Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

Monozyten sind angeborene Immunzellen, die mit bestimmten chronischen entzündlichen Erkrankungen durch Pathogene und Entzündung aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Monozyten induziert Effektorfunktionen und eine damit einhergehende Verlagerung von oxidativem zu glycolytic Stoffwechsel, die durch eine erhöhte Glukosetransporter-Expression begleitet wird. Diese erhöhte Glykolyse-Stoffwechsel ist auch für geübte Immunität von Monozyten, eine Form der angeborenen immunologischen Gedächtnisses beobachtet. Obwohl in vitro - Protokolle Glukosetransporters - Expression und die Glucoseaufnahme durch Monozyten untersucht wurden beschrieben, keines hat durch Mehr parametrischer Durchflusszytometrie in Vollblut untersucht. Wir beschreiben eine Multi-Parameter durchflusszytometrischen Protokoll für die Messung von fluoreszierender Glucoseanalog 2-NBDG Aufnahme in Vollblut durch Total Monozyten und der klassischen (CD14 ++ CD16 -), intermediäre (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen ( CD14 + CD16 ++) monocyteSubpopulationen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme für insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen während Homöostase und entzündliche Erkrankungen zu untersuchen, und kann leicht die Glukoseaufnahme modifiziert werden Subpopulationen für andere Leukozyten und Leukozyten im Blut zu untersuchen.

Introduction

Monozyten sind ein wichtiger Bestandteil der menschlichen angeborenen Immunsystems , die 1 bis Stellen der Infektion und Entzündung schnell mobilisiert werden. Aktivierung von Monozyten ist entscheidend für die Begrenzung akuten Schädigung durch Pathogene und auch von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von verschiedenen chronischen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 2, Krebs 3 und HIV 4,5.

Der Stoffwechsel von ruhenden und aktivierten Monozyten unterscheidet sich dramatisch, mit ruhenden Monozyten oxidativen Stoffwechsel zu nutzen und aktivierten Monozyten unter Verwendung von glykolytischen Metabolismus (dh Vergärung von Glukose zu Laktat) 6. Die Aktivierung von Monozyten induziert die Expression von Glucose - Transporter , die 7 für eine erhöhte Glukoseaufnahme für glykolytischen Stoffwechsel ermöglicht. Monozyt Glukosetransporter 1 (GLUT1) ist ein solcher Transporter nach oben reguliert während der Aktivierung und seine Expression wurde auf die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen in v zu führen gezeigtITRO und im Fettgewebe von fettleibigen Mäusen 8. Die Infektion einer monozytären Zelllinie durch das Kaposi - Sarkom assoziierten Herpes - Virus führt zu zellulären upregulation von GLUT1 9, und wir haben kürzlich gezeigt , dass während der chronischen HIV - Infektion eine erhöhte Anteil an GLUT1-exprimierenden Monozyten vorhanden sind , während der unbehandelten und Kombination antiretrovirale Therapie behandelten Infektion 10. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass die Glukoseaufnahme und glykolytischen Metabolismus durch Monozyten wichtige Aspekte der vielen Entzündungskrankheiten sind. Somit ist eine einfache Methode, Monozyten GLUT1-Expression und die Glukoseaufnahme während der Homöostase zu messen und entzündliche Erkrankungen ist wahrscheinlich auf ein breites Spektrum von Forschern von Nutzen zu sein.

Menschlichen Monozyten sind heterogene, aus drei verschiedenen Untermengen enthalten ist , die durch differentielle Expression der Zelloberflächenmarker CD14 und CD16 11,12 sucht werden können. Klassische Monozyten exprimieren ein hohes Maß an CD14, aber nicht ausdrücken CD16 (CD14 ++ CD16 -), Express- Zwischen Monozyten ein hohes Maß an CD14 und ein mittleres Niveau von CD16 (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen Monozyten ein niedriges Niveau von CD14 und ein hohes Maß an CD16 exprimieren (CD14 + CD16 ++). Monocyten , die CD16 exprimieren , werden CD16 + Monocyten bezeichnet, die CD16 im Vergleich - Monozyten haben eine hohe Expression von inflammatorischen Cytokinen und die Fähigkeit zu effektiver 13,14 Antigene. Etwa 10% der Monozyten exprimieren CD16 während der Homöostase mit höheren Anteilen während der Entzündung beobachtet 15. Monozytensubpopulationen sind mit bestimmten Krankheitszuständen verbunden sind und 16 nützliche biologische Marker der Krankheit und Krankheitsprogression sein könnte.

Unser Ziel war es, ein Verfahren zu identifizieren, die Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme durch menschliche Monozyten und Monozytensubpopulationen in Bedingungen so nahe PHY messen kannphysiologischen Bedingungen wie möglich. Frühere Studien Monozyten Glukosetransporter - Expression gemessen und die Glukoseaufnahme 17,18, obwohl diese Methoden isoliert Monozyten untersucht , die die Proteinexpression im Vergleich zu physiologischen Bedingungen geändert haben , können 19, und keine früheren Studie hat die menschliche Monozytensubpopulationen sucht. Mit Multi-parametrischer Durchflusszytometrie beschreiben wir eine Methode Glukosetransporter-Expression und die Aufnahme des fluoreszierenden Glucose analogen 2-NBDG von insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen zu untersuchen (basierend auf CD14 und CD16 Expression) innerhalb ganze unmanipulated Blut.

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Protocol

HINWEIS: HIV-infizierten und nicht infizierten HIV-Themen aus der Infectious Diseases Einheit am Alfred Hospital in Melbourne, VIC, Australien und von der örtlichen Gemeinde rekrutiert wurden, beziehungsweise. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten, und die Forschung wurde von der Alfred Hospital Research und Ethikkommission genehmigt.

1. Glut1 Zelloberflächenerkennung auf Monozyten und Monozytensubpopulationen

  1. Sammeln Sie Blut in Citrat ACD-B Antikoagulans Rohre und beginnen, die Experimente in einem biologischen Sicherheitsschrank innerhalb 1 Stunde der Sammlung.
  2. 100 l Blut in Polypropylenröhrchen. 2 ml 1x Lyselösung (siehe Materialien Table) zu Röhren , während auf Eis, Pipettieren vorsichtig zu mischen. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Zentrifuge bei 220 × g für 5 min.
  3. Dekantieren und waschen Sie zweimal um ca. 2-4 ml Waschlösung (0,5% BSA in PBS 1x) Zugabe und bei 220 xg für 5 Minuten zentrifugiert wurde.
  4. Verwenden Sie ein Rohrtte sorgfältig so viel von der Waschlösung wie möglich zu entfernen. Die Röhrchen auf Eis und resuspendieren in 100 & mgr; l Waschlösung.
  5. Zur Identifizierung von spezifischen Monozytensubpopulationen Zellen mit dem folgenden Volumen von Antikörpern pro 100 & mgr; l Zellsuspension, hergestellt in Schritt 1.4 Fleck: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 ul Glut1 -FITC oder IgG2b-FITC (Isotyp Steuerrohr).
  6. Auf Eis für 30 min im Dunkeln. Waschen Sie 2 mal mit Waschlösung. Fix mit 200-300 ul 0,5% Formaldehyd in 1x PBS.
  7. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer erfassen kann 4 Farben innerhalb von 24 Stunden innerhalb der folgenden Anregungs- und Emissionswellenlänge: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Glukoseaufnahme von Monozyten

  1. Pipette 90 ul Blut in Schritt 1.1 in Polypropylenröhrchen gesammelt. In 10 ul einer 14,60 uM 2-NBDG Arbeitslösungdie 90 & mgr; l Blut (1,46 mM Endkonzentration) und flick sanft zu mischen. Es ist entscheidend, 2-NBDG Exposition durch Abdecken Rohre mit Aluminiumfolie Licht zu begrenzen.
  2. bei 37 ° C bebrütet 15-30 min im Dunkeln und dann sofort auf Eis legen. 4 ml 1x FACS Röhrchen während auf Eis Lyselösung. Zentrifuge bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min.
  3. Wasche einmal durch Zugabe von 4 ml Waschlösung (0,5% BSA in 1x PBS). Zentrifuge bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min. Dekantieren und auf Eis.
  4. Stain Zellen mit Antikörpern: 5 & mgr; l anti-CD3-PE, 5 & mgr; l Anti-CD14-APC und 5 & mgr; l Anti-CD16-PECy7. Mischen und auf Eis für 30 Minuten im Dunkeln.
    HINWEIS: In dieser Zeit stellen Sie sicher, das Durchflusszytometer bereit ist für die sofortige Analyse. Erwerben Sie Zellen innerhalb der folgenden Anregungs- und Emissionswellenlänge: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. In 4 ml eiskaltem Waschpuffer (0,5% BSA in 1x PBS) in Röhrchen.Wasche einmal durch Zentrifugation bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min. Dekantieren und 200-300 ul Eis alten PBS hinzuzufügen und so auf Eis im Dunkeln (mit Aluminiumfolie abgedeckt). Analyse auf einem Durchflusszytometer innerhalb von 10 min unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängeneinstellung, wie in Schritt 2.4.

3. Datenerfassung und Auswertung

Hinweis: Die Kenntnis der Durchflusszytometrie und Datenanalyse wird angenommen.

  1. Mit einem Durchflusszytometer der Lage, mindestens 4-Farbanalyse eingestellt Kompensation ungefärbten und individuell gefärbten Proben.
    HINWEIS: Single-Färbung eines FITC-markierten CD4 und CD14 verwendet, kann für GLUT1 und 2-NBDG Kompensation verwendet werden.
  2. Einrichten und beschriften Sie geeignete Fenster, bevor Proben zu erwerben. Zeichnen Sie ein Tor um die Monocytenpopulation und erwerben 100.000 bis 300.000 Ereignissen pro Probe bei mittlerer Geschwindigkeit. 50.000 Ereignisse pro Entschädigung Probe ist ausreichend.
    HINWEIS: Die Entschädigung kann vor durchgeführt werden, zu probierenErwerb oder in Einzelzellanalyse-Software, nach Standardverfahren.
  3. Export und Daten in eine geeignete Position zu speichern. Öffnen Sie Einzelzellanalyse - Software wie FlowJo oder andere Analysesoftware (Supplemental Abbildung 1) und Drag & Drop - Proben wie angegeben (Supplemental Abbildung 2).
  4. Klicken Sie doppelt auf Datei (Supplemental Abbildung 3) zu öffnen. Zeichnen Sie einen Kreis Monozyten Gate basiert auf Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften , wie in 1A und Supplemental Abbildung 4 dargestellt. Doppelklicken Sie auf die Monocytenpopulation. Bitte beachten und einen Rahmen um den CD3 ziehen - Bevölkerung (Supplemental Abbildung 4).
  5. Doppelklicken Sie auf die CD3 - Bevölkerung. Zu beobachten die Monozytensubpopulationen CD14-APC auf der 'x' Achse auswählen und CD16-PECy7 auf der 'Y'- Achse und beschriften entsprechend (Supplemental Abbildung 5).
  6. Wo gibt es keine eindeutigedie Expression von GLUT1 oder 2-NBDG Aufnahme in den spezifischen Monozytensubpopulationen positiven und negativen Populationen messen. Es werden die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) von Glut1 und 2-NBDG durch den Isotyp Subtrahieren und kein 2-NBDG Hintergrund (Supplemental Abbildung 6).
  7. Wo definierte Populationen vorhanden sind , verwenden Sie den IgG2b-FITC das Tor zu setzen und bestimmen die prozentualen positiven Zellen (Abbildung 3).
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Verfahren insgesamt CD14 + Monozyten zu analysieren. Da 2-NBDG Aufnahme der Regel durch eine Verschiebung in der Fluoreszenz markiert ist Intensitäten die Daten am besten durch MFI und Histogramme dargestellt.

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Representative Results

Vergütung ist für das individuelle Fluorochrome durchgeführt werden Fluoreszenzstreuung zu verhindern. Monozyten werden zunächst durch Gating basierend auf Vorwärts- und Seitenstreu angereichert. Die Grundstücke präsentiert sind Vertreter auf Vollblut durchgeführt mindestens sechs unabhängigen Experimenten von sechs oder mehr Teilnehmer als zuvor 10 berichtet 1A die anfängliche Gating von Monozyten durch Zellstreuung und den Ausschluss von T - Zellen durch Gating innerhalb der CD3 zeigt -. Bevölkerung. Monocyten werden allein für CD14 - Expression oder in Kombination mit CD16 zu identifizieren Gesamt Monozyten oder Monozyten - Subpopulationen dann gated wie in 1B und 1C gezeigt. Für die Analyse von Monozytensubpopulationen sollte die folgende Nomenklatur angewandt werden , wie zuvor beschrieben 12: klassische Monozyten (CD14 ++ CD16 -) ausdrücken sollte etwa größer CD 100-fach14 MFI als der Isotyp-Kontrolle und CD16 MFI sollte der Isotyp-Kontrolle ähnlich sein; Zwischen Monozyten (CD14 ++ CD16 +) sollte etwa 100-fach höhere CD14 MFI als die Isotypenkontrolle auszudrücken und ca. 10-fach höhere CD16 MFI gegenüber dem Isotyp - Kontrolle; nicht-klassischen Monozyten (CD14 + CD16 ++) sollte ähnlich MFI für CD14 und der Isotyp - Kontrolle haben und etwa 100-fach höhere CD16 MFI als die Isotyp - Kontrolle. Zellen ohne die Expression von CD14 und CD16 sind nicht als Monozyten und nicht in Gating enthalten sein sollten. Gated Monozyten oder Monozytensubpopulationen kann dann für die Glukosetransporter-Expression untersucht werden. Wie in Abbildung 2 angegeben, unterschiedliche Populationen von CD14 + Glut1 + Monozyten kann beobachtet werden , vor allem in den Zellen von HIV + Individuen erhalten, in denen eine Infektion durch einen chronischen Zustand der Entzündung gekennzeichnet ist. Ähnlich , aber selten CD14 + Glut1 + Zellen können obs seinerved innerhalb bestimmter Untergruppen von Monocyten in HIV nicht infizierten Personen (3A), aber stärker ausgeprägt in HIV + Individuen (3B). Bemerkenswert bei Abwesenheit von unterschiedlichen Populationen, kann es sinnvoll sein, die Ergebnisse als Mittelwert oder Median florescence Intensitäten repräsentieren, die die kumulative Anstieg in Glut1 Zelloberflächenexpression berücksichtigt.

Die Glukoseaufnahme kann durch den Vergleich von Vollblut inkubiert mit 2-NBDG oder Fahrzeugsteuerung für gated Monozyten oder Monozytensubpopulationen beurteilt werden. Wir haben bereits gezeigt , dass etwa 50% der Monozyten waren 2-NBDG positiv nach einer 15 - minütigen Inkubation 10. Diese Aufnahme Ebene ermöglicht Erkennung von 2-NBDG ohne Erreichen der Sättigung, wenn die Unterschiede in Monozyten 2-NBDG Aufnahme nicht mehr existieren kann. Die Analyse der 2-NBDG Aufnahme durch Monozyten von HIV nicht infizierten und HIV + Personen zeigten eine höhere Aufnahme von Zellen von HIV + Personen, diein Übereinstimmung mit den GLUT1 Expressionsdaten (Abbildung 4 - 5). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die hier beschriebenen Tests können zu potenziell studieren Monozyten metabolischen Aktivitäten in biologischen Zusammenhängen verwendet werden, die eine entzündliche Zustand wie Diabetes, Herz-Kreislauf- Erkrankungen und viralen und bakteriellen Infektionen auslösen.

Abbildung 1
Abb . 1: Gating - Strategie verwendet , um insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen aus repräsentativen HIV- und HIV + Blutproben analysieren Proben von Vollblut wurden mittels Durchflusszytometrie für Monozyten - Zelloberfläche GLUT1 Ausdruck innerhalb von 1 h der Sammlung analysiert. (A) Die Zellen wurden auf Basis von Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften und CD3 Ausdruck gated. (B) Um zu untersuchen , insgesamt Monozyten, CD3 - Zellen wurden dann für CD14 Expression gated. (C Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:.. Die Analyse der GLUT1 Ausdruck Zelloberfläche auf insgesamt Monozyten aus repräsentativen HIV- und HIV + Blutproben CD14 + Monozyten von mit HIV infizierten oder HIV-infizierten Behandlung naive Personen mit FITC-markiertem Isotyp - Kontrolle oder GLUT1 - Antikörper gefärbt wurden Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abb . 3: Analyse der Zelloberfläche Glut1 - Expression auf Monozyten - Subpopulationen von repräsentativen HIV- und HIV + Blutproben Monozytensubpopulationen wurden mit FITC-markiertem Isotypkontrolle oder Glut1 Antikörper für (A) HIV-uninfizierten oder (B) HIV-infizierten Behandlung gefärbt naiver Blutproben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Fig . 4: Die Aufnahme von 2-NBDG durch Total CD14 + Monocyten aus repräsentativen HIV- und HIV + Blutproben Blut von HIV-nicht - infizierten oder HIV-infizierten Personen Behandlung naiver wurde mit Vehikel oder 2-NBDG bei einer Endkonzentration von inkubierten1,46 & mgr; M für 15 Minuten vor dem Waschen und Inkubation mit Zelloberflächen - Antikörper an die Gate - Monozyten wie in Figur 1 beschrieben Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abb . 5: Uptake of 2-NBDG durch Monozytensubpopulationen von repräsentativen HIV- und HIV + Vollblutproben Blut von HIV-nicht - infizierten oder HIV-infizierten Behandlung naiver Personen wurde 15 mit Vehikel oder 2-NBDG in einer Endkonzentration von 1,46 mM inkubiert min vor dem Waschen und Inkubation mit Antikörpern Zelloberfläche zu Gate Monozytensubpopulationen wie in Figur 1 beschrieben Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

together.within-page = "1"> Supp. Abbildung 1
Supplemental . Abbildung 1: Fenster Workspace für die Durchflusszytometrie Zellanalyse - Software Bitte hier klicken , um anzuzeigen oder diese ergänzende Bild herunterladen.

Supp. Figur 2
Supplemental . Abbildung 2: Beispieldaten werden per Drag & Drop in diesem Arbeitsbereich Klicken Sie hier um zu sehen oder diese ergänzende Bild herunterladen.

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Ergänzende Abbildung 3: Die Proben in Arbeitsbereich, Daten 085 doppelt angeklickt, und ein zweites Fenster erschien die drei großen Zellpopulationen (Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile) innerhalb der frischen Vollblutprobe auf vorwärts , die zeigt (FSC) und Seitenstreuung (SSC) . Bitte klicken Sie hier , um diese oder ergänzende Abbildung herunterladen.

Supp. Abbildung 4
Ergänzende Abbildung 4: Die Monozyten sind auf zukunfts gated Basis (FSC) und Seitenstreuung (SSC). Die Bevölkerung wurde doppelt angeklickt, die ein neues Fenster gebracht. CD3 auf der 'x' Achse und CD3-negativen Population ausgewählt (Ausblendung Lymphozyten) wurde sgewählt. Bitte klicken Sie hier , um diese Zusatz Bild anzeigen oder herunterladen.

Supp. Abbildung 5
Supplemental Abbildung 5: Das CD3 - Monocytenpopulation wurde doppelt angeklickt , die ein neues Fenster gebracht , wo Monozyten Subpopulation basierend auf CD16 und CD14 Ausdruck definiert werden. Bitte klicken Sie hier sehen können oder diese ergänzende Bild herunterladen.

Supp. Figur 6
Supplemental Abbildung 6: Monocyte Subpopulationen ausgewählt und GLUT1 Zelloberflächenexpression (mittlere Fluoreszenzintensität: MFI) wird durch die Auswahl von "Statistik" auf dem Histogramm-Fenster 'mean' aus dem 'hinzufügen Statistik' Fenster, und wählen Sie Glut1 aus dem 'Parameter' erhalten Dropdown Menü. Bitte klicken Sie hier , um diese Zusatz Bild anzeigen oder herunterladen.

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll Details, ein einfaches Verfahren Glukosetransporter-Expression und fluoreszierende Glukose analoge Aufnahme durch Monozyten und Monozytensubpopulationen im Vollblut zu untersuchen. Durch die Bewertung 2-NBDG Aufnahme in Vollblut, erlaubt diese Technik für die Bedingungen ähnlich denen in vivo. In einer früheren Studie untersuchten 6-NBDG Aufnahme in Monozyten aus dem Vollblut durch Dichtezentrifugation 17 getrennt. Allerdings hat diese Studie nicht Monozytensubpopulationen und Trennung von Monozyten aus dem Vollblut untersuchen potentiell Expression bestimmter Zelloberflächenmoleküle 19 verändern kann. Radioaktive Glucose - Tracer wurden auch zur Messung von Monozyten Aufnahme von Glukose 20,21, aber Monozyten müssen vorher isoliert für dieses Verfahren und die Verwendung von Radioaktivität erfordert erhebliche Sicherheitsvorkehrungen verwendet. Unser Protokoll verwendet Routine Biosicherheit Verfahren und ist minimal manipulative, so dass für die durchflusszytometrische Messung von 2-NBDGAufnahme durch Monozyten und Monozytensubpopulationen in-vivo-Bedingungen nachahmt.

2-NBDG tritt in die Glykolyse und wurde von Zellen in nicht-fluoreszierende Moleküle 22 werden metabolisiert gezeigt. Daher ist es entscheidend, den Stoffwechsel nach 2-NBDG Inkubation zu begrenzen, indem Zellen, gekühlt auf 4 ° C gehalten wurde. 6-NBDG ist ein weiteres fluoreszierendes Glucose - Analogon, das verwendet werden kann , aber es ist weniger nützlich , da es nicht den glykolytischen Stoffwechselweg eintritt und daher spiegelt nicht genau den bioenergetischen Status der Zellen 23.

Wenn Fluorochrome mit Spektren überlappend verwendet werden, wird Entschädigung kritische Fluorochrom Spill-over zu verhindern. In diesem Protokoll verwenden wir mit CD14 und CD16 gefärbten Monozyten individuell Kompensationsparameter zu setzen, sondern auf den Ersatz von Zelloberflächenmarker können auch unter Verwendung von Kompensations Perlen durchgeführt werden.

Granulozyten CD16 exprimieren, kann aber durch Ausblendung ausgeschlossen werdenCD15-exprimierenden Zellen. Jedoch stringent Gating von Monozyten basierend auf Lichtstreuungseigenschaften können die Anzahl der Granulozyten begrenzen, die in der Analyse. Wenn ein Durchflusszytometer a verfügbar mit mehreren Kanälen ist, kann der Granulozyten-Marker CD66b auch Granulozyten verwendet werden, von der Analyse auszuschließen.

Der Glut1 Antikörper in dieser Studie verwendet bindet an ein Zelloberflächen-Epitop und daher nicht auf intrazelluläre Glut1 nicht bindet. Ein Antikörper, der an ein intrazelluläres Epitop bindet Glut1 kann verwendet werden , insgesamt Glut1 monocyte Expression zu messen, aber Zellen müssen vor dem Anfärben 10 permeabilisiert werden. Zusätzlich zu Monozyten, kann diese Technik verwendet werden, die Glukoseaufnahme und Metabolismus in anderen Leukozyten im Blut zu untersuchen. Wir haben ausgiebig T - Zell - Aufnahme von 2-NBDG unter Verwendung der hier beschriebenen Methode untersucht und haben auch untersucht , 2-NBDG Aufnahme durch NK - Zellen 24. Für eine erfolgreiche Erkennung von GLUT1 Expression und 2-NBDG Aufnahme ist es zwingend notwendig, zu begrenzen,Spuren der roten Blutkörperchen Puffer Lyse durch Zellen mit einem Überschuss an Waschpuffer gemäß dem Protokoll, und wir fanden, dass das Waschen oder FITC-markiertem APC Glut1 Antikörper bessere Signale als PE oder PerCP Konjugate ergeben. Wir haben die Gründe hierfür untersucht.

Da Zellen metabolisch aktiv auch bei niedrigen Temperaturen sind, ist es wichtig, dass im Anschluss an die 2-NBDG Inkubation bei 37 ° C, das Röhrchen direkt auf Eis und Zentrifugieren gehalten werden bei 4 ° C durchgeführt. In der starken Abwesenheit 2-NBDG Signal, prüfen Sie, dass die richtige Konzentration verwendet wird, reduzieren Lichtexposition im Raum und die biologische Sicherheit Kabinett und Abdeckung Rohre mit Folie, wenn angemessen. Die Optimierung kann durch die Einrichtung eines Zeitverlauf 2-NBDG Aufnahme Experiment für 5, 15, 20, 30, 60 und 90 Minuten erforderlich. Typischerweise sollte die optimale Zeit 10-60 min, abhängig von Zelltypen und ihren Aktivierungszustand.

Eine wichtige Einschränkung mit dem 2-NBDG-Aufnahmetest ist leicht sensitivity zusammen mit der Tatsache, dass es von den Zellen genutzt wird. Somit ist es wichtig, die Anzahl von Proben zu begrenzen, um sicherzustellen, daß die letzte Probe innerhalb 30 min von der ersten analysiert. Eine biologische Einschränkung ist , dass, obwohl die Frequenz von Glut1-exprimierenden nichtklassischen Monozyten und Glut1 - Expression auf Monozyten nicht - klassischen als klassische Monozyten signifikant höher waren, bestanden keine Unterschiede in 2-NBDG Aufnahme zwischen den beiden Subpopulationen 10. Dies wirft die Möglichkeit, dass andere Gluts, wie Glut3 und Glut4 ausgedrückt auf Monozyten kann in den Glukosestoffwechsel in verschiedenen Krankheitseinstellungen beteiligt sein. Es ist auch möglich, dass die Aktivität von Glut1 auch posttranslational reguliert werden kann.

Ein großer Vorteil unserer durchflusszytometrischen Glukoseaufnahme Protokoll über Radioisotop Kennzeichnung ist die Möglichkeit, die Technik mit immunphänotypische Analyse zu kombinieren spezifische Subpopulationen von Immunzellen in Smal zu identifizieren und zu untersuchenl Blutvolumen. Darüber hinaus kann die APC-konjugierte anti-GLUT1 gleichzeitig angewendet werden, um Glut1 Zelloberflächenexpression und 2-NBDG Aufnahme analysieren. Eine Änderung der GLUT1-Expression durch 2-NBDG Aufnahme hat bisher nicht nachgewiesen worden, aber diese Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden.

Erhöhte Glucoseaufnahme und Metabolismus durch Immunzellen ist ein Markenzeichen von aktivierten T - Zellen und Monozyten 25-27. Diese Zellen können in Reaktion aktiviert werden Infektion 28,29 und Entzündungssignale in Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen wie Lupus 30-32 und Fettleibigkeit und Diabetes 8,33 bis pathogen. Erhöhte Glukosestoffwechsel ist auch für die Krebszelle Überleben, das Wachstum und die Metastasierung erforderlich 34. Bemerkenswerterweise hat metabolischen Dysregulation in Immunzellen als Kennzeichen einer HIV - Infektion hervorgegangen ist und mit Immunaktivierung 24, Entzündung 10 und Infektiosität von CD4 + T - Zellen 35-37 verbunden. Deswegen,Dieses Verfahren wird mit einem Interesse an entzündlichen vermittelten Erkrankungen, Krebs, Infektionskrankheiten, Immunologie und immunometabolism 38 zu einem vielfältigen Publikum einschließlich von Interesse sein.

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Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der australischen Zentrum für HIV und Hepatitis Virologie Forschung (ACH 2) und ein 2010 Entwicklungsbeihilfe (CNIHR) von der University of Washington Zentrum für AIDS - Forschung (CFAR), ein NIH finanzierte Programm unter Verleihungsnummer AI027757 finanziert , die unterstützt wird durch die folgende NIH Institute und Zentren (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP ist ein Empfänger der CNIHR und ACH 2 Zuschuss. SMC ist ein Empfänger einer National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Hauptforschungsstipendium. Die Autoren danken den Beitrag zu dieser Arbeit der viktorianischen operative Infrastruktur Support-Programm anerkennen vom Burnet Institute erhalten. Wir erkennen die Unterstützung von Geza Paukovic und Eva Orlowski-Oliver von der Amrep Flow Cytometry Core Facility für die Durchflusszytometrie Ausbildung und technische Beratung. Wir danken Angus Morgan für Medien-Coaching und Organisation der Videodreh. Unsere DankbarkeitJesse Masson und Jehad Abdulaziz K. Alzahrani für Labor Unterstützung während der Videoaufnahme. Wir danken den Bemühungen von Dr. David Simar an der School of Medical Sciences, UNSW, Australien, die kritische methodische Beratung angeboten. CSP dankt www.nice-consultants.com für Grafik Konsultationen.

AUTOREN BEITRAG:

CSP konzipierte das Projekt, entworfen und durchgeführten Experimenten, analysiert und interpretiert Daten und schrieb das Manuskript. JJA interpretierten Daten und schrieb das Manuskript. TRB schrieb das Manuskript. JMM interpretierten Daten, machte kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript. SMC interpretiert Daten, gemacht kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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