב 2 צירים ונעילה של הבעל-זבוב לתפקידים שונים.

איור 4
Figurדואר 4. כלים ובעיצוב לצורך הקבלה להכנת Fly. טוסו צינור מושכים נעשה על ידי הדבקת קצה פיפטה פלסטיק 1 מיליליטר לצינור צנטריפוגות פלסטיק 50 מיליליטר. עמדה הכנה זבוב Bespoke מאפשרת נעילה-סיבוב חופשי של בעל זבוב בעמדה מועדפת להכנה לטוס. הזבוב הוא קבוע על ידי שעוות דבורים, באמצעות שעווה דוד חשמלי. וזלין מוחל על ידי מוליך קטן שנעשה על ידי חיבור שיער מסוג עבה על ידית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. אסוף זבוב על ניסוי קצה פיפטה 1 מ"ל, אשר בקושי מאפשר זבוב כדי להתאים דרך. צרף לטוס לתפוס צינור, עם קצה פיפטה על זה, אל הצינור במהירות הבזק. בלכידת זבוב, לנצל את הנטייה הטבועה שלהם לטפס כלפי מעלה (antigravitaxis) אל קצה פיפטה. רצוי, בחר הנקבה הגדולה ביותר, כפי משנה גודלים ב אלקטרופיזיולוגיה.
    הערה: גדול לטוס, התאים שלה גדול כך יגברו הסיכויים להקלטות תאיים באיכות גבוהה. קטנים זבובים (הוא נקבות וזכרים) יכולים גם לספק הקלטות מעולות, אבל ההכנה היא יותר קשה לעשות. לאחר הזבוב לכוד בתוך קצה פיפטה גדול, זכור לסגור את צינור הזבוב להפסיק זבובים אחרים לברוח.
  2. חבר מזרק 100 מ"ל עם צינור פלסטיק גמיש אל פתח גדול יותר של קצה פיפטה - עם הזבוב עדיין בתוכו.
  3. מניחים את הקצה הצר על קצה פיפטה גדול, אשר מוגדל רק לתת תסיסנית דרך, כדי הפתח התחתון של בעל-זבוב וסוחטים נפח קטן של אוויר מן המזרק כדי להוציא את הזבוב לתוך מחזיק-fly .
    1. להסתכל דרך סטראו ובעדינות לנהל עוד אוויר עד ראשו של הזבוב מזדקר מסוף החרוטים של בעל זבוב. ודא כי זבוב לכוד בתקיפות מן החזה שלה אל אופ הקטןנינג על החלק העליון של בעל זבוב.
  4. להשתמש דוד שעווה להדק לטוס עם שעוות דבורים "הכתפיים" שלה על בעל זבוב. כוונו את הטמפרטורה של דוד שעווה להיות נמוך ככל האפשר ובכל זאת בצורה נקייה המסת שעווה.
    הערה: כאשר הטמפרטורה נכונה, השעווה נראית שקופה. גבוה מדי של טמפרטורה עושה השעווה "לשרוף"; נמוך מדי שומר על נוקשת השעווה. כאשר תיקון לטוס, להיות מדויק וקצר כמו חשיפה לחום ממושך עלול לפגוע בו. באמצעות דבק שיניים נרפאו אור אינו מומלץ כאן כיישום שלה הוא איטי מדי.

איור 5
איור 5. הכנה טס לניסויי in vivo. שמאל, הראש של תסיסנית ממוצבת ישר בעל-זבוב קבוע מ החוטם שלה, עינה וכתפי זכות מבעל הזבוב עם להיות מחומםeswax. נכון, פתח קטן הוא חתך בחלק העבה ביותר של העין, בדיוק מעל קו המשווה ורק כמה האומטידיה מן לציפורן בחזרה, באמצעות קצה חד כתער. פיסת קרנית המוסר בעדינות את החור הוא חתום עם וזלין כדי למנוע העין מפני התייבשות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לשתק את ראשו של הזבוב. החל שעוות דבורים אל החוטם (איור 5) ו בפינת העין הימנית, הימנעות הקרנית, ולתקן את הראש מנקודות אלו על בעל זבוב.
  2. לייצר סכין מיקרו. קלאמפ גילוח הלא נירוסטה עם שני פורעי להב-מחזיקים / (שניהם עם אחיזה שטוחה) ולפצח רצועה קטנה של הקצה חד שלה. לבריאות ובטיחות, השתמשו משקפים להגנת עין (למרות שזה לא סביר כי חתיכות היו יתירו כאשר התער סדוק). באופן אידיאלי,לייצר יתרון חד כתער דומה צריח. ודא כי זה "צריח" מחובר היטב אל-מחזיק הלהב, אבל להיות זהיר, כדי למנוע כל פגיעה עצמית!
  3. באמצעות סכין מיקרו, להכין גודל פתח קטן של כמה האומטידיה בעין שמאל של הזבוב - בסביבות 4 - 5 האומטידיה מן לציפורן הגב בדיוק מעל קו המשווה של העין לספק את המעבר עבור microelectrode ההקלטה. בצע תחת סטראו, צפייה בהכנה עם גדלה גבוהה.
    הערה: מכיוון עין הזבוב מרגישה אלסטי resistive כדי חיטוט, החור לחתוך בצורה הטובה ביותר עם -knife "צריח". טכניקת החיתוך די מאתגרת, אז לשים לב להפגנת הווידאו. שמירה על בעל זבוב אוריינטציות מסוימים (בדוכן הכנה זבוב) יכול להפוך את דיסקציה קל. בתחילה, המיקרו-כירורגיה עשוי להרגיש קשה ללמוד, אבל ברגע מחויב, הסתגלות עצבית בהדרגה משפרת את כשרון 3D-התפיסה של החוקר.
  4. Rסר בעיון את החתיכה הקטנה של קרנית מהפתיחה כי נחתכה רק, חשיפת הרשתית מתחת. במהירות לכסות את החור בעין עם גוש קטנטן של וזלין באמצעות השיער הדק של המוליך וזלין.
    הערה: וזלין משמש תפקידים מרובים כאן. זה מונע רקמות התייבשות וקרישה של hemolymph שישבור את האלקטרודה ההקלטה המוכנסת. זה גם אגב מעיילי microelectrode, צמצום הקיבול העירוני שלה. זה יכול לשפר את תגובת התדר של מערכת ההקלטה, ולכן ההחלטה הזמנית של האותות העצביים המוקלטים. הימנע מורחת וזלין על שאר העין כמו זה מטשטש את האופטיקה.

3. הקלטה מ קולטני האור או LMCs R1-R6

  1. תמיד להיות מעוגנת במהלך הפעלת מגבר microelectrode (למשל על ידי נגיעה במשטח מתכת של כלוב פאראדיי או שולחן נגד רעידות), כמו זו שוללת אחד מן בטעות לספקing מטען סטטי אל-שלב הראש, העשוי להזיק את המעגלים.
  2. להאיר את קוטב הפלטפורמה הכנה זבוב מלמעלה על ידי שני מדריכי אווז צוואר אור (איור 6 א) (עם מקור האור הקר בתוך כלוב פאראדיי) כך בעל זבוב ניתן להציב על המוט למיקום המועדף תחת שליטה חזותית קרובה .

איור 6
איור 6. מיצוב בעל זבוב ואת אלקטרודות עבור ניסויים (AB) The-בעל זבוב מושם על פלטפורמת ההקלטה כי גם מספק בקרת טמפרטורה באמצעות אלמנט פלטייה (ת: פלטפורמת עגול לבן במרכז).. קרדן הזרוע מאפשרת המיקום המדויק של גירוי אור במרחק שווה (באמצעות x, y-סיבוב) סביב לטוס, עם מקור האור (למבוי צרור נוזלי או קוורץ סיבים אופטיים) ישירות והצביע על עינו שלה. ברבים ouאסדות r, גירוי האור מופק על ידי נוריות (עם מנהלי ההתקן העדכניים ליניארי) או על ידי monochromator. לפיכך, הגירויים שלהם לשאת ספציפי (עקף להקה) תוכן רפאים, שנבחר בין 300 - 740 ננומטר ולכסות 4 - 6 יומן מגוון מיחידת טיפול נמרץ (כמו נחלשו על ידי מסנני צפיפות ניטראליים נפרדים). (C) שני microelectrodes, שבשליטת micromanipulators הנפרד, מוצב בראש הזבוב: אלקטרודה ההשוואתית (לעיל) דרך ocelli; האלקטרודה הקלטה (משמאל) דרך פתח קטן בעין שמאל. (ד) קבלת מספר מרבי של קלטות קולטי אור, את microelectrode ההקלטה הוא מונע לתוך החור, מקביל לצייר חוטם-ocellus. כאשר קצה האלקטרודה החודר וחותמות על קולטי אור, את מקור אור rotatable בחופשיות מקובע בעמדה שבה התא מייצר את תגובת המתח המרבית לגירוי אור נתון. נקודה זו בחלל טמונה במרכז השדה הפתוח של התא. אם אני חורs קרוב לציפורן, חדירות LMC ניתן להשיג יותר עם זווית אלקטרודה אותו (משמאל). אם החור הוא רחוק יותר מן לציפורן, עוד זווית גישת אלקטרודה שימושית להשיג הקלטות LMC מוצג גם (מימין). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הר-בעל זבוב (עם הזבוב בו!) על המוט פלטפורמה הכנה זבוב. סובב את בעל זבוב כך עינו השמאלית של הזבוב פונה החוקר ישירות (איור 6).
  2. הכנס את האלקטרודה ההתייחסות הבוטה בעדינות הדרך של occelli לטוס לתוך הקפסולה הראש באמצעות micromanipulator גס קטן תוך שמירה על ההכנה באמצעות סטראו (איור 6 ג). אל תדחוף את האלקטרודה עמוק מדי, כמו זה יכול להזיק למוח זבוב.
    1. לחלופין, הכנס את האלקטרודה התייחסות לחלק האחורי של בית החזה. תמיד, להבטיח כי לטוס מופיע heathy (נע האנטנות שלה) והעיניים שלה הן שלמים; לא ניזוק באופן מקרי. אם ההכנה נראית פחות רבב, להכין זבוב חדש עבור הניסויים.
  3. להסיע את microelectrode ההקלטה חדה לתוך עינו השמאלית דרך וזלין מכוסה פתח קטן מוכן קודם לכן. השתמש הגדלה גבוהה סטראו והזז את מובילי אור במישור המוקד כך שמיקום קצה האלקטרודה מתברר ב -3 D על ידי דפוסי ההחזרה שלה.
    הערה: איור 6D מראה כיצד ראשו של הזבוב צריך להיות ממוקם בצורה קצת שונה (בגין אל מסובב את microelectrode ההקלטה נקלט בעין) עבור קולטי אור וקלטות LMC. נהיגה האלקטרודה לתוך העין מבלי לשבור אותו הוא השלב הקשה ביותר של הניסוי. אם קצה האלקטרודה מתגעגע הפתיחה הקטנה בעין, להכות את הקרנית, זה בדרך כלל שובר.
  4. הפעל את המגבר microelectrodeפעם היא אלקטרודות הם בתקיפות בתוך ההכנה, במגע חשמלי עם נוזלי הגוף של הזבוב.
  5. כבה את מקור קר-אור (בתוך כלוב פאראדיי), נתקו אותו מהחשמל. חבר התקע שלו לקרקע המרכזית למזער מושרה קרקע-לולאת רעש חשמלי, והזז את מובילי אור אווז הצוואר משם כך שמערכת קרדן הזרוע ניתן להעביר באופן חופשי סביב לטוס. כבו את האורות בחדר כדי להבטיח כי הכנת לטוס עכשיו בחושך יחסי.
  6. מדוד את ההתנגדות של האלקטרודה ההקלטה בעיניים (כפי שמוסבר במדריך למשתמש של המגבר). השתמש אלקטרודות הקלטה יחידה שבה התנגדות היא 100 - 250 MΩ.
    הערה: זה כמעט בלתי אפשרי להשיג הקלטות תאיות באיכות גבוהה על ידי <70 אלקטרודה MΩ. אם ההתנגדות היא <80 MΩ, סביר להניח כי קצה האלקטרודה הוא שבור. במקרה זה, לכבות את המגבר ולשנות את האלקטרודה ההקלטה.
    1. לאחר האלקטרודהמוחלף בעיניים, לעבור על המגבר כדי למדוד את ההתנגדות שלה. לפעמים, קצה האלקטרודה יכול להיחסם על ידי שאריות כמה כפי שהוא מזין את הרקמות. זה ניתן לתיקון על ידי שימוש בפונקציות באז קיבולים ודופק הנוכחי של המגבר, כי בדרך כלל זה ברור על ידי resonation המהיר או דחייה.
  7. הגדר את המגבר הנוכחי מהדק (CC) או מצב הקלטת הגשר. לבטל את כל הבדל במתח שרירותי בין האלקטרודות הקלטת הפניה, כמו ושניהם לומדים עכשיו נחים במרחב התאי המחובר באופן חשמלי, על ידי הקביעה לקזז אות (מתח הקלטה) לאפס. בצע את שינויי האות לקזז באמצעות הודעת התצוגה של המגבר או מסך אוסצילוסקופ.
  8. מתן 2-3 דקות עבור עין הזבוב אל dark-להסתגל.
  9. להסיע את קצה האלקטרודה הקלטה עמוק בהדרגה לתוך העין עם 0.1 קטנים לצעדי מיקרון 1. האם זה עם צעד-piezo ציר x של micromanipulator בשליטה מרחוק או בy בעדינות לסובב את ידית רזולוצית הקנס של מניפולטור ידנית.
  10. לעורר את העין לטוס עם קצר (1 - 10 msec) הבזקי אור כמו האלקטרודה ההקלטה מתבצעת מתקדמים בתוך הרקמה.
    הערה: אם את האלקטרודה ההקלטה ממוצבת ברשתית ואת פונקציות העין באופן נורמלי, כל בזק אור תגרומנה ירידה קצרה וקטנה המתח (0.2 - 5 hyperpolarization mV), שנקרא electroretinogram (ERG). שינוי זה בפוטנציאל בתחום החלל התאי נגרם על ידי התגובה הקולקטיבית של התאים ברשתית לאור. עם זאת, ברגע קצה האלקטרודה נכנס lamina, הסגירה על LMCs, את ERG הופך, מראה תגובות depolarizing.
  11. הזז את מקור האור סביב העין לטוס באמצעות מערכת קרדן הזרוע ולמצוא את המיקום שבו האור מעורר את תגובת ERG הגדולה.
    הערה: עמדה זו מסמנת את המקום הקטן במרחב החזותי שבו קולטני האור (או LMCs), אשר ממוקמים ליד קצה האלקטרודה ההקלטה, לטעום קלט האור שלהם.
  12. לחדור לתא עם האלקטרודה ההקלטה.
    הערה: חדירה יכולה להתרחש באופן ספונטני, או כאשר האלקטרודה היא מיקרו-צעד קדימה. ניתן להקל על זה עוד יותר על ידי הקשה על micromanipulator מערכת או באמצעות באז-פונקציה של המגבר בעדינות; פעולות אלה להדהד קצה האלקטרודה בתוך הרקמה. כאשר האלקטרודה impales הממברנה קולטי האור, ליציאה לחלל תאיים שלה, ההבדל במתח בין הקלטה אלקטרודה השוואתית טיפות לפתע 0 mV ל ~ -65 mV (בין -55 ו -75 mV); ואילו במהלך חדירות LMC, ירידה זו היא בדרך כלל פחות (בין -30 ו -50 mV). הבדלי מתח אלה מייצגים את פוטנציאלי מנוחה השליליים של התאים הנתונים. תלוי באיכות של האלקטרודה ההקלטה (חריפותו) ותהליך הסלולר חדרה, קריאת המתח מ האלקטרודה ההקלטה יכולה לייצב במהירות או בהדרגה את הפוטנציאל הנח, כמו קרום התאחותמות אל השכבה החיצונית של האלקטרודה. אבל אם החדירה היא חלקית בלבד או עניה, האלקטרודה בדרך כלל מחליקה אל מחוץ לתא עם טיפוס הפוטנציאל רשם בחזרה לכיוון אפס.
  13. למקם את מרכז השדה הפתוח של התא חדר כאשר האלקטרודה מופיע אטום כמו שצריך, מראה פוטנציאל הממברנה יציב (מתח מנוחה כהה). הזז את גירוי האור מהבהב סביב העין לטוס, באמצעות מערכת קרדן-הזרוע, כדי למצוא את הנקודה במרחב חזותי, שבם מבזק האור מעורר את תגובת המתח המרבית של התא. נעל את זרוע קרדן כאשר גירוי האור פונה ישירות (נקודות) במרכז השדה הפתוח.
    הערה: בחושך, קולטני אור תסיסנית להגיב להבזקי אור בהירים עם 40 - 65 תגובות מתח depolarizing mV 4,5, בעוד קלטות LMC יציבות להראות 20 עד 45 תגובות hyperpolarizing mV 9,10,14. חדירות גליה יכולות לקרות לעתים נדירות, שמסומנות על ידי <-80 פוטנציאלים מנוחים mV ו הרבה יותר איטייותר ויותר (~ 5 mV) רווי depolarizations אור-induced. קולטני האור תסיסנית עם pigmentations עיניים שונות, כגון עיניים לבנות 7 כינאבאר, להראות בגדלים בתגובה להשוות wild-type.
  14. השימוש במצב נוכחי מהדק (CC) של המגבר, לפצות את הקיבול של האלקטרודה ההקלטה על ידי הזרקה קטן 0.1 Na וקצרים (100 - 200 אלפיות שני) פולסים נוכחי לתוך התא למד למזער חפצי הקלטה במהלך הטעינה הממברנה שלו.
    הערה: הליך חשוב זה מוסבר בפירוט במדריך למשתמש של המגבר, צריך להיות מתורגל עם מודל תא חשמל לפני הניסויים בפועל.
  15. מתח שיא תגובות להבזקי אור וגירויים אחרים בעלי עניין, לאחר איכויות סטטיסטיות או פיסיות משתנות (כגון סדרת זמן עוצמת אור נטורליסטי או דפוסים בניגוד אקראיים). מבחן, למשל, איך התגובות רשמו לשנות עם אור או-הסתגלות כהה.
    הערה: אפשר במדויק light-להתאים את התא למד על ידי אור הרציף של עוצמת שנבחרה מראש על ידי הוספת פילטרים צפיפות ניטראליות על נתיב אור 4,5. לחלופין, עבור כהה הסתגלות ממושכת לכבות את גירוי האור למשך זמן מוגדר מראש. בגלל היציבות המכאנית של מערכת ההקלטה, את האיכות הגבוהה של האלקטרודות ההקלטה ואת התקינות של התכשיר, תנאי הקלטה יציבים לפעמים יכולים להימשך שעות רבות. לפיכך, ביום טוב, אפשר לאסוף כמות גדולה של נתונים על תנאי הסתגלות שונים מתא בודד. כאשר האלקטרודה מחליק אל מחוץ לתא, התגובות שנרשמו נחלשי המתח הממוצע מתחיל להתקרב לאפס.
  16. תתקדם בה בזהירות את האלקטרודה ההקלטה באמצעות שלט ציר x הקנס של micromanipulator עד אלקטרודה יוצרת קשר וחודר לתא הבא (בדרך כלל זהו השכן העצבי הקרוב). אל תזיזו את האלקטרודה לאורך y- או Z- ציר של תמרונים אלה יגרמו האלקטרודה כדי "plough הרקמה "הצידה, נזק מבני עין!
    הערה: עם אלקטרודה טוב ותכשיר בריא, אחד יכול להקליט תגובות באיכות גבוהות מ קולטני אור רב (אך רק לעתים רחוקות מן LMCs רב) באותה הזבוב על פני תקופה של מספר שעות; מדי פעם, על יום העבודה כולו (> 8 שעות) ללא הידרדרות איתות ברורה.
  17. שמור את נתוני קבצים מעת לעת עם פרטים מזהים, כגון תאריך, גנוטיפ, ואת סוג התא המוקלט. בגלל הכמות הגדולה של נתונים שניתן לגבות הקלטות מוצלחות, רישומים בכתב טובים בבית-ספר מעבדה לניתוח נתונים עתידיים.

Representative Results

שיטת הרישום בה microelectrode חדה, כפי שהותאם כאן העין תסיסנית, שניתן להשתמש בם כדי לכמת דגימת מידע עצבית באופן מהימן ועיבוד בתאי רשתית lamina, ותקשורת ביניהם 4,5,7,8,10,33. באמצעות אותו ללמוד קידוד במניות wild-type שונים, מוטציות או זנים מהונדסים גנטית זבוב, השיטה הוכיחה את תמורתו; לא רק בכימות ההשפעות של מוטציה, טמפרטורה, דיאטה או ביטוי שנבחר 3,4,6,9,10,14,30,34, אלא גם חושפים סיבות מכניסטי התנהגויות ויזואלית שונות 14,34. השיטה היא גם ישים בקלות הכנות חרקים אחרות 35,36, העצמת מחקרי חזון neuroethological. הבא אנחנו להציג כמה דוגמאות של היישומים המוצלחים שלה.

איור 7
מתח איור 7. תגובות של זבוב פרותי R1-R6 קולטי אור כדי פולסו אור ב -20 ו -25 מעלות צלסיוס בגלל חדירות microelectrode חד הם לעתים קרובות מאוד יציבות, אפשר להקליט תגובות מתח של קולטי האור R1-R6 אותה לגירוי אור שניתן בטמפרטורות סביבה שונות התחממות או קירור לטוס. בשינה להגדיר הקופצים שלנו, בעל הזבוב מושם על מערכת טמפרטורת שליטה קרובה לולאת פלטייה אלמנט מבוססת. זה מאפשר לנו לשנות את טמפרטורת ראשו של הזבוב בתוך שניות. טמפרטורה גבוהה מאיצה את תגובות מתח ובאורח אופיינית מורידה את מתח המנוחה של קולטני אור R1-R6 (כפי שצוינה על ידי חצים אדומים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לימוד השפעת הטמפרטורה על פלט קולטי אור

יפ-together.within-page = "1"> עם מערכת הקלטה מעוצבת היטב מבודד רטט, השיטה יכולה לשמש למדידת השפעת הטמפרטורה על התפוקה העצבית של תאים בודדים על ידי התחממות או קירור לטוס. הדוגמא שניתנה תערוכות תגובות מתח דופק 10 msec ארוך בהיר, שנרשמו קולטי אור R1-R6 אותו ב 20 ו 25 מעלות צלסיוס (איור 7). כפי לכמת לפני 4,9, התחממות מורידה מתח מנוחה של קולטי אור בחושך, ומאיצה תגובות המתח שלה.

הספרה 8
איור 8. ביצועי מאותת על זבוב הפירות R1-R6 קולטי האור משפר עם עוצמת אור (א) פלט קולטי האור לעמעם (להלן) ובהיר. (לעיל; 10,000 פעמים אור בהיר) חזר עוצמת האור נטורליסטי סדרות עתיות שרשמה אותו microelectrodeבאותו תא ב 20 o C. תגובות ל הגירוי הבהיר הן גדולות יותר, משום שהם לשלב דגימות יותר, תגובות יסודיות (בליטות) כדי פוטונים בודדים 4,5,7,8. (ב) 20 תגובות מתח חד שני ארוכות רצופות מורכבות. תגובות בודדות (אפור בהיר) נלקחו לאחר המגמות אדפטיבית (חץ א) נסוג (תיבה מקווקות א). אמצעי התגובה הדומה (האותות) הם העקבות הכהות. ההבדל בין האות לבין התגובות הבודדות הוא הרעש. (ג) התאים 'ביצועי איתות היה לכמת ידי ההקלטות "יחסי אות לרעש (SNR) באמצעות השיטות הסטנדרטיות 4,5,7,8. פלט קולטי אור יש כ 64 הרץ טווח רחב יותר של איתות אמינה על הגירוי הבהיר ( '≥1 המואר, עד 84 הרץ מאשר בבית העמום (SNR SNR)' דים ≥1, עד 20 הרץ), עם היםignal לרעש יחס שיפור משמעותי; מ SNR דים MAX = 87 עד SNR מוארת MAX = 1,868. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לימוד הסתגלות וקידוד עצבי על ידי חוזרים גירוי

Noninvasiveness של השיטה, גרימת ניזק מועט יחסית במבני רשתית lamina, הופך אותו לאידיאלי ללימוד ביצועי האיתות של תאים בודדים לגירויים באור שונים במצב הפיזיולוגי הטבעי ליד שלהם in vivo. איור 8 מציג תגובות מתח של R1- R6 קולטי אור לגירוי סדרת זמן עוצמת אור נטורליסטי חזר עמום ובהיר ב 20 מעלות צלסיוס, ואילו איור 9 o C. ההקלטות טרום postsynaptic בוצעו בנפרד משני זבובים שונים כי הקלטות תאיות סימולטני על ידי שני microelectrodes חד באותה הזבוב, אחד ברשתית והשני lamina, קשות מכדי להיות בת קיימא 30.

איור 9
תגובות מתח איור 9. של זבוב הפירות R1-R6 קולטי האור ואת LMC כדי נאטורליסטי חוזרות גירוי ב 25 מעלות צלסיוס (א) R1-R6 (אפור) LMC (שחור) פלטי שרשמה microelectrodes שונה זבובים שונים. (ב) 20 מראש רצופים אור-התאמה מלאה (למעלה) ו postsynaptic (להלן) תגובות לאותו דפוס גירוי נטורליסטי עם תגובות בודדות, שמוצג אפור בהירד אמצעי התגובה המתאים (אותות) כעקבות הכהות. ההבדל בין האות לבין התגובות הבודדות הוא הרעש. (ג) התאים 'ביצועי איתות היה לכמת ידי ההקלטות "יחסי אות לרעש (SNR). פלט LMC יש בערך 10 הרץ טווח רחב יותר של איתות אמינה (SNR '≥1 LMC, עד 104 הרץ) מאשר תפוקת R1-R6 (SNR' R ≥1, עד 94 הרץ). יחסי אות לרעש שניהם גבוהים (SNR LMC MAX = 142, SNR R MAX = 752), וכפי רעש ההקלטה היה נמוך, ההבדלים ביניהם משקפים הבדלי קידוד בזמן בין התאים. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר הופעת הגירוי, ההקלטות טיפוסיותly מהר להראות התאמת מגמות להתפוגג בעיקר בתוך 5-6 שניות. מכאן ואילך, התאים לייצר תגובות ומתואמות היטב לכל מצגת גירוי 1 שניות ארוכות (כל תיבה מקווקות סוגרת 20 של אלה). את הדירות מהתגובות הופכות להיות ברורות כאשר אלה מורכבים (איור 8B והאיור 9B). תגובות בודדות הן העקבים אפורים הדקים, אינו אומר העקבות הכהות העבות. התגובה הממוצעת נלקחת כמו האות העצבי, ואילו הרעש העצבי ההבדל בין הממוצע וכל 4,5,9,37,38 בתגובת פרט. אות לרעש בהתאמה יחסים בתחום תדר (האיור 8C ואיור 9 ג) התקבלו על ידי פורייה- הפיכת נתחי נתוני אותות ורעש לתוך ספקטרום כוח, חלוקת ספקטרום הספק האות הממוצעת עם ספקטרום הספק רעש הממוצע המתאים 4, 5,9,37,38. אופייני, אות לרעש המרבי היחסים of התפוקות העצביות רשמו לגירוי נטורליסטי הן גבוהות (100 - 1000), וכן בהכנות הכי היציבות עם רעש הקלטה נמוך מאוד יכול להגיע לערכי >> 1,000 (למשל, איור 8C.). שימו לב גם ההתחממות שמתרחב התאים 'רוחב הפס של אמין איתות 4 (SNR' ברייט ≥ 1); למשל, את ההבדל היחסי בין שתי-R6s R1 איורים 8 ו -9, בהתאמה, הוא 10 הרץ (84 ב ג '20 o ו -94 הרץ 25 מעלות צלסיוס).

