A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod

1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Monocytter er medfødte immunceller, der kan aktiveres af patogener og inflammation forbundet med visse kroniske inflammatoriske sygdomme. Aktivering af monocytter inducerer effektorfunktioner og en ledsagende forskydning fra oxidativ til glycolytisk metabolisme, der er ledsaget af forøget glucosetransporter ekspression. Denne øgede glykolytisk stofskifte er også observeret for uddannet immunitet af monocytter, en form for medfødt immunologisk hukommelse. Selv om in vitro-protokoller undersøger glucosetransporter ekspression og glukoseoptagelse af monocytter er blevet beskrevet, er ingen blevet gennemgået af multi-parametrisk flowcytometri i fuldblod. Vi beskriver en multi-parametrisk flowcytometrisk protokol til måling af fluorescerende glucoseanalog 2-NBDG optagelse i fuldblod med total monocytter og den klassiske (CD14 ++ CD16 -), mellemprodukt (CD14 ++ CD16 +) og ikke-klassisk ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulationer. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge glucosetransporter ekspression og glucoseoptagelse for totale monocytter og monocyt subpopulationer under homeostase og inflammatorisk sygdom, og kan let modificeres til at undersøge glucoseoptagelse til andre leukocytter og leukocytsubpopulationer inden blod.

Introduction

Monocytter er en vigtig del af den menneskelige medfødte immunsystem, der hurtigt mobiliseres til steder med infektion og inflammation 1. Aktivering af monocytter er kritisk for begrænsning akut skade ved patogener og er også central til patogenesen af flere kroniske sygdomme, herunder aterosklerose 2, kræft 3, og HIV 4,5.

Metabolismen af hvilende og aktiverede monocytter adskiller sig dramatisk, med hvilende monocytter udnytte oxidativ metabolisme og aktiverede monocytter udnytte glykolytisk metabolisme (dvs. gæring af glukose til lactat) 6. Aktivering af monocytter inducerer ekspressionen af glukose transportører, der giver mulighed for øget glukoseoptagelse for glykolytisk stofskifte 7. Monocyt glucosetransporter 1 (Glut1) er en sådan transportør opreguleres under aktivering og dets ekspression er blevet vist at føre til produktion af proinflammatoriske cytokiner i vitro og i fedtvæv af fede mus 8. Infektion af en monocytisk cellelinie ved Kaposis sarkom associeret herpesvirus fører til cellulær opregulering af Glut1 9, og vi viste for nylig, at en øget andel af Glut1 udtrykker monocytter under kronisk HIV-infektion er til stede under ubehandlet og antiretroviral kombinationsbehandling-behandlet infektion 10. Tilsammen viser disse undersøgelser, at glukoseoptagelse og glykolytisk metabolisme ved monocytter er vigtige aspekter af mange inflammatoriske sygdomme. Således at en simpel metode måle monocyt Glut1 ekspression og glucoseoptagelse under homøostase og inflammatorisk sygdom vil sandsynligvis være til nytte for en bred vifte af forskere.

Humane monocytter er heterogene, bliver består af tre adskilte delmængder, der kan undersøges ved differentiel udtryk for celleoverflademarkører CD14 og CD16 11,12. Klassiske monocytter udtrykker et højt niveau af CD14, men ikke udtrykker CD16 (CD14 ++ CD16 -), mellemliggende monocytter udtrykker et højt niveau af CD14 og en mellemliggende niveau af CD16 (CD14 ++ CD16 +), og ikke-klassisk monocytter udtrykker et lavt niveau af CD14 og et højt niveau af CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocytter, som udtrykker CD16, betegnes CD16 + monocytter, hvilket sammenlignet med CD16 - monocytter har høj ekspression af inflammatoriske cytokiner og evnen til mere effektivt at præsentere antigener 13,14. Ca. 10% af monocytter udtrykker CD16 under homeostase med højere procenter observeret under inflammation 15. Monocyt subpopulationer er forbundet med visse sygdomstilstande og kunne være nyttige biologiske markører for sygdom og sygdomsprogression 16.

Vores mål var at identificere en metode, der kan måle glucosetransporter ekspression og glukoseoptagelse af humane monocytter og monocyt-subpopulationer i forhold så tæt på PHYsiological betingelser som muligt. Tidligere undersøgelser målte monocyt glukose transportør udtryk og glukoseoptagelse 17,18, selvom disse metoder undersøgt isolerede monocytter, der kan have ændret protein-ekspression i forhold til fysiologiske forhold 19, og ingen tidligere undersøgelse har undersøgt humane monocyt subpopulationer. Brug multi-parametrisk flowcytometri, beskriver vi en metode til at undersøge glukose transportør udtryk og optagelse af det fluorescerende glukose analog 2-NBDG med total monocytter og monocyt subpopulationer (baseret på CD14 og CD16-ekspression) inden hele umanipulerede blod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: HIV-smittede og HIV-inficerede forsøgspersoner blev rekrutteret fra den infektionssygdomme Unit på The Alfred Hospital i Melbourne, VIC, Australien, og fra det lokale samfund, hhv. Informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere, og den forskning, blev godkendt af Research og etiske komité The Alfred Hospital.

1. Glut1 Cell Surface Detection på monocytter og Monocyt subpopulationer

  1. Saml blod i citrat ACD-B antikoagulerende rør og begynde eksperimenterne i et biologisk sikkerhedsskab inden for 1 time for indsamlingen.
  2. Tilsæt 100 pi blod til polypropylenrør. Der tilsættes 2 ml 1x lyserende opløsning (se Materialer tabel) til rør, mens på is, pipettering forsigtigt for at blande. Der inkuberes i 15 minutter på is. Centrifuger ved 220 xg i 5 min.
  3. Dekanteres og vaskes to gange ved at tilsætte ca. 2-4 ml vaskeopløsning (0,5% BSA i 1X PBS) og centrifugering ved 220 xg i 5 min.
  4. Brug et rørtte til forsigtigt at fjerne så meget af vaskeopløsningen som muligt. Rørene anbringes på is og resuspender i 100 pi vaskeopløsning.
  5. For at identificere specifikke monocyt subpopulationer pletten celler med følgende mængde af antistoffer pr 100 pi cellesuspension forberedt i trin 1.4: 5 pi anti-CD3-PE, 5 pi anti-CD14-APC, 5 pi anti-CD16-PECy7, 5 pi Glut1 FITC eller IgG2b-FITC (isotypekontrol rør).
  6. Anbring på is i 30 minutter i mørke. Vask 2 gange med vaskeopløsning. Fix med 200-300 pi på 0,5% formaldehyd lavet i 1x PBS.
  7. Analyser på et flowcytometer stand til at detektere 4 farver inden 24 timer inden for følgende excitation og emission bølgelængde: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. glucoseoptagelse af monocytter

  1. Pipette 90 ul blod opsamles i trin 1.1 i polypropylen-rør. Tilsæt 10 pi af en 14,60 uM 2-NBDG brugsopløsning tilde 90 pi af blod (1,46 mM slutkoncentration) og svirp forsigtigt for at blande. Det er afgørende at begrænse 2-NBDG udsættelse for lys ved at dække rør med aluminiumsfolie.
  2. Der inkuberes ved 37 ° C i mørke i 15-30 minutter og derefter straks placere på is. Tilsæt 4 ml 1x FACS lyserende løsning på rør, mens på is. Centrifuger ved 220 xg ved 4 ° C i 5 min.
  3. Der vaskes én gang ved tilsætning af 4 ml vaskeopløsning (0,5% BSA i 1X PBS). Centrifuger ved 220 xg ved 4 ° C i 5 min. Dekanteres og sted på is.
  4. Farv celler med antistoffer: 5 pi anti-CD3-PE, 5 pi anti-CD14-APC og 5 pi anti-CD16-PECy7. Bland og anbring på is i 30 minutter i mørke.
    BEMÆRK: I denne periode skal du sørge flowcytometeret er klar til øjeblikkelig analyse. Anskaf celler i følgende excitation og emission bølgelængde: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Tilsæt 4 ml iskold vaskebuffer (0,5% BSA i 1X PBS) til rør.Der vaskes én gang ved centrifugering ved 220 xg ved 4 ° C i 5 min. Dekanteres og tilsæt 200-300 pi af is gamle PBS og holde på is i mørke (dækket med alufolie). Analyser på et flowcytometer inden for 10 minutter under anvendelse af excitations- og emissionsbølgelængden indstilling som i trin 2.4.

3. dataopsamling og analyse

BEMÆRK: Kendskab til flowcytometri og dataanalyse antages.

  1. Brug af et flowcytometer stand til mindst 4-farve-analyse, indstille kompensation ved hjælp ufarvede og individuelt farvede prøver.
    BEMÆRK: Single farvning under anvendelse af et FITC-mærket CD4 og CD14 kan anvendes til Glut1 og 2-NBDG kompensation.
  2. Opsætning og mærke passende vinduer, inden du overfører prøver. Tegn en gate omkring monocyt befolkning, og erhverve 100.000 til 300.000 events per prøve ved middel hastighed. 50.000 begivenheder pr kompensation prøve er tilstrækkelig.
    BEMÆRK: Erstatning kan udføres før prøveerhvervelse eller i enkelt celle analyse software, ifølge standardprocedurer.
  3. Eksport og gemme data i en passende placering. Åbne op enkelt celle analyse software såsom FlowJo eller anden analyse software (Supplemental figur 1) og træk og slip prøver som angivet (Supplemental figur 2).
  4. Dobbeltklik for at åbne filen (Supplemental figur 3). Tegn en cirkel for at gate monocytter baseret på forward og side scatter egenskaber som vist i figur 1A og supplerende Figur 4. Dobbeltklik på monocyt befolkning. Observere og tegne en boks rundt om CD3 - befolkning (Supplemental figur 4).
  5. Dobbeltklik på CD3 - befolkning. At observere monocyt subpopulationer vælge CD14-APC på "x" aksen, og CD16-PECy7 om »y'- akse, og mærke i overensstemmelse hermed (Supplemental figur 5).
  6. Hvor der er ingen tydeligpositive og negative populationer, måle ekspressionen af ​​Glut1 eller 2-NBDG optagelse i de specifikke monocyt subpopulationer. Bestemme de gennemsnitlige fluorescensintensiteter (MFI) på Glut1 og 2-NBDG ved subtraktion af isotype og ingen 2-NBDG baggrund (Supplemental figur 6).
  7. Når der findes definerede befolkningsgrupper, bruge IgG2b-FITC at indstille porten, og bestemme de procentvise positive celler (figur 3).
    BEMÆRK: Brug denne procedure til at analysere de samlede CD14 + monocytter. Siden 2-NBDG optagelse normalt er præget af et skift i fluorescensintensiteter dataene bedst repræsenteret af MFI og histogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erstatning skal udføres for individuelle fluorokromer at forhindre fluorescens spillover. Monocytter først beriget ved gating baseret på forward og sidespredning. Plottene præsenterede er repræsentanter for mindst seks uafhængige forsøg udført på helblod fra seks eller flere deltagere som tidligere rapporteret 10 Figur 1A viser den oprindelige gating af monocytter efter celle scatter og udelukkelse af T-celler ved gating i CD3 -. Befolkning. Monocytter derefter gated for CD14-ekspression alene eller i kombination med CD16 til identifikation samlede monocytter eller monocyt-subpopulationer, som vist i figur 1B og 1C, hhv. Til analyse af monocyt-subpopulationer, bør den følgende nomenklatur blive anvendt som tidligere beskrevet 12: klassiske monocytter (CD14 ++ CD16 -) bør udtrykke ca. 100 gange større CD14 MFI end isotypekontrol og CD16 MFI bør svare til den isotypekontrol; mellemliggende monocytter (CD14 ++ CD16 +) bør udtrykke ca. 100 gange større CD14 MFI end isotypekontrol og ca. 10 gange større CD16 MFI sammenlignet med isotype kontrol; ikke-klassiske monocytter (CD14 + CD16 ++) have tilsvarende MFI for CD14 og isotypekontrol og ca. 100 gange større CD16 MFI end isotypekontrol. Celler uden udtryk for CD14 og CD16 ikke for at være monocytter og bør ikke indgå i gating. Gated monocytter eller monocyt subpopulationer kan derefter undersøges for glucose transporter udtryk. Som angivet i figur 2, kan der observeres forskellige populationer af CD14 + Glut1 + monocytter, især i celler opnået fra HIV + individer, hvor infektionen er kendetegnet ved en kronisk tilstand af betændelse. Lignende, men sjældne CD14 + Glut1 + celler kan være observed inden for specifikke monocyt delmængder i HIV-inficerede personer (figur 3A), men er mere udtalt hos HIV + individer (figur 3B). Bemærkelsesværdige, i mangel af forskellige populationer, kan det være hensigtsmæssigt at repræsentere resultaterne som middel eller median fluorescens intensiteter, som tager hensyn til den samlede stigning i Glut1 celleoverfladen udtryk.

Glucoseoptagelse kan vurderes ved at sammenligne fuldblod inkuberet med 2-NBDG eller kontrol for gated monocytter eller monocyt-subpopulationer køretøj. Vi har tidligere vist, at ca. 50% af monocytter var 2-NBDG positiv efter en 15 minutters inkubation 10. Denne optagelse niveau giver mulighed for påvisning af 2-NBDG uden at nå mætning, når forskelle i monocyt 2-NBDG optagelse, ikke længere eksisterer. Analyse af to-NBDG optagelse af monocytter fra HIV-inficerede og HIV + personer afslørede en højere optagelse af celler fra HIV + personer, derer i overensstemmelse med de Glut1 udtryk data (Figur 4 - 5). Samlet set illustrerer disse resultater, at de her beskrevne assays kan anvendes til potentielt studere monocyt metaboliske aktiviteter i biologiske sammenhænge som fremkalder en inflammatorisk tilstand, såsom diabetes, hjerte-kar-sygdomme og virale og bakterielle infektioner.

figur 1
Figur 1:. Gating strategi, der anvendes til at analysere de samlede monocytter og monocyt-subpopulationer fra repræsentative HIV- og HIV + blodprøver Prøver af helblod blev analyseret ved flowcytometri for monocyt celleoverfladen Glut1 ekspression inden for 1 time af samlingen. (A) Celler blev gated baseret på forward og side scatter egenskaber og CD3 udtryk. (B) For at undersøge det samlede monocytter, CD3 - celler blev derefter gated for CD14-ekspression. (C klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:.. Analyse af celleoverfladen Glut1 udtryk på de samlede monocytter fra repræsentative hiv- og HIV + blodprøver CD14 + monocytter fra HIV-inficeret eller HIV-smittede behandling naive personer blev farvet med FITC-mærket isotypekontrol eller Glut1 antistof Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 3:. Analyse af celleoverflade Glut1 ekspression på monocyt-subpopulationer fra repræsentative HIV og HIV + blodprøver Monocyt subpopulationer blev farvet med FITC-mærket isotype kontrol eller Glut1 antistof til (A) HIV-inficerede eller (B) HIV-inficerede behandling naive blodprøver. klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Optagelse af 2-NBDG med total CD14 + monocytter fra repræsentative HIV og HIV + blod blodprøver fra HIV-inficerede eller HIV-inficerede behandling naive personer blev inkuberet med vehikel eller 2-NBDG ved en endelig koncentration på1,46 uM i 15 min før vask og inkubering med celleoverflade antistoffer mod gate monocytter som beskrevet i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Optagelse af 2-NBDG af monocyt-subpopulationer fra repræsentative HIV og HIV + fuldblodsprøver Blod fra HIV-inficerede eller HIV-inficerede behandling naive personer blev inkuberet med vehikel eller 2-NBDG i en slutkoncentration på 1,46 mM i 15 min før vask og inkubering med celleoverflade antistoffer mod gate monocyt subpopulationer som beskrevet i figur 1. klik her for at se en større version af dette tal.

together.within-side = "1"> Supp. figur 1
Supplerende Figur 1:. Workspace vindue til flowcytometri celle analyse software Klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

Supp. Figur 2
Supplerende Figur 2:. Sample data trækkes og slippes ind i denne arbejdsområde Klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Supplerende Figur 3: Prøver i arbejdsområdet, data 085 er dobbelt klikket, og et andet vindue fremkom der viser de tre store cellepopulationer (lymfocytter, monocytter og neutrofiler) inden for frisk fuldblod prøve baseret på forward (FSC) og sidespredning (SSC) . klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

Supp. Figur 4
Supplerende Figur 4: Monocytter gated baseret på forward (FSC) og sidespredning (SSC). Befolkningen blev dobbelt klikkede som bragte et nyt vindue. CD3 er valgt på "x" aksen og CD3-negative population (gating ud lymfocytter) blev svalgt. Klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

Supp. Figur 5
Supplerende Figur 5: CD3 - monocyt befolkning blev dobbelt klikkede som bragte et nyt vindue, hvor monocyt delpopulation kunne defineres på grundlag af CD16 og CD14-ekspression. Klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

Supp. Figur 6
Supplerende Figur 6: Monocyte subpopulationer vælges, og Glut1 celleoverfladeekspression (gennemsnitlig fluorescensintensitet: MFI) opnås ved at vælge statistik på histogrammet vinduet, "gennemsnitlig" fra 'add statistikker «vindue, og vælge Glut1 fra" parameteren' drop down menuen. klik her for at se eller downloade denne supplerende tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her i detaljer en simpel metode til at undersøge glucosetransporter ekspression og fluorescerende glucose analog optagelse af monocyt- og monocyt-subpopulationer i fuldblod. Ved at vurdere 2-NBDG optagelse i fuldblod, denne teknik giver mulighed for betingelser svarende til dem in vivo. En tidligere undersøgelse undersøgte 6-NBDG optagelse i monocytter separeret fra helblod ved densitetscentrifugering 17. Men denne undersøgelse ikke undersøge monocyt subpopulationer og separation af monocytter fra helblod kan potentielt ændre ekspression af visse celleoverflademolekyler 19. Radioaktive glucose sporstoffer er også blevet anvendt til at måle monocyt optagelse af glucose 20,21, men monocytter skal tidligere isoleret i denne fremgangsmåde og anvendelse af radioaktivitet kræver betydelige sikkerhedsforanstaltninger. Vores protokollen bruger rutinemæssige biosikkerhed procedurer og er minimalt manipulerende, hvilket giver mulighed for at flowcytometrisk måling af 2-NBDGoptagelse af monocytter og monocyt subpopulationer efterligner in vivo betingelser.

2-NBDG kommer ind i glycolytiske vej og har vist sig at blive metaboliseret af celler i ikke-fluorescerende molekyler 22. Derfor er det afgørende at begrænse metabolisme efter 2-NBDG inkubering ved at holde celler nedkølet ved 4 ° C. 6-NBDG er en anden fluorescerende glukose analog, der kan bruges, men det er mindre nyttigt, da det ikke ind i glycolytiske vej og derfor ikke præcist afspejler bioenergetic status af cellerne 23.

Hvis fluorochromer med overlappende spektre udnyttes, kompensation bliver kritisk for at forhindre fluorokrom afsmitning. I denne protokol, bruger vi monocytter farvet individuelt med CD14 og CD16 til at indstille kompensation parametre, men kompensation for celleoverflademarkører kan også udføres ved hjælp af kompensation perler.

Granulocytter kan udtrykke CD16 men kan udelukkes ved gating udCD15-udtrykkende celler. Imidlertid stringent gating af monocytter baseret på lysspredningsegenskaber kan begrænse antallet af granulocytter inkluderet i analysen. Hvis et flowcytometer er en tilgængelig med flere kanaler, kan den granulocyt markør CD66b også anvendes til at udelukke granulocytter fra analysen.

Den Glut1 antistof anvendt i denne undersøgelse binder til en celleoverflade-epitop og derfor ikke binder til intracellulære Glut1. Et antistof der binder til en intracellulær Glut1 epitop, kan anvendes til at måle total Glut1 monocyt ekspression, men celler skal permeabiliseret før farvning 10. Ud over monocytter, kan denne teknik anvendes til at undersøge glucoseoptagelse og metabolisme hos andre leukocytter inden blod. Vi har udførligt undersøgt T-celle optag af 2-NBDG anvendelse af metoden beskrevet her, og har også undersøgt 2-NBDG optagelse ved NK-celler 24. For vellykkede påvisning af Glut1 udtryk og 2-NBDG optagelse er det bydende nødvendigt at begrænsespor af røde blodlegemer lysisbuffer ved vask celler med overskydende vaskebuffer i henhold til protokollen, og vi fandt, at FITC eller APC-mærket Glut1 antistof give bedre signaler end PE eller PerCP konjugater. Vi har ikke undersøgt årsagerne til dette.

Eftersom cellerne er metabolisk aktive selv ved lave temperaturer, er det afgørende, at efter 2-NBDG inkubation ved 37 ° C, at rørene holdes direkte på is og centrifugering udføres ved 4 ° C. I mangel stærke 2-NBDG signal, skal du kontrollere, at den korrekte koncentration bliver brugt, reducere lyseksponering i rummet og biosikkerhed kabinet og dække rør med folie når det er hensigtsmæssigt. Optimering kan være påkrævet ved at oprette et tidsforløb 2-NBDG optagelse eksperiment i 5, 15, 20, 30, 60, og 90 min. Typisk bør optimale tidspunkt være 10-60 min, afhængig af celletyper og deres aktiveringsstatus.

En væsentlig begrænsning med 2-NBDG uptake assay er lette sensitivity sammen med det faktum, at det bliver udnyttet af cellerne. Det er derfor vigtigt at begrænse antallet af prøver for at sikre, at den sidste prøve analyseres inden for 30 min af den første. En biologisk begrænsning er, at, selv om hyppigheden af Glut1-udtrykkende ikke-klassiske monocytter, og Glut1 ekspression på ikke-klassiske monocytter var signifikant større end klassiske monocytter, fandtes ingen forskel i 2-NBDG optagelse mellem de to subpopulationer 10. Dette rejser muligheden for, at andre gluts, såsom Glut3 og GLUT4 udtrykt på monocytter kan være involveret i glukosemetabolismen i forskellige sygdomstilstande. Det er også muligt, at aktiviteten af ​​Glut1 også kan reguleres efter translatorisk.

En stor fordel ved vores flowcytometrisk glukoseoptagelse protokollen over radioisotop mærkning er evnen til at kombinere teknik med immunfænotypisk analyse for at identificere og studere specifikke subpopulationer af immunceller i small volumen blod. Desuden kan påføres APC-konjugeret anti-Glut1 til samtidigt at analysere Glut1 celleoverfladeekspression og 2-NBDG optagelse. En ændring i Glut1 udtryk på grund af 2-NBDG optagelse er ikke tidligere blevet påvist, men denne mulighed kan ikke udelukkes.

Øget glucoseoptagelse og metabolisme ved immunceller er kendetegnende for aktiverede T-celler og monocytter 25-27. Disse celler kan aktiveres som reaktion på patogeninfektion 28,29, og inflammatoriske signaler i forhold såsom autoimmune sygdomme som lupus 30-32, og fedme og diabetes 8,33. Øget glukosemetabolismen er også påkrævet for kræft celle overlevelse, vækst og metastase 34. Især har metabolisk dysregulation i immunceller dukket op som et kendetegn for HIV-infektion, og er forbundet med immunaktivering 24, inflammation 10, og infektivitet af CD4 + -T-celler 35-37. Derfor,denne metode vil være af interesse for et mangfoldigt publikum, herunder dem med en interesse i inflammatoriske medierede sygdomme, cancer, infektionssygdomme, immunologi og immunometabolism 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Denne forskning blev finansieret af den australske Center for HIV og Hepatitis Virologi Research (ACH 2) og en 2010 udviklingsmæssig tilskud (CNIHR) fra University of Washington Center for AIDS Research (CFAR), en NIH finansieret program under award nummer AI027757 som støttes således NIH institutter og centre (NIAID, NCI, NIMH, Nida, NICHD, NHLBI, NIA). CSP er en modtager af CNIHR og ACH 2 tilskud. SMC er en modtager af en National Health og Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Forfatterne takker bidraget til dette arbejde af den victorianske Operationel Support Infrastructure Program modtaget af Burnet Institute. Vi anerkender bistand fra Geza Paukovic og Eva Orlowski-Oliver fra AMREP flowcytometri Core Facility for flowcytometri uddannelse og teknisk rådgivning. Vi takker Angus Morgan for medier coaching og organisering af videoen skyde. Vores taknemmelighedtil Jesse Masson og Jehad Abdulaziz K. Alzahrani for lab bistand under videooptagelse. Vi takker de bestræbelser Dr. David Simar ved School of Medical Sciences, UNSW, Australien, der tilbydes kritisk metodologisk rådgivning. CSP takker www.nice-consultants.com til grafiske konsultationer.

Forfatternes BIDRAG:

CSP udtænkt projektet, designet og udført eksperimenter, analyseret og fortolket data, og skrev manuskriptet. JJA fortolket data og skrev manuskriptet. TRB skrev manuskriptet. JMM fortolket data, lavet kritiske intellektuelle forslag, og revideret manuskriptet. SMC fortolket data, lavet kritiske intellektuelle forslag og revideret manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics