Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Monocyten zijn aangeboren immuuncellen die kan worden geactiveerd door pathogenen en ontsteking geassocieerd met bepaalde chronische ontstekingsziekten. Activatie van monocyten induceert effectorfuncties en een gelijktijdige verschuiving van oxidatieve naar glycolytische stofwisseling die gepaard gaat met verhoogde glucose transporter expressie. Deze verhoogde glycolytische stofwisseling wordt ook waargenomen voor de geoefende immuniteit van monocyten, een vorm van aangeboren immunologisch geheugen. Hoewel in vitro onderzoek protocollen glucose transporter expressie en glucose opname door monocyten zijn beschreven, zijn geen onderzocht door multi-parametrische flowcytometrie in volbloed. We beschrijven een multi-parametrische flowcytometrische protocol voor het meten van fluorescentie glucose analoge 2-NBDG opname in volbloed door totale monocyten en de klassieke (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke ( CD14 + CD16 ++) monocytsubpopulaties. Deze methode kan worden gebruikt om glucose transporter expressie en glucoseopname voor totale monocyten en monocyt subpopulaties bij homeostase en ontstekingsziekten onderzocht en kunnen eenvoudig worden aangepast om glucoseopname andere leukocyten en leukocyten subpopulaties binnen bloed onderzocht.

Introduction

Monocyten zijn een belangrijk onderdeel van de menselijke aangeboren immuunsysteem die snel gemobiliseerd naar plaatsen van infectie en ontsteking 1. Activatie van monocyten is kritisch voor het beperken van acute schade door ziekteverwekkers en is centraal in de pathogenese van een aantal chronische ziekten, waaronder atherosclerose 2, 3 kanker, HIV en 4,5.

Het metabolisme van rustende en geactiveerde monocyten verschilt dramatisch, met rustende monocyten gebruik oxidatief metabolisme en geactiveerde monocyten gebruikmaking glycolytische stofwisseling (dwz fermentatie van glucose tot lactaat) 6. Activatie van monocyten induceert expressie van glucose transporters die zorgt voor verhoogde glucoseopname voor glycolytische stofwisseling 7. Monocyt glucose transporter 1 (GLUT1) is een dergelijke transporteur opgereguleerd tijdens activatie en zijn expressie is aangetoond dat leidt tot de productie van pro-inflammatoire cytokines in vitro en in vetweefsel van obese muizen 8. Infectie van een monocytische cellijn door Kaposi-sarcoom geassocieerd herpesvirus leidt tot cellulaire opregulatie van GLUT1 9, en we onlangs bleek dat tijdens chronische hiv-infectie een verhoogd percentage van GLUT1 uitdrukken monocyten tijdens onbehandeld en antiretrovirale therapie behandeld infectie 10 aanwezig zijn. Samengevat, deze studies tonen aan dat glucose en glycolytische metabolisme door monocyten zijn belangrijke aspecten van vele ontstekingsziekten. Dus een eenvoudige methode om monocyten GLUT1 expressie en glucose meten die homeostase en ontstekingsziekte waarschijnlijk van nut zijn voor een groot aantal onderzoekers.

Menselijke monocyten zijn heterogeen, wordt samengesteld uit drie verschillende subsets die door differentiële expressie van het celoppervlak markers CD14 en CD16 11,12 kunnen worden onderzocht. Classical monocyten drukken een hoog niveau van CD14, maar niet uit te drukken CD16 (CD14 ++ CD16 -), tussenproduct monocyten een hoog niveau van CD14 en een tussenliggend niveau van CD16 (CD14 ++ CD16 +) en niet-klassieke monocyten een lage CD14 en een hoog niveau van CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyten die CD16 tot expressie zogenaamde CD16 + monocyten, die vergeleken met CD16 - monocyten hoge expressie van inflammatoire cytokines en het vermogen om beter te presenteren antigenen 13,14. Ongeveer 10% van de monocyten CD16 tijdens homeostase met hogere percentages waargenomen gedurende 15 inflammatie. Monocyt subpopulaties houden bepaalde ziektetoestanden en mogelijk bruikbare biologische markers van de ziekte en ziekteprogressie 16.