אפשר עוד מעריכים בכל שיעור התא של העברת מידע בין אות לרעש שלה יחס באמצעות המשוואה שאנון 32, או על ידי חישוב ההפרש בין שיעורי אנטרופיה אנטרופיה רעש 'התגובות דרך ושיטת הניפוח משולשת 39. פרטים נוספים על ניתוחים תיאורטיים מידע, והשימוש בהם והגבלותs במיוחד בשיטה זו ניתנות בפרסומים הקודמים 7,8,39.

איור 10
תגובות איור 10. מתח של רוצח Fly R1-R6 קולטי אור ואת LMC חוזר נאטורליסטי גירוי ב 19 מעלות צלסיוס (א) R1-R6 (אפור) LMC (שחורה) פלטים שרשמו אותו microelectrode מאותו הזבוב; postsynaptically הראשון ובהמשך Presynaptically, כמו האלקטרודה כפי שהוצעה בעיניים. (ב) 20 מראש רצוף (לעיל) postsynaptic (להלן) תגובות (עקבות אפורות בהירות) לאותו דפוס גירוי נטורליסטי נתפסו לאחר הסתגלות ראשונית (תיבה מקווקות א). אמצעיהם הם האותות (העקבות הכהות על גבי), ואילו ההבדלים שלהם אל התגובות הבודדות לתת הרעש. (ג) סינייה המקבילl לרעש יחסי (SNR) חושבו איורים 8C ו 9 ג. פלט LMC יש כ למגוון רחב יותר של 100 הרץ של איתות אמין (SNR 'LMC MAX ≥1, עד 234 הרץ) מאשר התפוקה R1-R6 (SNR' R MAX ≥1, עד 134 הרץ). יחסי אות לרעש שניהם גבוהים (SNR LMC MAX = 137, SNR R MAX = 627), וכפי אותה microelectrode שמש הקלטות, ההבדלים ביניהם משקפים הבדלים של ממש פלטים העצביים טרום postsynaptic. תוצאות אלו מרמזות כי מערכת ההקלטה הייתה רעש נמוך, והשפעתה על הניתוחים הייתה שולית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מחקרי חזון Neuroethological השיטה יכולה לשמש גם כדי להקליט תגובות מתח טרום postsynaptic מעיני התרכובת של מינים שונים של חרקים 7,8,35,36 (איור 10), המתיר מחקרי neuroethological השוואתיים של עיבוד מידע חזותי. עבור מערכת ההקלטה הציגה, העיבוד הנדרש היחיד הוא בעלי הכנה חדשים, כל אחד עם פתיחה כראוי בגודל המין למד. הקלטות למופת אלה הן מן של רוצח הנקבה לעוף (attenuata Coenosia). הם מראים תגובות מתח תאיות של קולטי אור R1-R6 ו LMC לגירוי אור חוזרות זהה, כפי שמוצג על עמיתיהם תסיסנית באיור 9, אבל בגיל 19 o C. במקרה זה, הוא לפני ואחרי נתוני postsynaptic נרשמו מאותו הזבוב; בזו אחר זו, עם אותה אלקטרודה הקלטה (מלא 3 KCl M) הראשון לקידום דרך lamina לרוחב לפני להיכנסing הרשתית חזיתית. לשם השוואה לנתונים תסיסנית במהירות של 25 מעלות צלסיוס, נתוני Coenosia - אפילו בטמפרטורה הקרירה - תערוכות תגובות עם דינמיקה מהר; הרחבת סל האיתות אמינה (יחס אות לרעש >> 1) על פני טווח תדר רחב יותר. כזה עיבודים תפקודיים קידוד עצבי של גירויים נטורליסטי עולים בקנה אחד עם אורח חיים טורפים של Coenosia 36, אשר דורשים מידע spatiotemporal דיוק גבוה כדי להשיג התנהגויות ציד אוויריות מהר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo Zoom Microscope for making the fly preparation Olympus SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN30x-H/22 Capable of ~150X magnification with long working distance; bespoke heavy steel table mount stand
Stereomicroscope in the intracellular set-up ·  Olympus Olympus SZX7; eyepieces: WHN30x-H/22 30X eyepieces are needed for seeing the electrode tip reflections well when driving it through the small corneal hole into the eye
Nikon microscope Nikon SMZ645; eyepieces: C-W30x/7
Anti-vibration Table Melles Griot With metric M6 holes on the breadboard Our bespoke rigs have a large hole drilled through the thick breadboard that lets in the fly preparation platform pole (houses a copper heatsink with electronics) from below
Newport
Micromanipulators Narishige Narishige NMN-21 In our intracellular set-ups, different micromanipulator systems are used for driving the shap recording electrodes into the fly eye. All the listed manipulators are succesfully providing long-lasting stable recordings from Drosophila photoreceptors and LMCs. 
Huxley Bertram Huxley xyz-axis with fine manual control
Sensapex Sensapex triple axis
Märzhäuser Märzhäuser DC-3K with additional x-axis piezo stepper and MS 314 controller
Magnetic Stands Any magnetic base with on/off switch will do For example, to manage cables inside the Faraday cage
Electrode Holders Harvard Apparatus ESP/W-F10N
Silver Wire World Precision Instruments  AGW1510 0.3 - 0.5 mm diameter; needs to be chloridized for the electrode holders
Fiber Optic Light Source Many different, including Olympus
Fiber Optic Bundles UltraFine Technology To deliver the LED light stimulus to the Cardan arm system. We use both liquid and quartz light guides (range from UV to IR)
Thorn Labs
Fly Cathing Tube P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Pack of 100 Pcs Cut the conical bottom off from 50 ml Plastic Centrifuge Tube and glue a 1 ml pipette tip on it.
Digital Acquisition System National Instruments
Single-electrode current/voltage-clamp microelectrode amplifier npi SEC-10LX http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html Outstanding performer!
Head-stage Standard (+/- 150 nA) For npi SEC-10LX
LED light sources and drivers 2-channel OptoLED (Cairn Research Ltd., UK) Many of our stimulus systems are in-house built 
Self-designed and constructed
Acquisition and Analyses Software Many companies to choose from Biosyst; custom written Matlab-based system for experimental and theoretical work in the Juusola laboratory
Personal Computer or Mac Ensure that PC or Mac is compatible with data acquisition system and software
Cardan arm system  Self-designed and constructed Providing accurate x,y,z-positioning of the light stimuli
Peltier temperature control system  Self-designed and constructed
Faraday Cage Self-constructed Electromagnetic noise shielding
Filamented Borosilicate Glass Capillaries Outer diameter: 1 mm
Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm
Filamented Quartz Glass Capillaries Outer diameter: 1 mm
Inner diameter: 0.5 - 0.7 mm
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller For borosilicate reference electrodes, use the preset program #11 (patch electrodes): Heat = 350; Filament = 4; Velocity 36; Delay = 200).1.2.1). For borosilicate recording electrodes, use the preset program #12 (this typically pulls good conventional sharps  for photoreceptor recordings): Heat = 355; Filament = 4; Velocity 50; Delay = 225; Pull = 150. For LMC recordings, which require electrodes with finer tips, these values need to be adjusted. For pulling quartz capillaries, P-2000 manual suggests programs for fine tipped microelectrodes. These programs’ preset parameters serve as useful starting points for systematic modifications to generate electrodes with good penetration success and low recording noise.
Extracellular Ringer Solution for the reference electrode Chemicals from Fisher Scientific 10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sucrose See the recipe in the protocol section
3 M KCl solution for filling the filamented recording microelectrode Salts from Fisher Scientific 10010310, KCl
Petroleum jelly Vaselin
Non-stainless steel razor blades
Blade holder/breaker Fine Science Tools By Dumont 10053-09 9 cm
Blu-tack Bostik Alternatively, use molding clay
Forceps Fine Science Tools By Dumont 11252-00 #5SF (super-fine tips)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meinertzhagen, I. A., O'Neil, S. D. Synaptic Organization of Columnar Elements in the Lamina of the Wild-Type in Drosophila-Melanogaster. J Comp Neurol. 305, 232-263 (1991).
  2. Rivera-Alba, M., et al. Wiring Economy and Volume Exclusion Determine Neuronal Placement in the Drosophila Brain. Curr Biol. 21, 2000-2005 (2011).
  3. Abou Tayoun, A. N., et al. The Drosophila SK Channel (dSK) Contributes to Photoreceptor Performance by Mediating Sensitivity Control at the First Visual Network. J Neurosci. 31, 13897-13910 (2011).
  4. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosphila photoreceptors: II. Rising temperature increases the bandwidth of reliable signaling. J Gen Physiol. 117, 27-41 (2001).
  5. Juusola, M., Hardie, R. C. Light adaptation in Drosophila photoreceptors: I. Response dynamics and signaling efficiency at 25 degrees. C. J Gen Physiol. 117, 3-25 (2001).
  6. Pantazis, A., et al. Distinct roles for two histamine receptors (hclA and hclB) at the Drosophila photoreceptor synapse. J Neurosci. 28, 7250-7259 (2008).
  7. Song, Z., Juusola, M. Refractory sampling links efficiency and costs of sensory encoding to stimulus statistics. J Neurosci. 34, 7216-7237 (2014).
  8. Song, Z., et al. Stochastic, Adaptive Sampling of Information by Microvilli in Fly Photoreceptors. Curr Biol. 22, 1371-1380 (2012).
  9. Zheng, L., et al. Feedback network controls photoreceptor output at the layer of first visual synapses in Drosophila. J Gen Physiol. 127, 495-510 (2006).
  10. Zheng, L., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye I Dynamics. Plos One. 4, (2009).
  11. Hardie, R. C., Juusola, M. Phototransduction in Drosophila. Curr opin neurobiol. 34, 37-45 (2015).
  12. Clandinin, T. R., Zipursky, S. L. Making connections in the fly visual system. Neuron. 35, 827-841 (2002).
  13. Wernet, M. F., et al. Homothorax switches function of Drosophila photoreceptors from color to polarized light sensors. Cell. 115, 267-279 (2003).
  14. Wardill, T. J., et al. Multiple Spectral Inputs Improve Motion Discrimination in the Drosophila Visual System. Science. 336, 925-931 (2012).
  15. Hardie, R. C. Progress in Sensory Physiology. Ottoson, D. 5, Springer. 1-79 (1985).
  16. Borst, A. Drosophila's View on Insect Vision. Curr Biol. 19, 36-47 (2009).
  17. Kirschfeld, K. Die Projektion Der Optischen Umwelt Auf Das Raster Der Rhabdomere Im Komplexauge Von Musca. Exp Brain Res. 3, 248-270 (1967).
  18. Morante, J., Desplan, C. Photoreceptor axons play hide and seek. Nat Neurosci. 8, 401-402 (2005).
  19. Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. Optic lobe development. Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).
  20. Shaw, S. R. Early Visual Processing in Insects. J Exp Biol. 112, 225-251 (1984).
  21. Joesch, M., Schnell, B., Raghu, S. V., Reiff, D. F., Borst, A. ON and OFF pathways in Drosophila motion vision. Nature. 468, 300-304 (2010).
  22. Clark, D. A., Bursztyn, L., Horowitz, M. A., Schnitzer, M. J., Clandinin, T. R. Defining the Computational Structure of the Motion Detector in Drosophila. Neuron. 70, 1165-1177 (2011).
  23. Rister, J., et al. Dissection of the peripheral motion channel in the visual system of Drosophila melanogaster. Neuron. 56, 155-170 (2007).
  24. Vogt, N., Desplan, C. The first steps in Drosophila motion detection. Neuron. 56, 5-7 (2007).
  25. Strausfeld, N. J., Braitenberg, V. Compound Eye of Fly (Musca-Domestica) - Connections between Cartridges of Lamina Ganglionaris. Z Vergl Physiol. 70, 95-104 (1970).
  26. Strausfeld, N. J., Campos-Ortega, J. L4-Monopolar Neuron - Substrate for Lateral Interaction in Visual System of Fly Musca-Domestica (L). Brain Res. 59, 97-117 (1973).
  27. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic Circuits Integrate Neighboring Visual Signals in a Drosophila Motion Detection Pathway. Curr Biol. 21, 2077-2084 (2011).
  28. Shaw, S. R., Frohlich, A., Meinertzhagen, I. A. Direct Connections between the R7/8 and R1-6 Photoreceptor Subsystems in the Dipteran Visual-System. Cell Tissue Res. 257, 295-302 (1989).
  29. Wolfram, V., Juusola, M. Impact of rearing conditions and short-term light exposure on signaling performance in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol. 92, 1918-1927 (2004).
  30. Nikolaev, A., et al. Network Adaptation Improves Temporal Representation of Naturalistic Stimuli in Drosophila Eye II Mechanisms. Plos One. 4, (2009).
  31. Land, M. F. Compound eye structure: Matching eye to environment. Adaptive Mechanisms in the Ecology of Vision. Springer. Netherlands. (1999).
  32. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. At&T Tech J. 27, 379-423 (1948).
  33. Niven, J. E., et al. The contribution of Shaker K+ channels to the information capacity of Drosophila photoreceptors. Nature. 421, 630-634 (2003).
  34. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. J Neurosci. 35, 2731-2746 (2015).
  35. Faivre, O., Juusola, M. Visual Coding in Locust Photoreceptors. Plos One. 3, e2173 (2008).
  36. Gonzalez-Bellido, P. T., Wardill, T. J., Juusola, M. Compound eyes and retinal information processing in miniature dipteran species match their specific ecological demands. P Natl Acad Sci USA. 108, 4224-4229 (2011).
  37. Juusola, M., Kouvalainen, E., Järvilehto, M., Weckström, M. Contrast Gain, Signal-to-Noise Ratio, and Linearity in Light-Adapted Blowfly Photoreceptors. J Gen Physiol. 104, 593-621 (1994).
  38. Juusola, M., Uusitalo, R. O., Weckstrom, M. Transfer of Graded Potentials at the Photoreceptor Interneuron Synapse. J Gen Physiol. 105, 117-148 (1995).
  39. Juusola, M., de Polavieja, G. G. The rate of information transfer of naturalistic stimulation by graded potentials. J Gen Physiol. 122, 191-206 (2003).
  40. Weckstrom, M., Kouvalainen, E., Juusola, M. Measurement of Cell Impedance in Frequency-Domain Using Discontinuous Current Clamp and White-Noise-Modulated Current Injection. Pflug Arch Eur J Phy. 421, 469-472 (1992).
  41. Juusola, M. Measuring Complex Admittance and Receptor Current by Single Electrode Voltage-Clamp. J Neurosci Meth. 53, 1-6 (1994).
  42. Juusola, M., Seyfarth, E. A., French, A. S. Rapid coating of glass-capillary microelectrodes for single-electrode voltage-clamp. J Neurosci Meth. 71, 199-204 (1997).
  43. Haag, J., Borst, A. Neural mechanism underlying complex receptive field properties of motion-sensitive interneurons. Nat Neurosci. 7, 628-634 (2004).
  44. Rien, D., Kern, R., Kurtz, R. Synaptic transmission of graded membrane potential changes and spikes between identified visual interneurons. Eur J Neurosci. 34, 705-716 (2011).
  45. Muller, A., et al. Switched single-electrode voltage-clamp amplifiers allow precise measurement of gap junction conductance. Am J Physiol-Cell Ph. 276, C980-C987 (1999).
  46. Polder, H. R., Swandulla, D., Konnerth, A., Lux, H. D. An Improved, High-Current Single Electrode Current Voltage Clamp System. Pflug Arch Eur J Phy. 402, R35-R35 (1984).
  47. Richter, D. W., Pierrefiche, O., Lalley, P. M., Polder, H. R. Voltage-clamp analysis of neurons within deep layers of the brain. J Neurosci Meth. 67, 121-131 (1996).
  48. Juusola, M., French, A. S. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron. 18, 959-968 (1997).
  49. Vähäsöyrinki, M., Niven, J. E., Hardie, R. C., Weckström, M., Juusola, M. Robustness of neural coding in Drosophila photoreceptors in the absence of slow delayed rectifier K+ channels. J Neurosci. 26, 2652-2660 (2006).
  50. Friederich, U., Coca, D., Billings, S., Juusola, M. Data Modelling for Analysis of Adaptive Changes in Fly Photoreceptors. Lect Notes Comput Sc. 5863, 34-48 (2009).
  51. Asyali, M. H., Juusola, M. Use of Meixner functions in estimation of Volterra kernels of nonlinear systems with delay. Ieee T Bio-Med Eng. 52, 229-237 (2005).
  52. French, A. S., et al. The Dynamic Nonlinear Behavior of Fly Photoreceptors Evoked by a Wide-Range of Light Intensities. Biophys J. 65, 832-839 (1993).
  53. Juusola, M., French, A. S. Visual acuity for moving objects in first- and second-order neurons of the fly compound eye. J Neurophysiol. 77, 1487-1495 (1997).
  54. Juusola, M., Weckstrom, M., Uusitalo, R. O., Korenberg, M. J., French, A. S. Nonlinear models of the first synapse in the light-adapted fly retina. J Neurophysiol. 74, 2538-2547 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics