Un semplice citometria a flusso metodo per misurare il glucosio assorbimento e glucosio Expression Transporter per monociti sottopopolazioni nel sangue intero

Immunology and Infection

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Palmer, C. S., Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., McCune, J. M., Crowe, S. M. A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood. J. Vis. Exp. (114), e54255, doi:10.3791/54255 (2016).

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Abstract

I monociti sono cellule immunitarie innate che possono essere attivati ​​da agenti patogeni e l'infiammazione associata con alcune malattie infiammatorie croniche. L'attivazione dei monociti induce funzioni effettrici e uno spostamento concomitante da ossidativo al metabolismo glicolitico che è accompagnato da un aumento dell'espressione trasportatore del glucosio. Questo aumento del metabolismo glicolitico si osserva anche per l'immunità qualificato di monociti, una forma di memoria immunologica innata. Anche se sono stati descritti in vitro protocolli in esame espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio da parte dei monociti, nessuno è stato esaminato dal flusso multiparametrica citometria nel sangue intero. Descriviamo un multi-parametrica protocollo citometria di flusso per la misurazione della fluorescenza analogico glucosio 2-NBDG assorbimento nel sangue intero dal totale monociti e classico (CD14 ++ CD16 -), intermedio (CD14 ++ CD16 +) e non classica ( CD14 + CD16 ++) monocitisottopopolazioni. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento di glucosio per un totale di monociti e sottopopolazioni monociti durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria, e può essere facilmente modificato per esaminare l'assorbimento del glucosio per altri leucociti e sottopopolazioni di leucociti all'interno del sangue.

Introduction

I monociti sono una componente importante del sistema immunitario innato umano, che stanno rapidamente mobilitato per siti di infezione e infiammazione 1. L'attivazione dei monociti è fondamentale per limitare i danni acuti da patogeni ed è anche fondamentale per la patogenesi di diverse malattie croniche, tra cui l'aterosclerosi 2, il cancro 3, e l'HIV 4,5.

Il metabolismo di riposo e monociti attivati ​​differisce notevolmente, con monociti riposo che utilizzano il metabolismo ossidativo e monociti attivati ​​utilizzando il metabolismo glicolitico (vale a dire, la fermentazione del glucosio in lattato) 6. L'attivazione dei monociti induce l'espressione di trasportatori del glucosio che permette di aumentare l'assorbimento del glucosio per il metabolismo glicolitico 7. Monociti trasportatore di glucosio 1 (Glut1) è un tale trasportatore upregulated durante l'attivazione e la sua espressione è dimostrato di portare alla produzione di citochine pro-infiammatorie in vItro e nel tessuto adiposo dei topi obesi 8. L'infezione di una linea cellulare monocitica da sarcoma di Kaposi associato herpesvirus porta ad upregulation cellulare di Glut1 9, e abbiamo recentemente dimostrato che durante l'infezione cronica da HIV una maggiore percentuale di monociti GLUT1 esprimenti sono presenti durante antiretrovirale un'infezione non trattata e terapia di combinazione trattati 10. Presi insieme, questi studi dimostrano che l'assorbimento di glucosio e il metabolismo glicolitico da monociti sono aspetti importanti di molte malattie infiammatorie. Così, un metodo semplice per misurare l'espressione Glut1 monociti e l'assorbimento del glucosio durante l'omeostasi e la malattia infiammatoria è probabile che sia di utilità per una vasta gamma di ricercatori.

Monociti umani sono eterogenei, essendo composto da tre sottoinsiemi distinti che possono essere esaminati da espressione differenziale di marcatori di superficie delle cellule CD14 e CD16 11,12. monociti classici esprimono un elevato livello di CD14, ma non esprimono CD16 (CD14 ++ CD16 -), monociti intermedie esprimono un elevato livello di CD14 e un livello intermedio di CD16 (CD14 ++ CD16 +), e non classica monociti esprimono un basso livello di CD14 e un alto livello di CD16 (CD14 + CD16 ++). I monociti che esprimono CD16 sono chiamati CD16 + monociti, che rispetto al CD16 - monociti hanno alta espressione di citochine infiammatorie e la capacità di più efficace antigeni presenti 13,14. Circa il 10% dei monociti esprimono CD16 durante l'omeostasi con percentuali più elevate osservate durante l'infiammazione 15. Sottopopolazioni monociti sono associati a determinate patologie e potrebbero essere utili marcatori biologici della malattia e della progressione della malattia 16.

Il nostro obiettivo era quello di individuare un metodo in grado di misurare l'espressione del trasportatore del glucosio e l'assorbimento di glucosio da monociti umani e sottopopolazioni monociti in condizioni come vicino a PHYcondizioni siological possibili. Studi precedenti misurati espressione del trasportatore del glucosio e dei monociti assorbimento del glucosio 17,18, anche se questi metodi esaminati monociti isolati che possono aver alterato l'espressione della proteina rispetto alle condizioni fisiologiche di 19, e nessun precedente studio ha esaminato sottopopolazioni monociti umani. Utilizzando flusso multiparametrica citometria, si descrive un metodo per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e l'assorbimento del glucosio analogico fluorescente 2-NBDG dal totale monociti e sottopopolazioni monociti (sulla base di CD14 e CD16 espressione) all'interno di sangue intero non manipolata.

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Protocol

NOTA: HIV-infetti e soggetti non infetti da HIV sono stati reclutati da l'Unità Malattie Infettive presso l'Alfred Hospital di Melbourne, VIC, Australia, e dalla comunità locale, rispettivamente. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e la ricerca è stato approvato dal Comitato Etico della ricerca e Alfred Hospital.

1. Glut1 rilevamento cellulari di superficie sui monociti e dei monociti sottopopolazioni

  1. Raccogliere il sangue in citrato tubi anticoagulanti ACD-B e iniziare gli esperimenti in una cappa di sicurezza biologica entro 1 ora di raccolta.
  2. Aggiungere 100 ml di sangue per tubi in polipropilene. Aggiungere 2 ml di 1x Soluzione di Lisi (vedi Materiali tabella) per i tubi, mentre sul ghiaccio, pipettaggio delicatamente per miscelare. Incubare per 15 minuti in ghiaccio. Centrifugare a 220 xg per 5 min.
  3. Decantare e lavare due volte aggiungendo circa 2-4 ml di soluzione di lavaggio (0,5% BSA in PBS 1x) e centrifugazione a 220 xg per 5 min.
  4. Utilizzare un tubotte rimuovere accuratamente la maggior quantità di soluzione di lavaggio possibile. Porre le provette su ghiaccio e risospendere in 100 ml di soluzione di lavaggio.
  5. Per identificare specifiche sottopopolazioni di monociti colorare le cellule con il seguente volume di anticorpi per 100 microlitri sospensione cellulare previste al punto 1.4: 5 ml anti-CD3-PE, 5 ml di anti-CD14-APC, 5 ml di anti-CD16-PECy7, 5 ml Glut1 -FITC o IgG2b-FITC (provetta di controllo isotipo).
  6. Mettere in ghiaccio per 30 minuti al buio. Lavare 2 volte con soluzione di lavaggio. Fissare con 200-300 ml di 0,5% di formaldeide made in 1x PBS.
  7. Analizzare su un citofluorimetro in grado di rilevare 4 colori entro 24 ore all'interno del seguente eccitazione ed emissione di lunghezza d'onda: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Il glucosio assorbimento da parte dei monociti

  1. Pipettare 90 ml di sangue raccolto nella fase 1.1 in tubi di polipropilene. Aggiungere 10 ml di una soluzione di lavoro 14.60 mM 2-NBDG a90 ml di sangue (1,46 mM concentrazione finale) e flick delicatamente per miscelare. E 'fondamentale per limitare a 2 NBDG esposizione alla luce coprendo i tubi con un foglio di alluminio.
  2. Incubare a 37 ° C al buio per 15-30 min e poi subito disporli sul ghiaccio. Aggiungere 4 ml di 1x FACS soluzione lisante ai tubi mentre sul ghiaccio. Centrifugare a 220 xga 4 ° C per 5 min.
  3. Risciacquare una volta con l'aggiunta di 4 ml di soluzione di lavaggio (0,5% BSA in PBS 1x). Centrifugare a 220 xga 4 ° C per 5 min. Decantare e posto sul ghiaccio.
  4. cellule macchia con anticorpi: 5 ml anti-CD3-PE, 5 ml di anti-CD14-APC e 5 ml di anti-CD16-PECy7. Mescolare e mettere in ghiaccio per 30 minuti al buio.
    NOTA: Durante questo periodo di assicurarsi che il citofluorimetro è pronto per l'analisi immediata. Acquisire cellule all'interno del seguente eccitazione ed emissione di lunghezza d'onda: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. Aggiungere 4 ml di tampone di ghiaccio lavaggio a freddo (0,5% BSA in PBS 1x) ai tubi.Lavare una volta per centrifugazione a 220 xg a 4 ° C per 5 min. Decantare e aggiungere 200-300 ml di ghiaccio vecchio PBS e tenere in ghiaccio al buio (coperto con un foglio di alluminio). Analizzare su un citofluorimetro entro 10 minuti con eccitazione e regolazione lunghezza d'onda di emissione come al punto 2.4.

3. Acquisizione dati e analisi

NOTA: La conoscenza della citometria a flusso e l'analisi dei dati è assunto.

  1. Utilizzando un citofluorimetro capace di analisi almeno a 4 colori, impostare la compensazione utilizzando campioni non colorati e colorate singolarmente.
    NOTA: colorazione singola con un CD4 coniugati con fluoresceina e CD14 può essere utilizzato per Glut1 e compensazione 2-NBDG.
  2. Impostare ed etichettare le finestre appropriate prima di acquisire campioni. Disegnare un cancello intorno alla popolazione dei monociti, e di acquisire 100.000 a 300.000 eventi per campione a tasso medio. 50.000 eventi per campione di compensazione è sufficiente.
    NOTA: La compensazione può essere effettuata prima di assaggiareacquisizione o in singolo software di analisi delle cellule, seguendo le procedure standard.
  3. Esporta e salvare i dati in un luogo appropriato. Aprire il software di analisi singola cella come FlowJo o altri software di analisi (Supplemental Figura 1) ed i campioni di trascinamento, come specificato (Figura supplementare 2).
  4. Fare doppio clic su file (Supplemental Figura 3) aprire. Disegnare un cerchio di monociti basati su avanti e le proprietà laterali scatter come mostrato nella Figura 1A e supplementare Figura 4 porta. Fare doppio clic la popolazione dei monociti. Osservare e disegnare una casella attorno al CD3 - popolazione (Supplemental Figura 4).
  5. Fare doppio clic sul CD3 - popolazione. Per osservare le sottopopolazioni monociti selezionare CD14-APC sulla 'x' asse, e CD16-PECy7 sul 'asse y'-, e l'etichetta di conseguenza (Supplemental Figura 5).
  6. Dove non ci sono distintepopolazioni positive e negative, misurano l'espressione di Glut1 o 2 NBDG assorbimento nelle specifiche sottopopolazioni monociti. Determinare le intensità di fluorescenza media (MFI) di Glut1 e 2-NBDG sottraendo isotipo e no 2-NBDG sfondo (Supplemento Figura 6).
  7. Se esistono popolazioni definite, utilizzare il IgG2b-FITC per impostare il cancello, e determinare percentuale di cellule positive (figura 3).
    NOTA: Utilizzare questa procedura per analizzare i totali CD14 + monociti. Dal 2-NBDG assorbimento è di solito caratterizzato da uno spostamento della fluorescenza intensità dei dati è meglio rappresentata da IFM e istogrammi.

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Representative Results

Compensazione deve essere eseguita per singoli fluorocromi per prevenire la fluorescenza spillover. I monociti vengono prima arricchite da gating sulla base in avanti e scatter laterale. Le trame presentate sono rappresentanti di almeno sei esperimenti indipendenti condotti su sangue intero da sei o più partecipanti, come riportato in precedenza 10 Figura 1a mostra il gating iniziale di monociti di dispersione delle cellule e l'esclusione delle cellule T dal gating all'interno del CD3 -. Popolazione. I monociti sono poi gated per l'espressione CD14 solo o in combinazione con CD16 per identificare monociti totale o sottopopolazioni monociti come mostrato nella Figura 1B e Figura 1C rispettivamente. Per l'analisi delle sottopopolazioni monociti, la seguente nomenclatura deve essere applicato come descritto in precedenza 12: monociti classici (CD14 ++ CD16 -) esprima circa 100 volte maggiore di CD14 MFI del controllo isotipico e CD16 MFI dovrebbe essere simile al controllo isotipo; monociti intermedi (CD14 ++ CD16 +) dovrebbero esprimere circa 100 volte maggiore CD14 MFI del controllo isotipico e di circa 10 volte maggiore CD16 IFM rispetto al controllo isotipo; monociti non classiche (CD14 + CD16 ++) dovrebbero avere simili MFI per CD14 ed il controllo isotipico e circa 100 volte maggiore CD16 MFI del controllo isotipico. Le cellule senza espressione di CD14 e CD16 non sono considerati i monociti e non dovrebbero essere inclusi nel gating. monociti Gated o sottopopolazioni monociti possono poi essere esaminati per l'espressione del trasportatore del glucosio. Come indicato in figura 2, possono essere osservate distinte popolazioni di CD14 + GLUT1 + monociti, in particolare in cellule ottenute da HIV + individui, dove l'infezione è caratterizzata da uno stato cronico di infiammazione. Simile ma rara CD14 + cellule GLUT1 + può essere osserved all'interno di specifici sottoinsiemi di monociti in HIV persone non infette (figura 3A), ma sono più pronunciati in soggetti HIV + (figura 3b). Degno di nota, in assenza di popolazioni distinte, può essere opportuno per rappresentare i risultati come media o intensità florescence mediane, che prende in considerazione l'aumento cumulato in Glut1 espressione di superficie delle cellule.

l'assorbimento del glucosio può essere valutata confrontando sangue intero incubato con 2-NBDG o controllo del veicolo per i monociti gated o sottopopolazioni monociti. Abbiamo precedentemente dimostrato che circa il 50% dei monociti erano 2-NBDG positivo dopo 15 minuti di incubazione 10. Questo livello assorbimento permette di individuare 2-NBDG senza saturazione raggiunto, quando non possono più esistere differenze nei monociti 2-NBDG assorbimento. Analisi di 2-NBDG assorbimento da parte dei monociti da HIV non infetta e HIV + persone ha rivelato un assorbimento maggiore da parte delle cellule da persone sieropositive, cheè in accordo con i dati di espressione Glut1 (Figura 4-5). Nel complesso, questi risultati dimostrano che i saggi descritti qui possono essere utilizzati per studiare potenzialmente attività metaboliche dei monociti in contesti biologici che provocano uno stato infiammatorio come il diabete, malattie cardiovascolari e infezioni virali e batteriche.

Figura 1
Figura 1:. Soppressione strategia utilizzata per analizzare i monociti totali e sottopopolazioni monociti da HIV rappresentante e campioni di HIV + di sangue Campioni di sangue intero sono stati analizzati mediante citometria di flusso per l'espressione Glut1 superficie cellulare dei monociti entro 1 ora di raccolta. (A) Le cellule sono state gated in base alle caratteristiche in avanti e scatter laterale e di espressione CD3. (B) Per esaminare monociti totali, CD3 - le cellule sono state poi gated per l'espressione CD14. (C clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:.. Analisi dell'espressione superficie cellulare Glut1 sui monociti totali da HIV rappresentante e campioni di HIV + di sangue CD14 + monociti da HIV-infetti o il trattamento persone ingenue sono state colorate con controllo isotipico coniugati con fluoresceina o anticorpi Glut1 HIV-infetti Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 3:. Analisi dell'espressione Glut1 superficie cellulare su sottopopolazioni di monociti da HIV rappresentante e campioni + sangue HIV sottopopolazioni monociti sono state colorate con controllo isotipico coniugati con fluoresceina o anticorpi Glut1 per (B) trattamento (A) non infetti da HIV o con infezione da HIV naïve campioni di sangue. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Assorbimento di 2-NBDG da CD14 + totali monociti dal rappresentante HIV e HIV campioni di sangue + di sangue da parte di persone naive al trattamento HIV-infetti o affetti da HIV è stata incubata con veicolo o 2-NBDG ad una concentrazione finale di1,46 micron per 15 minuti prima del lavaggio e incubazione con anticorpi superficie cellulare a monociti cancello come in Figura 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Assorbimento di 2-NBDG da sottopopolazioni monociti dal rappresentante HIV e HIV + campioni di sangue intero di sangue da parte di persone naive al trattamento di HIV-infetti o affetti da HIV è stata incubata con veicolo o 2-NBDG ad una concentrazione finale di 1,46 mm per 15 min prima del lavaggio e incubazione con anticorpi superficie cellulare alla porta sottopopolazioni monociti come descritto nella Figura 1. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

together.within-page = "1"> Supp. Figura 1
Supplementare Figura 1:. Finestra dell'area di lavoro per citometria a flusso software per l'analisi delle cellule Cliccate qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

Supp. figura 2
Supplementare Figura 2:. I dati di esempio sono trascinati in questo spazio di lavoro Fare clic qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

55 / Supp_Figure_3_Double_Click_to_open_file_Small.jpg "/>
Supplementare Figura 3: I campioni di lavoro, i dati 085 è doppio clic, e una seconda finestra è apparso che mostra i tre principali popolazioni di cellule (linfociti, monociti e neutrofili) all'interno del campione di sangue intero fresco sulla base avanti (FSC) e side scatter (SSC) . clicca qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

Supp. Figura 4
Supplementare Figura 4: I monociti sono gated basano su avanti (FSC) e side scatter (SSC). La popolazione è stata doppia cliccato che ha portato una nuova finestra. CD3 viene selezionato sulla popolazione 'x' asse e CD3-negativi (Soppressione linfociti) è stato seletto. Fai clic qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

Supp. Figura 5
Supplementare Figura 5: Il CD3 - Popolazione dei monociti è stato doppio clic che ha portato una nuova finestra in cui monociti sottopopolazione potrebbe essere definita sulla base di CD16 e CD14 espressione. Clicca qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

Supp. Figura 6
Supplementare Figura 6: Msottopopolazioni onocyte sono selezionati, e l'espressione superficie cellulare Glut1 (media intensità di fluorescenza: MFI) si ottiene selezionando 'statistiche' sulla finestra istogramma, 'media' dalla finestra 'aggiungere le statistiche ", e selezionando Glut1 dal' parametro 'discesa menu. Fare clic qui per visualizzare o scaricare questa cifra supplementare.

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Discussion

Il protocollo descritto qui DETTAGLI un metodo semplice per esaminare l'espressione trasportatore di glucosio e fluorescenti glucosio assorbimento analogico da monociti e monociti sottopopolazioni di sangue intero. Valutando 2-NBDG assorbimento nel sangue intero, questa tecnica consente di condizioni simili a quelle in vivo. Un precedente studio ha esaminato 6-NBDG assorbimento nei monociti separati dal sangue intero dalla densità centrifugazione 17. Tuttavia, questo studio non ha esaminato sottopopolazioni monociti e separazione dei monociti da sangue intero possono potenzialmente alterare l'espressione di alcune molecole di superficie cellulare 19. Traccianti radioattivi di glucosio sono stati utilizzati anche per misurare monociti assorbimento di glucosio 20,21, ma monociti devono essere preventivamente isolato per questo metodo e l'uso della radioattività richiede notevoli precauzioni di sicurezza. Il nostro protocollo utilizza le procedure di biosicurezza di routine ed è minimamente manipolativo, consentendo così per la misura citometria a flusso di 2-NBDGassorbimento da monociti e sottopopolazioni monociti che mimano le condizioni in vivo.

2-NBDG entra nella via glicolitica ed ha dimostrato di essere metabolizzato dalle cellule in molecole non fluorescenti 22. Pertanto, è fondamentale per limitare il metabolismo dopo 2-NBDG incubazione, mantenendo le cellule refrigerati a 4 ° C. 6-NBDG è un'altra analogico glucosio fluorescente che può essere utilizzato, ma è meno utile in quanto non entra via glicolitica e quindi non riflette accuratamente lo stato bioenergetico delle cellule 23.

Se sono utilizzati fluorocromi con sovrapposizione di spettri, di correzione diventa fondamentale per evitare straripamento fluorocromo. In questo protocollo usiamo monociti colorate singolarmente con CD14 e CD16 per impostare i parametri di compensazione, ma la compensazione dei marcatori di superficie delle cellule può essere effettuata anche utilizzando sfere di compensazione.

I granulociti possono esprimere CD16, ma può essere escluso da SoppressioneCD15-cellule che esprimono. Tuttavia, gating rigorosa delle monociti basati sulle proprietà di dispersione della luce può limitare il numero di granulociti incluso nell'analisi. Se un flusso è citometro a disposizione con più canali, il marcatore granulociti CD66b può anche essere utilizzato per escludere granulociti dall'analisi.

L'anticorpo Glut1 utilizzato in questo studio si lega ad un epitopo superficie cellulare e quindi non legarsi intracellulare Glut1. Un anticorpo che si lega ad un epitopo Glut1 intracellulare può essere utilizzato per misurare l'espressione totale Glut1 monociti, ma le cellule devono essere permeabilizzate prima della colorazione 10. Oltre a monociti, questa tecnica può essere usata per esaminare l'assorbimento di glucosio e il metabolismo di altri leucociti trovati all'interno del sangue. Abbiamo ampiamente esaminato l'assorbimento delle cellule T di 2-NBDG con il metodo descritto qui, e abbiamo anche esaminato 2-NBDG l'assorbimento da parte delle cellule NK 24. Per il rilevamento di successo di espressione Glut1 e 2-NBDG assorbimento è indispensabile limitaretracce del tampone di lisi dei globuli rossi di lavaggio cellule con tampone di lavaggio in eccesso in base al protocollo, e abbiamo trovato che FITC o anticorpi Glut1 APC marcato dare segnali migliori rispetto a coniugati PE o PerCP. Non abbiamo indagato le ragioni di questo.

Poiché le cellule sono metabolicamente attivo anche a basse temperature, è fondamentale che dopo l'incubazione 2-NBDG a 37 ° C, che i tubi siano tenuti direttamente su ghiaccio e centrifugazione condotta a 4 ° C. In forte segnale 2-NBDG assenza, verificare che la concentrazione corretta è in uso, ridurre l'esposizione luce nella stanza e tubi di gabinetto e di copertura con un foglio di biosicurezza al momento opportuno. L'ottimizzazione può essere richiesto attraverso la creazione di un corso a tempo 2-NBDG esperimento assorbimento per 5, 15, 20, 30, 60, e 90 min. Tipicamente, il tempo ottimale dovrebbe essere 10-60 minuti, a seconda del tipo di cellule e il loro stato di attivazione.

Una limitazione importante con il test di assorbimento 2-NBDG è sens luceitivity insieme con il fatto che viene utilizzato dalle cellule. Quindi è importante limitare il numero di campioni per assicurare che l'ultimo campione viene analizzato in 30 min del primo. Una limitazione biologica è che, anche se la frequenza di Glut1 esprimenti monociti non classici, ed espressione Glut1 sui monociti non classici erano significativamente maggiore di monociti classici, differenze esistevano in 2-NBDG assorbimento tra le due sottopopolazioni 10. Questo solleva la possibilità che altri Gluts, come Glut3 e GLUT4 espresso sui monociti possono essere coinvolti nel metabolismo del glucosio in contesti diversi della malattia. È anche possibile che l'attività di Glut1 può anche essere regolata alberino traduzionale.

Uno dei principali vantaggi del nostro citometria a flusso protocollo assorbimento di glucosio nel corso di etichettatura radioisotopo è la capacità di coniugare la tecnica con l'analisi immunofenotipica per identificare e studiare sottopopolazioni di cellule immunitarie specifiche in Small volume di sangue. Inoltre APC-coniugato anti-Glut1 può essere applicato per analizzare contemporaneamente l'espressione sulla superficie cellulare Glut1 e 2-NBDG assorbimento. Un cambiamento di espressione Glut1 a causa di 2-NBDG assorbimento non è stato precedentemente dimostrato, ma questa possibilità non può essere esclusa.

Maggiore assorbimento del glucosio e il metabolismo da parte delle cellule del sistema immunitario è un segno distintivo di cellule T attivate e monociti 25-27. Queste cellule possono essere attivate in risposta a patogeni infezione 28,29, e segnali infiammatori in condizioni come malattie autoimmuni come il lupus 30-32, e obesità e diabete 8,33. È necessario anche un aumento del metabolismo del glucosio per la sopravvivenza delle cellule tumorali, la crescita e le metastasi 34. In particolare, disregolazione metabolica nelle cellule immunitarie è emerso come un segno distintivo di infezione da HIV, ed è associata con l'attivazione immunitaria 24, infiammazione 10, e l'infettività di cellule T CD4 + 35-37. Perciò,questo metodo sarà di interesse per un pubblico eterogeneo compresi quelli con un interesse per malattie mediate infiammatorie, il cancro, le malattie infettive, immunologia e immunometabolism 38.

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Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata dal Centro australiano per l'HIV e l'epatite Virologia Ricerca (ACH 2) e una borsa di studio di sviluppo 2010 (CNIHR) presso l'Università di Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programma finanziato NIH con il numero premio AI027757 che è supportato dalla seguente NIH Istituti e Centri (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP è un destinatario del 2 concessione CNIHR e ACH. SMC è destinatario di un Salute e Medical Research Council Nazionale di Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Gli autori ringraziano il contributo a questo lavoro del Vittoriano programma di infrastrutture di supporto operativo ricevuto dall'Istituto Burnet. Riconosciamo l'assistenza di Geza Paukovic ed Eva Orlowski-Oliver dal Fondo Amrep Citometria a flusso di base per citometria a flusso formazione e consulenza tecnica. Ringraziamo Angus Morgan per gli allenamenti e l'organizzazione del video riprese dei media. La nostra gratitudineJesse Masson e Jehad Abdulaziz K. Alzahrani per l'assistenza di laboratorio durante le riprese video. Ringraziamo gli sforzi del dottor David Simar presso la Scuola di Scienze Mediche, UNSW, l'Australia che ha offerto consulenza critica metodologica. CSP ringrazia www.nice-consultants.com per consultazioni grafiche.

CONTRIBUTO AUTORI:

CSP ha concepito il progetto, ideato e condotto esperimenti, analizzato e interpretato i dati, e scrisse il manoscritto. JJA interpretato i dati e ha scritto il manoscritto. TRB ha scritto il manoscritto. JMM ha interpretato i dati, ci ha dato consigli intellettuali critici e recensione del manoscritto. SMC ha interpretato i dati, ci ha dato consigli intellettuali critici e recensione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes Greiner Bio-One GmbH 455094
5 ml sterile polypropylene tubes BD Biosciences 352063
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906
16% formaldehyde solution Electron Microscopy Science 15710
BD FACS lysing solution (10x) BD Biosciences 349202 Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4 °C)
anti-CD3-PE BD Biosciences 555340
anti CD14-APC BD Biosciences 555399
anti-CD16-PECy7 BD Biosciences 557744
anti-Glut1-FITC R & D Systems FAB1418F
IgG2b-FITC R & D Systems IC0041F
2-NBDG Life technologies N13195 Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4 °C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1x DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4 °C)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) Life technologies 14190-144 To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4 °C)

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References

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