Ons doel was om een ​​methode die glucose transporter expressie en glucose-opname door humane monocyten en monocyt subpopulaties onder omstandigheden zo dicht mogelijk bij phy kan meten identificerensiological voorwaarden mogelijk. Eerdere studies gemeten monocyten glucose transporter expressie en opname van glucose 17,18, hoewel deze methoden geïsoleerde monocyten die kunnen hebben veranderd eiwitexpressie in vergelijking met fysiologische omstandigheden 19 onderzocht, en geen eerdere studie heeft de menselijke monocyten subpopulaties onderzocht. Gebruik van multi-parametrische flowcytometrie beschrijven we een werkwijze glucose transporter expressie en opname van de fluorescente glucose analoge 2-NBDG van totale monocyten en monocyt subpopulaties onderzocht (op basis van CD14 en CD16 expressie) binnen het gehele ongemanipuleerd bloed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: HIV-geïnfecteerde en HIV-geïnfecteerde patiënten werden gerekruteerd uit de Infectious Diseases Unit van The Alfred Hospital in Melbourne, VIC, Australië en uit de lokale gemeenschap, respectievelijk. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers, en het onderzoek werd goedgekeurd door het Comité Alfred Hospital Research and Ethics.

1. GLUT1 celoppervlak Detection op monocyten en monocyt subpopulaties

  1. Het verzamelen van bloed in citraat ACD-B antistollingsmiddel buizen en beginnen de experimenten in een biologisch veiligheidskabinet binnen 1 uur van de collectie.
  2. Voeg 100 pl bloed polypropyleenbuizen. Voeg 2 ml van 1x lyserende oplossing (zie Materials Table) buizen, terwijl op ijs, pipetteren voorzichtig te mengen. Incubeer gedurende 15 min op ijs. Centrifugeer bij 220 xg gedurende 5 minuten.
  3. Decanteren en tweemaal wassen met ongeveer 2-4 ml wasoplossing (0,5% BSA in 1x PBS) toevoegen en centrifugeren bij 220 g gedurende 5 min.
  4. Gebruik een pijptte voorzichtig verwijderen zoveel mogelijk van de wasoplossing mogelijk. Plaats de buisjes op ijs en opnieuw te schorten in 100 pl wasoplossing.
  5. Identificeren specifieke monocyten subpopulaties vlekken cellen met de volgende hoeveelheid antilichamen per 100 gl celsuspensie bereid in stap 1.4: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC, 5 pl anti-CD16-PECy7, 5 gl GLUT1 FITC of IgG2b-FITC (isotype controle tube).
  6. Plaats op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Was 2 maal met wasoplossing. Vast met 200-300 gl 0,5% formaldehyde in 1 x PBS.
  7. Analyseren op een flowcytometer opsporen van 4 kleuren binnen 24 uur in de volgende excitatie- en emissiegolflengte: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. glucoseopname door Monocyten

  1. Pipetteer 90 ul van bloed verzameld in stap 1.1 in polypropyleen buizen. Voeg 10 ul van een 14,60 pM 2-NBDG werkoplossingde 90 pl bloed (1,46 mM uiteindelijke concentratie) en flick voorzichtig te mengen. Het is cruciaal om 2-NBDG blootstelling aan licht te beperken door het bedekken buizen met aluminiumfolie.
  2. Incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 15-30 minuten en daarna onmiddellijk plaats op ijs. Voeg 4 ml 1x FACS lyserende oplossing voor buizen terwijl op ijs. Centrifugeer bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Was eenmaal door toevoeging van 4 ml wasoplossing (0,5% BSA in 1 x PBS). Centrifugeer bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Giet en leg ze op ijs.
  4. Vlek cellen met antilichamen: 5 pl anti-CD3-PE, 5 pl anti-CD14-APC en 5 pl anti-CD16-PECy7. Meng en plaats op ijs gedurende 30 minuten in het donker.
    LET OP: In deze periode ervoor te zorgen dat de flowcytometer is direct klaar voor analyse. Het verwerven van cellen in de volgende excitatie en emissie golflengte: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Voeg 4 ml ijskoude wasbuffer (0,5% BSA in 1x PBS) buizen.Was eenmaal door centrifugatie bij 220 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Giet en voeg 200-300 ul ijs oude PBS en blijf op ijs in het donker (bedekt met aluminiumfolie). Analyseren op een flowcytometer binnen 10 min met behulp van excitatie- en emissiegolflengte instelling als in stap 2,4.

3. Data Acquisition and Analysis

OPMERKING: Kennis van flowcytometrie en gegevensanalyse verondersteld.

  1. Met een flow cytometer kan tenminste 4-kleuranalyse, ingesteld compensatie behulp ongekleurd en gekleurd individueel monsters.
    OPMERKING: Single kleuring met een FITC-gemerkt CD4 en CD14 kunnen worden gebruikt voor GLUT1 en 2-NBDG compensatie.
  2. Opzetten en label passende ramen vóór het verwerven van monsters. Teken een hek rond de monocyten populatie, en het verwerven van 100.000 tot 300.000 gebeurtenissen per monster bij gemiddelde tarief. 50.000 evenementen per compensatie monster is voldoende.
    OPMERKING: Compensatie kan voorafgaand worden uitgevoerd om te proevenverwerving of in single cell analyse software, volgens standaardprocedures.
  3. Export en gegevens op te slaan in een geschikte locatie. Openstellen single cell analyse software zoals FlowJo of andere analyse software (Aanvullende Figuur 1) en drag-and-drop monsters als beschreven (Supplemental figuur 2).
  4. Dubbelklik op het bestand (Aanvullende figuur 3) te openen. Teken een cirkel poort monocyten gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen zoals getoond in figuur 1A en figuur 4 Supplemental. Dubbelklik op de monocyten populatie. Observeer en teken een kader rond de CD3 - populatie (Supplemental figuur 4).
  5. Dubbelklik op het CD3 - bevolking. Om te observeren de monocyten subpopulaties selecteren CD14-APC op de 'x-as, en CD16-PECy7 op de' y'- as, en dienovereenkomstig te etiketteren (Aanvullende Figuur 5).
  6. Indien er geen duidelijkepositieve en negatieve populaties, het meten van de expressie van GLUT1 of 2-NBDG opname in het specifieke monocyten subpopulaties. Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI) van GLUT1 en 2-NBDG door het aftrekken van het isotype en geen 2-NBDG achtergrond (Supplemental figuur 6).
  7. Wanneer gedefinieerde populaties bestaan, gebruikt de IgG2b-FITC aan de gate stellen en bepaal het percentage positieve cellen (figuur 3).
    LET OP: Gebruik deze procedure om de totale CD14 + monocyten te analyseren. Aangezien 2-NBDG opname doorgaans wordt gekenmerkt door een verschuiving in fluorescentie intensiteiten gegevens blijkt het best uit MFI en histogrammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Compensatie moet worden uitgevoerd voor individuele fluorochromen fluorescentie spillover voorkomen. Monocyten worden eerst verrijkt door venstertijd gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. De plots gepresenteerde vertegenwoordigers van ten minste zes onafhankelijke experimenten uitgevoerd op volbloed dat bij zes of meer deelnemers zoals eerder beschreven 10 Figuur 1A toont de eerste gating van monocyten door cel verstrooiing en uitsluiting van T-cellen door het poorten in de CD3 -. Bevolking. Monocyten worden vervolgens omheind voor CD14 expressie alleen of in combinatie met CD16 aan totale monocyten of monocyt subpopulaties identificeren als getoond in figuur 1B en figuur 1C, respectievelijk. Voor analyse van monocyt subpopulaties, dient de volgende nomenclatuur worden toegepast zoals eerder beschreven 12: klassieke monocyten (CD14 ++ CD16 -) tot expressie moet ongeveer 100-voudig groter CD14 MFI dan isotype controle en CD16 MFI moet vergelijkbaar zijn met de isotype controle zijn; tussenproduct monocyten (CD14 ++ CD16 +) tot expressie moet ongeveer 100-voudig groter is dan de CD14 MFI isotype controle en dus ongeveer 10 maal hoger CD16 MFI vergeleken met het isotype controle; niet-klassieke monocyten (CD14 + CD16 ++) moet ongeveer gelijk MFI-have voor CD14 en de isotype controle en ongeveer 100-voudig groter CD16 MFI dan de isotype controle. Cellen zonder expressie van CD14 en CD16 niet beschouwd als monocyten en mag niet worden opgenomen in gating. Gated monocyten of monocyten subpopulaties kan vervolgens worden onderzocht op glucose transporter expressie. Zoals aangegeven in figuur 2, kunnen verschillende populaties van CD14 + monocyten GLUT1 + worden waargenomen, met name in cellen verkregen van HIV + individuen, waarbij infectie wordt gekenmerkt door een chronische toestand van ontsteking. Vergelijkbare maar zeldzame CD14 + GLUT1 + cellen kunnen obs zijnerved binnen specifieke monocyten subsets in HIV-geïnfecteerde personen (Figuur 3A), maar groter in HIV + individuen (Figuur 3B). Opmerkelijk, in de afwezigheid van verschillende populaties, kan het aangewezen om de resultaten als gemiddelde of de mediaan fluorescentie intensiteiten, waarbij rekening wordt gehouden met de cumulatieve stijging van GLUT1 celoppervlak expressie vertegenwoordigen.

Glucose opname kan worden beoordeeld door volbloed geïncubeerd met 2-NBDG of dragercontrole voor gated monocyten of monocyt subpopulaties. We toonden eerder aan dat ongeveer 50% van de monocyten 2-NBDG positief na 15 minuten incubatie 10. Deze opname niveau zorgt voor detectie van 2-NBDG zonder het bereiken van verzadiging, als de verschillen in monocyten 2-NBDG opname kan niet meer bestaan. Analyse van de 2-NBDG opname door monocyten van HIV-geïnfecteerde en HIV + personen bleek een hogere opname door cellen van HIV + personen, dieis in overeenstemming met de GLUT1 expressie data (Figuur 4-5). Kortom, deze resultaten illustreren dat de hier beschreven assays kunnen gebruikt worden om mogelijk te bestuderen monocyten metabolische activiteiten in biologische contexten die een ontstekingstoestand opwekken zoals diabetes, hart- en vaatziekten en virale en bacteriële infecties.

Figuur 1
Figuur 1:. Gating strategie gebruikt om totale monocyten en monocyt subpopulaties van representatieve HIV- en HIV + bloedmonsters analyse Monsters van totaal bloed werden geanalyseerd door flow cytometrie monocyten celoppervlak GLUT1 expressie in 1 uur verzameld. (A) cellen werden gated op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen en CD3 expressie. (B) Het totale monocyten te onderzoeken, CD3 - cellen werden vervolgens afgesloten voor CD14 expressie. (C klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:.. Analyse van het celoppervlak GLUT1 uitdrukking op de totale monocyten uit representatieve HIV- en HIV + bloedmonsters CD14 + monocyten van HIV-geïnfecteerde of HIV-geïnfecteerde behandelingsnaïeve personen werden gekleurd met FITC-gelabelde isotype controle of GLUT1 antilichaam Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 3:. Analyse celoppervlak GLUT1 expressie op monocyten subpopulaties van representatieve HIV- en HIV + bloedmonsters monocyten subpopulaties werden gekleurd met FITC-gelabelde isotype controle of GLUT1 antilichaam voor (A) HIV-geïnfecteerde of (B) HIV-geïnfecteerde behandelingsnaïeve bloedmonsters. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4:. Opname van 2-NBDG door totale CD14 + monocyten bij representatieve HIV- en HIV + bloedmonsters Bloed uit HIV-geïnfecteerde of HIV-geïnfecteerde eerder behandelde personen werd geïncubeerd met vehikel of 2-NBDG bij een uiteindelijke concentratie van1,46 uM gedurende 15 minuten vóór het wassen en incubatie met celoppervlak antilichamen tegen gate monocyten, zoals beschreven in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5:. Opname van 2-NBDG door monocyt subpopulaties van representatieve HIV- en HIV + complete bloedmonsters Bloed uit HIV-geïnfecteerde of HIV-geïnfecteerde eerder behandelde personen werd geïncubeerd met vehikel of 2-NBDG bij een uiteindelijke concentratie van 1,46 mM tot 15 min voor het wassen en incubatie met celoppervlak antilichamen tegen gate monocyten subpopulaties, zoals beschreven in figuur 1. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

together.within-page = "1"> Supp. Figuur 1
Aanvullende Figuur 1:. Workspace window voor flowcytometrie cell analyse software Klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

Supp. Figuur 2
Aanvullende Figuur 2:. Sample gegevens worden gesleept in deze werkruimte Klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Bijkomende Figuur 3: Monsters werkruimte data 085 wordt aangeklikt, en een tweede venster verscheen met de drie grote celpopulaties (lymfocyten, monocyten en neutrofielen) in de vers volbloed monster op basis van voorwaartse (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) . klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

Supp. figuur 4
Aanvullende Figuur 4: Monocyten zijn gated gebaseerd op vooruit (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). De bevolking werd dubbel geklikt, die een nieuw venster opgevoed. CD3 is geselecteerd op de 'x' as en CD3-negatieve populatie (gating uit lymfocyten) werd sverkozen. Klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

Supp. figuur 5
Aanvullende Figuur 5: De CD3 - monocyten populatie werd dubbel geklikt, die een nieuw venster geopend, waar monocyten subpopulatie kan worden gedefinieerd op basis van CD16 en CD14 expressie gebracht. Klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

Supp. figuur 6
Aanvullende Figuur 6: Monocyte subpopulaties worden geselecteerd en GLUT1 celoppervlak-expressie (gemiddelde fluorescentie-intensiteit: MFI) wordt verkregen door het selecteren van 'statistieken' op het histogram venster, 'gemiddelde' van het venster 'add statistieken', en GLUT1 selecteren uit het 'parameter' drop down menu. klik hier om te bekijken of te downloaden van deze aanvullende figuur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven protocol Gegevens een eenvoudige methode om glucose transporter expressie en fluorescerende glucose analoge opname door monocyten en monocyt subpopulaties in volbloed onderzocht. Door beoordeling 2-NBDG opname in volbloed, deze techniek maakt soortgelijke omstandigheden als in vivo. Een eerdere studie onderzocht 6-NBDG opname in monocyten gescheiden van volbloed door dichtheidscentrifugatie 17. Echter, deze studie niet onderzocht monocyten subpopulaties en scheiding van monocyten uit vol bloed kan mogelijk veranderen expressie van bepaalde celoppervlak moleculen 19. Radioactieve glucose tracers zijn ook gebruikt om monocyten opname van glucose 20,21 meten, maar monocyten moet vooraf worden geïsoleerd voor deze methode en gebruik van radioactiviteit vereist aanzienlijke veiligheidsmaatregelen. Ons protocol maakt gebruik van routine bioveiligheid procedures en is minimaal manipulatief, waardoor voor de flowcytometrische meting van 2-NBDGopname door monocyten en monocyt subpopulaties nabootsen in vivo omstandigheden.

2-NBDG komt glycolytische routes en blijkt te metaboliseren door cellen in niet-fluorescerende moleculen 22. Daarom is het essentieel om het metabolisme na 2-NBDG incubatie beperken door hem cellen gekoeld tot 4 ° C. 6-NBDG is een fluorescent glucose analogon dat kan worden gebruikt, maar is minder geschikt als het niet glycolytische routes voeren en dus niet exact de bio-energetische status van de cellen 23.

Als fluorochromen met overlappende spectra worden gebruikt, een vergoeding wordt van cruciaal belang voor fluorochroom spillover voorkomen. In dit protocol gebruiken we monocyten individueel gekleurd met CD14 en CD16 op schadevergoeding parameters in te stellen, maar de beloning van celoppervlak markers kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van compensatie kralen.

Granulocyten kan CD16 uitdrukken, maar kan worden uitgesloten door gating uitCD15 tot expressie brengen. Echter, strenge gating van monocyten op basis van lichtverstrooiing eigenschappen kan het aantal granulocyten te beperken in de analyse opgenomen. Als een stroomcytometer is een beschikbaar meer kanalen, kan de granulocyt marker CD66b ook worden gebruikt voor granulocyten uit de analyse uitgesloten.

De GLUT1 antilichaam dat bij deze studie bindt aan een celoppervlak epitoop en daarom niet bindt aan intracellulaire GLUT1. Een antilichaam dat bindt aan een intracellulair GLUT1 epitoop kan worden gebruikt om de totale GLUT1 monocyten expressie te meten, waarbij cellen worden permeabel voor kleuring 10. Naast monocyten, kan deze techniek gebruikt worden om glucoseopname en metabolisme van andere leukocyten binnen bloed onderzocht. We hebben uitgebreid onderzocht T-cel opname van 2-NBDG met behulp van de hier beschreven methode, en hebben ook onderzocht 2-NBDG opname door NK-cellen 24. Voor een succesvolle detectie van GLUT1 expressie en 2-NBDG opname is het noodzakelijk te beperkensporen van de rode bloedcel lysis buffer door het wassen van de cellen met een overmaat wasbuffer volgens het protocol, en we vonden dat FITC of APC-gelabeld GLUT1 antilichaam geven een betere signalen dan PE of PerCP conjugaten. We hebben geen onderzoek gedaan naar de redenen hiervoor.

Omdat cellen metabolisch actief, zelfs bij lage temperaturen, is het belangrijk dat na de 2-NBDG incubatie bij 37 ° C, dat buizen direct op ijs en centrifugatie worden bewaard uitgevoerd bij 4 ° C. Bij het ontbreken sterke 2-NBDG signaal, controleer dan of de juiste concentratie wordt gebruikt, te verminderen blootstelling aan licht in de kamer en bioveiligheid kast en deksel buizen met folie indien nodig. Optimalisatie kan, door instellen van een tijdsverloop 2-NBDG opname experiment 5, 15, 20, 30, 60 en 90 min. Normaal gesproken moet optimale tijd 10-60 min, afhankelijk van celtypen en hun activeringsstatus.

Een belangrijke beperking met de 2-NBDG opname test is licht sensItivity samen met het feit dat het wordt gebruikt door de cellen. Dus is het belangrijk om het aantal monsters beperken zodat het laatste monster geanalyseerd binnen 30 minuten van de eerste. Een biologische beperking is dat, hoewel de frequentie van GLUT1-expressie nonclassical monocyten en GLUT1 uitdrukking op nonclassical monocyten significant groter dan klassieke monocyten, geen verschillen bestaan ​​in 2-NBDG opname tussen de twee subpopulaties 10. Dit verhoogt de mogelijkheid dat andere Restjes zoals GLUT-3 en Glut4 expressie gebracht op monocyten kunnen betrokken zijn bij het glucosemetabolisme in verschillende settings ziekte. Het is ook mogelijk dat de activiteit van GLUT1 ook translatie worden gereguleerd paal.

Een groot voordeel van onze flowcytometrische glucoseopname protocol via radioisotoop labeling is de mogelijkheid om de techniek te combineren met immunophenotypic analyse specifieke subpopulaties van immuuncellen in smal identificeren en bestuderenl volume van het bloed. Bovendien kan de APC-geconjugeerd anti-GLUT1 worden toegepast om gelijktijdig analyseren GLUT1 celoppervlak expressie en 2-NBDG opname. Een verandering in GLUT1 expressie door 2-NBDG opname is niet eerder aangetoond, maar dit kan niet worden uitgesloten.

Verhoogde glucoseopname en metabolisme door immuuncellen is een kenmerk van geactiveerde T-cellen en monocyten 25-27. Deze cellen kunnen worden geactiveerd in reactie op infectie 28,29, en inflammatoire signalen pathogeen aandoeningen zoals auto-immuunziekten zoals lupus 30-32 en obesitas en diabetes 8,33. Verhoogd glucose metabolisme is ook vereist voor kankercellen overleving, groei en metastase 34. Met name metabolische ontregeling in immuuncellen naar voren gekomen als een kenmerk van HIV-infectie, en wordt geassocieerd met activering van het immuunsysteem 24, 10 ontsteking en infectiviteit van CD4 + T-cellen 35-37. daaromdeze methode zal van belang zijn voor een divers publiek, waaronder mensen met een interesse in inflammatoir gemedieerde ziekten, kanker, infectieziekten, immunologie en immunometabolism 38 zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Australische Centrum voor HIV en Hepatitis Virologie Research (ACH 2) en een 2010 ontwikkelingsstoornissen subsidie ​​(CNIHR) van de Universiteit van Washington Center for AIDS Research (CFAR), een NIH gefinancierd programma onder award nummer AI027757 die wordt ondersteund door de volgende NIH Institutes en Centers (NIAID, NCI, NIMH, Nida, NICHD, NHLBI, NIA). CSP is een ontvanger van de CNIHR en ACH 2 subsidie. SMC is een ontvanger van een National Health en Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. De auteurs zeer erkentelijk voor de bijdrage aan het werk van het Victoriaanse operationele infrastructuur Support Program door de Burnet Institute ontvangen. Wij erkennen de hulp van Geza Paukovic en Eva Orlowski-Oliver uit de AMREP Flow Cytometry Core Faciliteit voor flowcytometrie training en technisch advies. Wij danken Angus Morgan voor media-coaching en organisatie van de video shoot. onze dankJesse Masson en Jehad Abdulaziz K. Alzahrani voor lab begeleiding tijdens de video shoot. Wij danken de inspanningen van Dr. David Simar aan de School of Medical Sciences, UNSW, Australië die kritisch methodologisch advies aangeboden. CSP danken www.nice-consultants.com voor grafische overleg.

AUTEURS 'BIJDRAGE:

CSP bedacht het project, ontworpen en experimenten, geanalyseerd en geïnterpreteerd data, en schreef het manuscript. JJA geïnterpreteerd gegevens en schreef het manuscript. TRB schreef het manuscript. JMM geïnterpreteerd data, maakte kritische intellectuele suggesties, en het manuscript beoordeeld. SMC interpreteren van gegevens, maakte kritische intellectuele suggesties en het manuscript beoordeeld.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
  2. Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
  3. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and macrophages in cancer: development and functions. Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).
  4. Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART. J Immunol Res. 2014, 569819 (2014).
  5. Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis. EBioMedicine. (2016).
  6. Cheng, S. C., et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 345, 1250684 (2014).
  7. Maratou, E., et al. Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells. Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).
  8. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).
  9. Gonnella, R., et al. Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line. J Exp Clin Cancer Res. 32, 79 (2013).
  10. Palmer, C. S., et al. Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects. J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118, e16-e31 (2011).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116, e74-e80 (2010).
  13. Belge, K. U., et al. The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF. J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).
  14. Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis. Blood. 87, 373-377 (1996).
  15. Ziegler-Heitbrock, L. The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation. J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).
  16. Ziegler-Heitbrock, L. Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases. Springer. 3-36 (2014).
  17. Dimitriadis, G., et al. Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry. Cytometry A. 64, 27-33 (2005).
  18. Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation. Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).
  19. Stibenz, D., Buhrer, C. Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures. Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).
  20. Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst. Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).
  21. Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation). Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).
  22. Yoshioka, K., et al. A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).
  23. Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes. Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).
  24. Palmer, C. S., et al. Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection. AIDS. 28, 297-309 (2014).
  25. Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Frontiers in immunology. 6, (2015).
  26. Palmer, C. S., et al. Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells. International reviews of immunology. 1-12 (2015).
  27. Palmer, C. S., Crowe, S. M. How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection? AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).
  28. McFadden, K., et al. Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).
  29. Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice. Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).
  30. Yin, Y., et al. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. Journal of immunology. 80-90 (2016).
  31. Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis research & therapy. 17, 29 (2015).
  32. Yin, Y., et al. Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus. Science translational medicine. 7, 274ra218 (2015).
  33. Barbera Betancourt, A., et al. Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production. PloS one. 11, e0146516 (2016).
  34. Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment. Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).
  35. Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells. Retrovirology. 11, 98 (2014).
  36. Taylor, H. E., et al. Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication. PLoS Pathog. 11, e1004864 (2015).
  37. Loisel-Meyer, S., et al. Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).
  38. Palmer, C. S., et al. Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure. J Immunol. 196, (11), 4437-4444 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics