एक सरल प्रवाह Cytometric विधि को मापने के लिए पूरे रक्त में Monocyte उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज तेज और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति

Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

Monocytes सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि रोगजनकों और कुछ जीर्ण सूजन रोगों के साथ जुड़े सूजन से सक्रिय किया जा सकता है। monocytes के एक्टिवेशन प्रेरक कार्यों और glycolytic चयापचय को ऑक्सीडेटिव से एक सहवर्ती बदलाव है कि बढ़ी हुई ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति के साथ है लाती है। इस वृद्धि की चयापचय glycolytic भी monocytes के प्रशिक्षित प्रतिरक्षा, जन्मजात रोग प्रतिरोधक स्मृति का एक फार्म के लिए मनाया जाता है। इन विट्रो प्रोटोकॉल monocytes द्वारा ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज की जांच वर्णित किया गया है हालांकि, कोई भी पूरे रक्त में मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह cytometry द्वारा जांच की गई है। हम कुल monocytes और शास्त्रीय (CD14 ++ CD16 -) द्वारा पूरे रक्त में ग्लूकोज फ्लोरोसेंट अनुरूप 2-NBDG तेज की माप के लिए एक बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric प्रोटोकॉल का वर्णन है, मध्यवर्ती (CD14 ++ CD16 +) और गैर-शास्त्रीय ( CD14 + CD16 ++) एककेंद्रकश्वेतकोशिकाउप-जनसंख्या। इस विधि homeostasis और सूजन की बीमारी के दौरान कुल monocytes और monocyte उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और आसानी से रक्त के भीतर अन्य ल्यूकोसाइट्स और ल्युकोसैट उप-जनसंख्या के लिए ग्लूकोज तेज की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

Monocytes मानव सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है कि तेजी से संक्रमण और सूजन 1 की साइटों के लिए जुटाए जाते हैं का एक प्रमुख घटक हैं। Monocytes के एक्टिवेशन रोगजनकों द्वारा तीव्र नुकसान को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह भी atherosclerosis 2, 3 कैंसर, एचआईवी और 4,5 सहित कई पुराने रोगों के रोगजनन के लिए केंद्रीय है।

आराम और सक्रिय monocytes की चयापचय नाटकीय रूप से आराम कर monocytes ऑक्सीडेटिव चयापचय के उपयोग और सक्रिय monocytes glycolytic चयापचय (यानी, ग्लूकोज के किण्वन लैक्टेट करने के लिए) के उपयोग के साथ अलग है, 6। Monocytes के एक्टिवेशन ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों कि glycolytic चयापचय 7 के लिए ग्लूकोज तेज वृद्धि की अनुमति देता है की अभिव्यक्ति लाती है। Monocyte ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 1 (Glut1) ऐसे ही एक ट्रांसपोर्टर के सक्रियण के दौरान upregulated है और इसकी अभिव्यक्ति वी में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन करने के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया हैitro और मोटापे से ग्रस्त चूहों 8 की वसा ऊतकों में। Kaposi सार्कोमा जुड़े herpesvirus द्वारा एक monocytic सेल लाइन के संक्रमण Glut1 9 के सेलुलर अपरेगुलेशन की ओर जाता है, और हम हाल ही में पता चला है कि पुरानी एचआईवी संक्रमण के दौरान Glut1 व्यक्त monocytes का एक बढ़ा प्रतिशत इलाज और संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी से इलाज संक्रमण 10 के दौरान मौजूद हैं। साथ में ले ली, इन अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लूकोज तेज और monocytes द्वारा glycolytic चयापचय कई भड़काऊ रोगों के महत्वपूर्ण पहलू हैं। इस प्रकार, एक सरल विधि homeostasis दौरान एककेंद्रकश्वेतकोशिका Glut1 अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज मापने के लिए और सूजन की बीमारी शोधकर्ताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोग की जा सकती है।

मानव monocytes विषम हैं, तीन अलग सबसेट है कि कोशिका की सतह मार्कर CD14 और CD16 11,12 के अंतर अभिव्यक्ति द्वारा जांच की जा सकती है शामिल किया जा रहा। शास्त्रीय monocytes CD14 के एक उच्च स्तर का इजहार लेकिन सीडी व्यक्त नहीं करते16 (CD14 ++ CD16 -), मध्यवर्ती monocytes CD14 के एक उच्च स्तर और CD16 (CD14 ++ CD16 +) के एक मध्यवर्ती स्तर, और गैर-शास्त्रीय monocytes CD14 का स्तर कम और CD16 के एक उच्च स्तर व्यक्त (CD14 का इजहार + CD16 ++)। Monocytes कि CD16 व्यक्त करते कहा जाता है CD16 + monocytes, जो CD16 की तुलना में - monocytes भड़काऊ साइटोकिन्स के उच्च अभिव्यक्ति और अधिक प्रभावी ढंग से वर्तमान एंटीजन 13,14 करने की क्षमता है। Monocytes के लगभग 10% सूजन 15 के दौरान मनाया उच्च प्रतिशत के साथ homeostasis दौरान CD16 व्यक्त करते हैं। Monocyte उप-जनसंख्या निश्चित रोग राज्यों के साथ जुड़े रहे हैं और रोग और रोग प्रगति 16 की उपयोगी जैविक मार्कर हो सकता है।

हमारा लक्ष्य एक तरीका है कि ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और मानव monocytes और के रूप में बनावट के करीब परिस्थितियों में monocyte उप-जनसंख्या द्वारा ग्लूकोज तेज उपाय कर सकते हैं की पहचान करने के लिए थासंभव के रूप में siological की स्थिति। पिछले अध्ययनों, मापा एककेंद्रकश्वेतकोशिका ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और ग्लूकोज तेज 17,18 हालांकि इन तरीकों से अलग-थलग monocytes कि शारीरिक शर्तों के 19 की तुलना में प्रोटीन अभिव्यक्ति बदल दिया है सकते हैं की जांच की, और कोई पिछले अध्ययन मानव monocyte उप-जनसंख्या की जांच की गई। पूरे unmanipulated रक्त के भीतर (CD14 और CD16 अभिव्यक्ति के आधार पर) बहु-पैरामीट्रिक फ्लो का उपयोग करना, हम ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप कुल monocytes और monocyte उप-जनसंख्या द्वारा 2-NBDG की तेज जांच के लिए एक विधि का वर्णन।

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Protocol

नोट: एचआईवी संक्रमित और एचआईवी असंक्रमित विषयों मेलबोर्न, विक, ऑस्ट्रेलिया में अल्फ्रेड अस्पताल में संक्रामक रोगों यूनिट से भर्ती थे, और क्रमशः स्थानीय समुदाय से। अवगत सहमति सभी प्रतिभागियों से प्राप्त हुई थी, और अनुसंधान अल्फ्रेड अस्पताल रिसर्च और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

पर monocytes और Monocyte उप-जनसंख्या 1. Glut1 कोशिका की सतह जांच

  1. साइट्रेट एसीडी-बी थक्कारोधी नलियों में रक्त एकत्र और संग्रह के 1 घंटा के भीतर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रयोगों शुरू करते हैं।
  2. polypropylene ट्यूबों के लिए रक्त के 100 μl जोड़ें। समाधान lysing 1x के 2 मिलीलीटर जोड़ें ट्यूबों के लिए (देखें सामग्री तालिका), जबकि बर्फ पर, pipetting धीरे मिश्रण करने के लिए। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 5 मिनट के लिए 220 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. छानना और लगभग 2-4 मिलीलीटर धोने समाधान (1x पीबीएस में 0.5% बीएसए) के जोड़ने और 5 मिनट के लिए 220 XG पर centrifuging द्वारा दो बार धोने।
  4. एक पाइप का प्रयोग करेंटीटीई ध्यान से संभव के रूप में धोने के समाधान के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए। प्लेस ट्यूबों बर्फ और पर धोने के समाधान के 100 μl में फिर से निलंबित।
  5. 5 μl विरोधी CD3 पीई, 5 μl विरोधी CD14 एपीसी, 5 μl विरोधी CD16-PECy7, 5 μl Glut1: विशिष्ट एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या 1.4 चरण में तैयार सेल निलंबन μl 100 प्रति एंटीबॉडी के निम्न मात्रा के साथ कोशिकाओं दाग की पहचान करने के लिए -FITC या IgG2b-FITC (निर्धारण नियंत्रण ट्यूब)।
  6. बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए रखें। धोने के समाधान के साथ 2 बार धोएं। 0.5% formaldehyde 1x पीबीएस में बनाया 200-300 μl के साथ ठीक करें।
  7. 24 घंटा के भीतर 4 रंगों पता लगाने में सक्षम एक प्रवाह cytometer निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के भीतर पर विश्लेषण करें: FITC (488, 530), पीई (488, 575), PECy7 (488, 780), एपीसी (633, 660) 10।

2. ग्लूकोज तेज Monocytes द्वारा

  1. खून की पिपेट 90 μl polypropylene ट्यूब में 1.1 कदम में एकत्र की। करने के लिए एक 14.60 सुक्ष्ममापी 2-NBDG काम कर समाधान के 10 μl जोड़ेरक्त के 90 μl (1.46 मिमी अंतिम एकाग्रता) और झटका धीरे मिश्रण करने के लिए। यह एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब कवर द्वारा प्रकाश में 2-NBDG जोखिम को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. 15-30 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और फिर तुरंत बर्फ पर जगह है। 1x FACS ट्यूबों का हल lysing जबकि बर्फ पर की 4 मिलीलीटर जोड़ें। 4 में 220 XG पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए सें।
  3. धोने समाधान (1x पीबीएस में 0.5% बीएसए) के 4 मिलीलीटर जोड़कर एक बार धो लें। 4 में 220 XG पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए सें। छानना और बर्फ पर जगह है।
  4. एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग: 5 μl विरोधी CD3 पीई, 5 μl विरोधी CD14 एपीसी और 5 μl विरोधी CD16-PECy7। मिक्स और अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है।
    नोट: इस अवधि के दौरान यकीन है कि प्रवाह कोशिकामापी तत्काल विश्लेषण के लिए तैयार है। निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के भीतर कोशिकाओं मोल: 2-NBDG (488, 530), पीई (488, 575), PECy7 (488, 780), एपीसी (633, 660)।
  5. ट्यूबों के लिए बर्फ का ठंडा धोने बफर (1x पीबीएस में 0.5% बीएसए) के 4 मिलीलीटर जोड़ें।4 में 220 XG पर centrifugation द्वारा एक बार धो 5 मिनट के लिए सें। छानना और बर्फ वर्ष पीबीएस के 200-300 μl जोड़ें और अंधेरे में बर्फ (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) पर रहते हैं। एक प्रवाह पर विश्लेषण कोशिकामापी 2.4 चरण में के रूप में उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेटिंग का उपयोग कर 10 मिनट के भीतर।

3. डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण

नोट: फ्लो और डेटा विश्लेषण का ज्ञान मान लिया जाता है।

  1. कम से कम 4-रंग विश्लेषण करने में सक्षम कोशिकामापी एक प्रवाह का उपयोग करना, बेदाग और व्यक्तिगत रूप से सना हुआ नमूने का उपयोग कर मुआवजा निर्धारित किया है।
    नोट: एकल धुंधला एक FITC लेबल CD4 और CD14 का उपयोग कर Glut1 और 2-NBDG मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. सेट अप और नमूने प्राप्त करने से पहले उपयुक्त Windows लेबल। एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी के चारों ओर एक फाटक ड्रा, और मध्यम दर पर नमूना प्रति 100,000 से 300,000 घटनाओं के अधिग्रहण। मुआवजा नमूना प्रति 50,000 घटनाओं के लिए पर्याप्त है।
    नोट: मुआवजा नमूना करने से पहले आयोजित किया जा सकताअधिग्रहण या एकल कोशिका विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, मानक प्रक्रियाओं का पालन।
  3. निर्यात और एक उचित स्थान में डेटा को बचाने के। ऐसे FlowJo या अन्य विश्लेषण सॉफ्टवेयर (पूरक चित्रा 1) और खींचें और ड्रॉप नमूने निर्दिष्ट (पूरक चित्रा 2) के रूप में के रूप में एकल कक्ष विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
  4. डबल फ़ाइल (पूरक चित्रा 3) खोलने के लिए क्लिक करें। गेट आगे के आधार पर monocytes और पक्ष तितर बितर गुण के रूप में चित्रा 1 ए और पूरक चित्रा 4 में दिखाया गया है करने के लिए एक चक्र ड्रा। डबल एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी क्लिक करें। ध्यान से देखें और CD3 के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित - जनसंख्या (पूरक चित्रा 4)।
  5. जनसंख्या - डबल CD3 क्लिक करें। निरीक्षण करने के लिए एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या 'एक्स' अक्ष पर चयन CD14 एपीसी, और CD16-PECy7 'y'- धुरी पर, और तदनुसार लेबल (पूरक चित्रा 5)।
  6. जहां कोई अलग देखते हैंसकारात्मक और नकारात्मक आबादी, विशिष्ट एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या में Glut1 की अभिव्यक्ति या 2-NBDG तेज मापने। निर्धारण और कोई 2-NBDG पृष्ठभूमि (पूरक चित्रा 6) को घटाकर Glut1 और 2-NBDG का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) निर्धारित करते हैं।
  7. कहाँ परिभाषित आबादी मौजूद हैं, गेट प्रतिशत सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 3) सेट, और निर्धारित करने के लिए IgG2b-FITC का उपयोग करें।
    नोट: कुल CD14 + monocytes विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करें। चूंकि 2-NBDG तेज आमतौर पर प्रतिदीप्ति में बदलाव के द्वारा चिह्नित है तीव्रता डेटा अच्छी एमएफआई और histograms का प्रतिनिधित्व करती है।

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Representative Results

मुआवजा प्रतिदीप्ति spillover को रोकने के लिए अलग-अलग fluorochromes के लिए किया जाना चाहिए। Monocytes पहले आगे और पक्ष बिखराव के आधार पर gating द्वारा समृद्ध कर रहे हैं। । जनसंख्या - प्रस्तुत भूखंडों में कम से कम छह स्वतंत्र छह या अधिक प्रतिभागियों से पूरे रक्त पर किए गए प्रयोगों के प्रतिनिधि के रूप में पहले से सूचना दी 10 चित्रा 1 ए CD3 भीतर gating द्वारा सेल बिखराव और टी कोशिकाओं के बहिष्कार से monocytes की प्रारंभिक gating चलता कर रहे हैं। Monocytes तब के रूप में चित्रा 1 बी और चित्रा 1C में दिखाया गया है, क्रमशः CD14 अभिव्यक्ति अकेले या कुल monocytes या monocyte उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए CD16 के साथ संयोजन में लिए gated हैं। - लगभग अधिक से अधिक सीडी 100 गुना व्यक्त करना चाहिए शास्त्रीय monocytes (CD14 ++ CD16): monocyte उप-जनसंख्या के विश्लेषण के लिए, के रूप में पहले 12 में वर्णित निम्न नामकरण लागू किया जाना चाहिए14 निर्धारण नियंत्रण और CD16 एमएफआई से एमएफआई निर्धारण नियंत्रण के लिए समान होना चाहिए; मध्यवर्ती monocytes (CD14 ++ CD16 +) व्यक्त करना चाहिए निर्धारण नियंत्रण की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक से अधिक CD14 एमएफआई और लगभग 10 गुना अधिक से अधिक CD16 एमएफआई निर्धारण नियंत्रण की तुलना में; गैर-शास्त्रीय monocytes (CD14 + CD16 ++) CD14 और निर्धारण नियंत्रण के लिए समान एमएफआई होना चाहिए और निर्धारण नियंत्रण की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक से अधिक CD16 एमएफआई। CD14 और CD16 की अभिव्यक्ति के बिना कोशिकाओं माना monocytes नहीं हैं और gating में शामिल नहीं किया जाना चाहिए। Gated monocytes या monocyte उप-जनसंख्या तो ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति के लिए जांच की जा सकती है। चित्रा 2 में संकेत दिया है, CD14 + Glut1 + monocytes की अलग आबादी एचआईवी + व्यक्तियों, जहां संक्रमण सूजन के एक जीर्ण राज्य की विशेषता है से प्राप्त कोशिकाओं में मनाया जा सकता है, सबसे विशेष रूप से। इसी लेकिन दुर्लभ CD14 + Glut1 + कोशिकाओं OBS हो सकता हैएचआईवी असंक्रमित व्यक्तियों (चित्रा 3 ए) में विशिष्ट एककेंद्रकश्वेतकोशिका सबसेट के भीतर erved, लेकिन एचआईवी + व्यक्तियों (चित्रा 3 बी) में और अधिक स्पष्ट कर रहे हैं। उल्लेखनीय है, अलग आबादी के अभाव में, इसका यह मतलब या मंझला पुष्पन तीव्रता है, जो ध्यान में Glut1 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति में संचयी वृद्धि के रूप में लेता परिणामों का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

ग्लूकोज तेज पूरे रक्त 2-NBDG या gated monocytes या monocyte उप-जनसंख्या के लिए वाहन पर नियंत्रण के साथ incubated की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। हम पहले से पता चला कि monocytes के लगभग 50% थे 2-NBDG एक 15 मिनट ऊष्मायन के बाद 10 सकारात्मक। इस तेज स्तर पर जब एककेंद्रकश्वेतकोशिका 2-NBDG तेज में मतभेद अब मौजूद नहीं हो सकता है, तक पहुँचने संतृप्ति के बिना 2-NBDG का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। एचआईवी असंक्रमित और एचआईवी + व्यक्तियों से monocytes द्वारा 2-NBDG तेज के विश्लेषण से एचआईवी + व्यक्तियों से कोशिकाओं द्वारा एक उच्च तेज से पता चला है जोGlut1 अभिव्यक्ति डेटा (- 5 चित्रा 4) के साथ समझौते में है। कुल मिलाकर, इन परिणामों के उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि assays यहाँ वर्णित संभावित जैविक संदर्भों कि जैसे मधुमेह, हृदय रोग, और वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण के रूप में एक भड़काऊ राज्य बटोर में monocyte चयापचय गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रतिनिधि एचआईवी और एचआईवी + रक्त के नमूनों से कुल monocytes और monocyte उप-जनसंख्या का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल की रणनीति Gating पूरे रक्त के नमूने संग्रह के 1 घंटे के भीतर एककेंद्रकश्वेतकोशिका कोशिका की सतह Glut1 अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। (ए) कोशिकाओं आगे और पक्ष बिखराव विशेषताओं और CD3 अभिव्यक्ति पर आधारित gated थे। (बी) के कुल monocytes की जांच करने के लिए, CD3 - कोशिकाओं को फिर CD14 अभिव्यक्ति के लिए gated थे। (सी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:।। प्रतिनिधि एचआईवी और एचआईवी + रक्त के नमूनों से कुल monocytes पर कोशिका की सतह Glut1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण एचआईवी असंक्रमित या एचआईवी संक्रमित उपचार भोले व्यक्तियों FITC लेबल निर्धारण नियंत्रण या Glut1 एंटीबॉडी के साथ दाग थे से CD14 + monocytes कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।


चित्रा 3:। प्रतिनिधि एचआईवी और एचआईवी + रक्त के नमूनों से एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या पर कोशिका की सतह Glut1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण Monocyte उप-जनसंख्या FITC लेबल निर्धारण नियंत्रण या (ए) एचआईवी असंक्रमित या (बी) एचआईवी संक्रमित उपचार भोले लिए Glut1 एंटीबॉडी के साथ दाग थे रक्त नमूने हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। + रक्त के नमूनों एचआईवी असंक्रमित या एचआईवी संक्रमित उपचार भोले व्यक्तियों से रक्त की कुल CD14 + प्रतिनिधि एचआईवी और एचआईवी से monocytes द्वारा 2-NBDG की तेज की एक अंतिम एकाग्रता में वाहन या 2-NBDG साथ incubated थाधोने से पहले 15 मिनट के लिए 1.46 सुक्ष्ममापी और चित्र 1 में वर्णित के रूप में गेट monocytes को कोशिका की सतह एंटीबॉडी के साथ incubating कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। प्रतिनिधि एचआईवी और एचआईवी + से एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या द्वारा 2-NBDG के तेज पूरे रक्त के नमूने एचआईवी असंक्रमित या एचआईवी संक्रमित उपचार भोले व्यक्तियों से रक्त 15 के लिए 1.46 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में वाहन या 2-NBDG साथ incubated था मिनट धोने से पहले और चित्र 1 में वर्णित के रूप में गेट एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या को कोशिका की सतह एंटीबॉडी के साथ incubating कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

together.within-पेज = "1"> Supp। आकृति 1
पूरक चित्रा 1:। सेल विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry के लिए कार्यक्षेत्र खिड़की को देखने या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supp। चित्र 2
पूरक चित्रा 2:। नमूना डेटा घसीटा और इस कार्यक्षेत्र में गिरा रहे हैं देख सकते हैं या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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पूरक चित्रा 3: कार्यक्षेत्र में नमूने, डेटा 085 डबल क्लिक किया जाता है, और एक दूसरी खिड़की के तीन प्रमुख सेल आबादी (लिम्फोसाइटों, monocytes और न्यूट्रोफिल) (एफएससी) आगे के आधार पर नए सिरे से पूरे रक्त के नमूने और पक्ष बिखराव के भीतर दिखा छपी (एसएससी) । देख सकते हैं या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supp। चित्रा 4
पूरक चित्रा 4: Monocytes आगे (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) के आधार पर gated हैं। जनसंख्या डबल क्लिक किया गया था जो एक नई विंडो लाया। एस (बाहर लिम्फोसाइट gating) CD3 'एक्स' अक्ष और CD3 नकारात्मक जनसंख्या पर चयन किया जाता थाचुने गए। देखने या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Supp। चित्रा 5
पूरक चित्रा 5: CD3 - एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी डबल क्लिक किया गया था जो एक नई विंडो जहां एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या CD16 और CD14 अभिव्यक्ति के आधार पर परिभाषित किया जा सकता लाया। कृपया यहाँ क्लिक करें देखने या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए।

Supp। चित्रा 6
पूरक चित्रा 6: Monocyte उप-जनसंख्या का चयन किया जाता है, और Glut1 कोशिका की सतह अभिव्यक्ति (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता: एमएफआई) हिस्टोग्राम खिड़की पर, 'जोड़ने के आँकड़े' विंडो से 'सांख्यिकी' का चयन 'मतलब', और 'पैरामीटर' से Glut1 का चयन करके प्राप्त की है ड्रॉप डाउन मेनू। देखने या इस अनुपूरक आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति और पूरे रक्त में monocyte और monocyte उप-जनसंख्या से फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप तेज की जांच के लिए एक सरल विधि का विवरण। पूरे रक्त में 2-NBDG तेज का आकलन करके, इस तकनीक को विवो में उन लोगों के लिए इसी तरह की स्थिति के लिए अनुमति देता है। पिछले एक अध्ययन घनत्व centrifugation 17 से पूरे रक्त से अलग monocytes में 6 NBDG तेज की जांच की। हालांकि, इस अध्ययन एककेंद्रकश्वेतकोशिका उप-जनसंख्या और पूरे रक्त से monocytes की जुदाई की जांच नहीं किया संभवतः कुछ कोशिका की सतह अणुओं 19 की अभिव्यक्ति बदल सकते हैं। रेडियोधर्मी ग्लूकोज ट्रेसर भी ग्लूकोज 20,21 के एककेंद्रकश्वेतकोशिका तेज मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन monocytes पहले इस विधि और रेडियोधर्मिता के उपयोग के लिए अलग किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता है। हमारी प्रोटोकॉल दिनचर्या जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करता है और न्यूनतम जोड़ तोड़ रहा है, इस प्रकार 2-NBDG के प्रवाह cytometric माप के लिए अनुमति देता हैmonocytes और monocyte उप-जनसंख्या विवो परिस्थितियों में नकल उतार द्वारा तेज।

2-NBDG glycolytic मार्ग में प्रवेश करती है और गैर फ्लोरोसेंट अणुओं 22 में कोशिकाओं द्वारा metabolized होना दिखाया गया है। इसलिए, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा कोशिकाओं रखकर चयापचय 2-NBDG के बाद ऊष्मायन सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है। 6-NBDG एक और फ्लोरोसेंट ग्लूकोज अनुरूप है कि इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह कम उपयोगी है, क्योंकि यह glycolytic मार्ग प्रवेश नहीं करता है और इसलिए सही कोशिकाओं 23 के bioenergetic स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करता।

स्पेक्ट्रा ओवरलैपिंग के साथ fluorochromes उपयोग किया जाता है, तो मुआवजा fluorochrome spillover को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है। इस प्रोटोकॉल में हम CD14 और CD16 के साथ व्यक्तिगत रूप से सना हुआ मुआवजा मानकों को स्थापित करने के लिए monocytes उपयोग करें, लेकिन कोशिका की सतह मार्कर का मुआवजा भी मुआवजा मोतियों का उपयोग किया जा सकता है।

Granulocytes CD16 व्यक्त कर सकते हैं, लेकिन बाहर gating से बाहर रखा जा सकताCD15 व्यक्त कोशिकाओं। हालांकि, प्रकाश तितर बितर गुणों के आधार पर granulocytes की संख्या को सीमित कर सकते हैं monocytes के कड़े gating विश्लेषण में शामिल थे। अगर एक प्रवाह कोशिकामापी अधिक चैनलों के साथ एक उपलब्ध है, granulocyte मार्कर CD66b भी विश्लेषण से granulocytes बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस अध्ययन में इस्तेमाल Glut1 एंटीबॉडी एक कोशिका की सतह मिलान को बांधता है और इसलिए intracellular Glut1 करने के लिए बाध्य नहीं है। एक एंटीबॉडी है कि एक intracellular Glut1 मिलान करने के लिए बांध की कुल Glut1 एककेंद्रकश्वेतकोशिका अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कोशिकाओं 10 धुंधला करने से पहले permeabilized किया जाना चाहिए। monocytes के अलावा, इस तकनीक ग्लूकोज तेज और रक्त के भीतर पाया अन्य ल्यूकोसाइट्स में चयापचय की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम बड़े पैमाने पर 2-NBDG के टी सेल तेज की जांच की है यहाँ वर्णित विधि का उपयोग कर, और भी एन.के. कोशिकाओं 24 से 2-NBDG तेज की जांच की है। Glut1 अभिव्यक्ति और 2-NBDG तेज की सफल पता लगाने के लिए यह सीमा के लिए जरूरी हैप्रोटोकॉल के अनुसार अतिरिक्त धोने बफर के साथ कोशिकाओं को धोने से लाल रक्त कोशिका lysis बफर के निशान, और हमने पाया कि FITC या एपीसी लेबल Glut1 एंटीबॉडी पीई या PerCP conjugates की तुलना में बेहतर संकेत दे। हम इस के लिए कारणों की जांच नहीं की है।

चूंकि कोशिकाओं कम तापमान पर भी पाचन सक्रिय हैं, यह महत्वपूर्ण है कि 37 में 2-NBDG ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस, कि ट्यूब बर्फ और centrifugation पर सीधे रखा जाता है 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजन किया। अनुपस्थिति मजबूत 2-NBDG संकेत में, जाँच करें कि सही एकाग्रता इस्तेमाल किया जा रहा है, कमरे और पन्नी के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट और कवर ट्यूब में प्रकाश जोखिम को कम जब उचित हो। अनुकूलन के लिए 5, 15, 20, 30, 60, और 90 मिनट के लिए एक समय के पाठ्यक्रम 2-NBDG तेज प्रयोग की स्थापना द्वारा आवश्यक हो सकता है। आमतौर पर, इष्टतम समय, 10-60 मिनट होना चाहिए प्रकार की कोशिकाओं और उनके सक्रियण स्थिति पर निर्भर करता है।

2-NBDG तेज परख के साथ एक प्रमुख सीमा प्रकाश Sens हैएक साथ तथ्य यह है कि यह कोशिकाओं द्वारा उपयोग किया जा रहा है साथ itivity। इस प्रकार यह सुनिश्चित करने के लिए है कि पिछले नमूना पहले एक के 30 मिनट के भीतर विश्लेषण किया है नमूनों की संख्या को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक जैविक सीमा यह है कि, भले ही nonclassical monocytes पर Glut1 व्यक्त nonclassical monocytes, और Glut1 अभिव्यक्ति की आवृत्ति शास्त्रीय monocytes की तुलना में काफी अधिक थे, कोई मतभेद दो उप-जनसंख्या 10 के बीच 2-NBDG तेज में ही अस्तित्व में है। यह संभावना है कि इस तरह के Glut3 और Glut4 के रूप में अन्य Gluts व्यक्त पर monocytes विभिन्न रोग सेटिंग्स में ग्लूकोज चयापचय में शामिल किया जा सकता है उठाती है। यह भी संभव है कि Glut1 की गतिविधि भी translationally विनियमित किया जा सकता पोस्ट।

रेडियो आइसोटोप लेबलिंग पर हमारे प्रवाह cytometric ग्लूकोज तेज प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ की पहचान करने और smal में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट उप-जनसंख्या का अध्ययन करने के immunophenotypic विश्लेषण के साथ तकनीक गठबंधन करने की क्षमता हैखून की मात्रा एल। इसके अलावा एपीसी संयुग्मित विरोधी Glut1 एक साथ Glut1 सेल सतह अभिव्यक्ति और 2-NBDG तेज विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। कारण 2-NBDG को तेज Glut1 अभिव्यक्ति में एक परिवर्तन पहले से नहीं प्रदर्शित किया गया है, लेकिन इस संभावना से इंकार नहीं किया जा सकता है।

वृद्धि ग्लूकोज तेज और प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा चयापचय सक्रिय टी कोशिकाओं और monocytes 25-27 की एक बानगी है। इन कोशिकाओं को इस तरह के एक प्रकार का वृक्ष 30-32, और मोटापे और मधुमेह 8,33 तरह स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के रूप में की स्थिति में संक्रमण 28,29, और भड़काऊ संकेतों पैथोजन के जवाब में सक्रिय हो सकता है। वृद्धि ग्लूकोज चयापचय भी कैंसर सेल अस्तित्व, विकास और मेटास्टेसिस 34 के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चयापचय अनियंत्रण एचआईवी संक्रमण की एक बानगी के रूप में उभरा है, और प्रतिरक्षा सक्रियण 24, सूजन 10, और संक्रामकता सीडी 4+ टी कोशिकाओं 35-37 के साथ जुड़ा हुआ है। इसलिए,इस विधि भड़काऊ मध्यस्थता रोग, कैंसर, संक्रामक रोगों, इम्यूनोलॉजी और immunometabolism 38 में एक ब्याज के साथ उन सहित एक विविध दर्शकों के लिए ब्याज की हो जाएगा।

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Acknowledgements

इस शोध एचआईवी और हेपेटाइटिस विषाणु विज्ञान अनुसंधान एड्स अनुसंधान के लिए वाशिंगटन सेंटर के विश्वविद्यालय (CFAR), पुरस्कार नंबर AI027757 के तहत एक एनआईएच वित्त पोषित कार्यक्रम के लिए जो समर्थन किया है से (ACH 2) और एक 2010 विकास अनुदान (CNIHR) के लिए ऑस्ट्रेलियाई केन्द्र द्वारा वित्त पोषित किया गया निम्नलिखित एनआईएच संस्थानों और केन्द्रों (NIAID, NCI, NiMH, Nida, NICHD, NHLBI, एनआईए) द्वारा। सीएसपी CNIHR और ACH 2 अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है। एसएमसी ऑस्ट्रेलिया (NHMRC) प्रिंसिपल रिसर्च फैलोशिप के एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के एक प्राप्तकर्ता है। लेखकों कृतज्ञता बर्नेट इंस्टीट्यूट द्वारा प्राप्त विक्टोरियन परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम के इस काम के लिए अपने योगदान को स्वीकार करते हैं। हम प्रशिक्षण और तकनीकी सलाह प्रवाह cytometry के लिए AMREP से फ्लो कोर सुविधा से Geza Paukovic और ईवा Orlowski-ओलिवर की सहायता स्वीकार करते हैं। हम मीडिया कोचिंग और वीडियो शूट के संगठन के लिए एंगस मॉर्गन धन्यवाद। हमारे आभारजेसी मेसन और जेहाद अब्दुलअजीज लालकृष्ण Alzahrani करने के लिए वीडियो शूट के दौरान प्रयोगशाला सहायता के लिए। हम मेडिकल साइंसेज, UNSW, ऑस्ट्रेलिया जो महत्वपूर्ण पद्धति की पेशकश की सलाह के स्कूल में डॉ डेविड सिमर के प्रयासों धन्यवाद। सीएसपी को धन्यवाद देना चाहूंगा www.nice-consultants.com ग्राफिक विचार-विमर्श के लिए।

'लेखक योगदान:

सीएसपी परियोजना की कल्पना की, डिजाइन और किए गए प्रयोगों, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या की, और पांडुलिपि लिखा था। JJA डेटा की व्याख्या की और पांडुलिपि लिखा था। TRB पांडुलिपि लिखा था। झामुमो व्याख्या डेटा, महत्वपूर्ण बौद्धिक सुझाव दिए, और पांडुलिपि की समीक्षा की। एसएमसी व्याख्या डेटा, महत्वपूर्ण सुझाव दिए बौद्धिक और पांडुलिपि की समीक्षा की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

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