Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

Published 8/20/2016
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Neuroscience

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Summary

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Lin, C. C., Riabinina, O., Potter, C. J. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (114), e54346, doi:10.3791/54346 (2016).

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Abstract

Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre comment les circuits neuronaux fonctionner pour guider les comportements des animaux appropriés. Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour de telles enquêtes en raison de ses comportements complexes, techniques génétiques puissants, et le système nerveux compact. Laboratoire des essais de comportement ont longtemps été utilisés avec la drosophile pour simuler les propriétés de l'environnement naturel et d' étudier les mécanismes neuronaux sous - jacents aux comportements correspondants (par exemple phototaxie, chimiotactisme, apprentissage sensoriel et de la mémoire) 1-3. Avec la récente disponibilité de grandes collections de lignées transgéniques Drosophila qui étiquettent des sous - ensembles de neurones spécifiques, tests comportementaux ont pris un rôle de premier plan pour relier les neurones avec des comportements 4-11. paradigmes polyvalents et reproductibles, ainsi que les routines de calcul sous-jacentes à l'analyse des données, sont indispensables pour des tests rapides de lignes de mouches des candidats avec divers genotypes. Sont particulièrement utiles les configurations qui sont flexibles dans le nombre d'animaux testés, la durée des essais et la nature des stimuli présentés. Le dosage de choix devrait également générer des données reproductibles qui sont faciles à acquérir et à analyser. Ici, nous présentons une description détaillée d'un système et d'un protocole pour tester les réponses comportementales de Drosophila vole dans une grande arène de quatre champs. La configuration est utilisée ici pour évaluer la réponse de mouches à un seul stimulus olfactif; cependant, la même configuration peut être modifiée pour tester olfactives multiples, des stimuli visuels ou optogénétiques, ou une combinaison de ceux-ci. La configuration de l'olfactomètre enregistre l'activité des populations de mouches répondant aux odeurs, et les méthodes analytiques de calcul sont appliquées pour quantifier les comportements de mouche. Les données recueillies sont analysées pour obtenir une lecture rapide d'un essai expérimental, ce qui est essentiel pour la collecte de données efficace et l'optimisation des conditions expérimentales.

Introduction

La capacité d'adaptation et de répondre à l'environnement extérieur est essentiel pour la survie de tous les animaux. Un animal a besoin pour éviter les dangers, chercher la nourriture et trouver des partenaires, et d'apprendre des expériences précédentes. Les systèmes sensoriels fonctionnent pour recevoir une variété de stimuli, tels que visuelle, chimique et mécanosensorielle, et envoie ces signaux au système nerveux central doit être interprété et décodé. Le cerveau dirige ensuite les comportements moteurs appropriés en fonction de l'environnement perçu, comme la recherche de nourriture ou échapper à un prédateur. Comprendre comment les systèmes sensoriels détectent le monde extérieur, et comment le cerveau décode et dirige les décisions, est un défi majeur en neurobiologie.

Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant pour étudier comment neuronal comportements de guidage des circuits. En plus d' être simple et peu coûteux à entretenir, la drosophile présentent de nombreux comportements divers et complexes stéréotypés, mais le faire avec un compact système nerveux d'environ 100.000 neurones. Techniques génétiques puissants existent pour manipuler le génome de la Drosophile, et des milliers de lignées transgéniques ont été générées que sélectivement et de façon reproductible étiqueter les mêmes sous - ensembles de neurones 10-13. Ces lignées transgéniques peuvent être utilisées pour manipuler sélectivement l'activité des neurones marqués (activer ou inhiber), et ces manipulations peuvent être utilisées pour étudier comment neuronal comportements de guidage des fonctions.

Plusieurs tests comportementaux ont été développés pour étudier divers comportements drosophile. Drosophila, comme beaucoup d' animaux, utilisent leur sens de l' odorat pour guider de nombreux choix de comportement, tels que trouver de la nourriture, trouver copains, et en évitant les dangers. L'olfaction est donc un bon système sensoriel pour étudier comment les stimuli externes sont détectés et interprétés par le système nerveux d'un animal pour guider les choix appropriés. A ce titre, un certain nombre d'essais ont été développés pour Investigating larvaire et les comportements olfactifs adultes. Traditionnellement, les comportements olfactifs chez la drosophile ont été analysés par un paradigme labyrinthe en T à deux choix, qui peut être utilisé pour doser innée et les comportements appris olfactifs 3. Dans cet essai, environ 50 mouches ont le choix entre deux tubes: un tube contenant l'odeur en question et l'autre contient un odorant de commande (généralement le solvant d'odeur). Les mouches sont donnés une période de temps définie pour faire un choix, puis le nombre de mouches qui sont dans les différentes chambres sont comptées. Bien que le labyrinthe en T est un simple test pour de nombreuses expériences, il existe plusieurs limites. Par exemple, les comportements olfactifs sont évalués à un seul point de temps, et les différents choix effectués avant ce point de temps sont rejetées. De même, les comportements individuels des mouches dans la population sont négligées. En outre, le labyrinthe en T nécessite un comptage manuel des mouches, ce qui pourrait introduire des erreurs. Enfin, comme il n'y a que deux choix mesurés, ceréduit la puissance statistique souvent nécessaire pour détecter les changements de comportement subtils. Une alternative à un labyrinthe en T à deux choix est un à quatre quadrants (quatre champs) olfactomètre 14-18. Dans cet essai, les animaux explorent une arène dans laquelle chacun des quatre coins de l'arène est remplie d'une source potentielle d'air odorisé. L'arène a une forme d'étoile froncé pour maximiser la formation de quatre quadrants d'odeurs expérimentalement définis. Si l'odeur est fourni dans l'un des coins, puis il est contenu seulement en ce qu 'un quadrant. Les comportements des animaux peuvent être suivis comme ils entrent et sortent le quadrant des odeurs, et facilement par rapport à leur comportement dans les trois quadrants de contrôle. Le dosage de olfactomètre à quatre quadrants ainsi les dossiers de réponse comportementale spatiale et temporelle des stimuli d'odeurs sur une grande arène expérimentale.

Le olfactomètre à quatre quadrants a d' abord été développé par Pettersson et al. 15 et Vet et al. 17 pour étudier l'olusine réponses comportementales des hyménoptères parasites individuels. Faucher et al 18. Et Semmelhack et Wang 16 adapté le programme d' installation pour surveiller les réponses olfactives de Drosophila individuelle. Le olfactomètre à quatre quadrants est également sensible aux réponses attractives et répulsives, permettant une large gamme de produits odorants et conditions d'essai. Logiciel de suivi de la mouche Custom-écrit, développé par Alex Katsov 19 et actuellement maintenu par Julian Brown (détaillées dans les matériaux), a présenté des avantages supplémentaires aux implémentations plus récentes de l'olfactomètre à quatre quadrants 14,20-23. Il est maintenant possible de tester jusqu'à 100 mouches simultanément à haute spatiale (27,5 pixels / cm) et temporels (30 images par seconde) de résolution, qui permet d'extraire différents paramètres, tels que la position, la vitesse et l'accélération des mouches à tout point de temps. Cela permet à des enquêtes sur la dynamique des réactions comportementales des mouches à odeurs 20 tableau Matériaux), la même configuration permet des périodes de suivi flexibles et pourrait être utilisé pour suivre les mouches jusqu'à 24 heures en prenant des images à une vitesse inférieure. Cette option a été utilisée pour étudier les comportements de ponte de mouches et de comparer leurs positions du corps avec les préférences de ponte 14. Le olfactomètre quatre champ peut également être utilisé pour étudier les réponses à multimodal (par exemple , olfactives et visuelles) stimuli, ou de combiner optogenetic 9 ou thermogénique 21 stimulation avec des présentations de stimuli sensoriels. En outre, la haute résolution temporelle permet l'extraction de trajectoires for chaque mouche individuelle dans l'ensemble de données ensemble. Par conséquent, la méthode permet enquête sur les comportements de la population olfactifs guidée et aussi les interactions sociales individuelles. Les données générées par cet essai sont robustes et très reproductible, ce qui permet l'utilisation de l'olfactomètre quatre trames pour les écrans de comportement.

Nous décrivons ici l'ensemble de configuration pour un olfactomètre à quatre quadrants. Nous démontrons en outre son utilisation dans le dosage de l'attraction olfactive en réponse à vinaigre de cidre et de répulsion en réponse au propionate d'éthyle très concentré. Enfin, nous décrivons et fournissons un exemple de code pour l'analyse des données de suivi de vol enregistrées.

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Protocol

1. Configuration Assemblée

  1. Fabrication l'arène en forme d'étoile (19,5 cm par 19,5 cm par 0,7 cm) de polytétrafluoroéthylène (PTFE) selon le dessin (les matériaux supplémentaires, de SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) fournies. L'arène peut être fabriquée par un commercial ou d'une installation personnalisée.
  2. L'acquisition de deux plaques de verre (20,25 cm par 20,25 cm avec une épaisseur de 2 mm), et percer un trou (~ 0,7 cm de diamètre) exactement au centre de l'une des plaques de verre à l'aide d'un trépan diamanté.
  3. Fabrication d'une boîte de comportement étanche à la lumière pour l'arène comportementale. fabriquer également une boîte de caméra étanche à la lumière pour la caméra CCD vidéo infra-rouge selon les dessins fournis (matériaux supplémentaires, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Les boîtes peuvent être fabriquées par un commercial ou d'une installation personnalisée.
  4. Monter l'unité de conditionnement d'air sur la paroi postérieure et les réseaux de LED sur les parois latérales de la boîte de comportement. Placer la sonde de températuredans la zone de comportement à travers un trou latéral pour rétroaction en temps réel de la température et de réglage (voir les figures 1 et 2 pour plus de détails).
  5. Fixer le filtre IR et polarisant circulaire à la caméra, et monter l'ensemble dans la zone de la caméra. La boîte de comportement et boîte de la caméra sont séparés par une fenêtre en verre pour une meilleure régulation de la température de la boîte de comportement (voir les figures 1 et 2 pour les détails).
  6. Branchez la caméra CCD infrarouge à un adaptateur de caméra. Branchez l'adaptateur de l'appareil photo à un convertisseur USB. Branchez le convertisseur USB à un port USB de l'ordinateur pour l'acquisition de données.
  7. Installez le pilote pour le convertisseur de vidéo sur l'ordinateur selon les instructions du fabricant. En option, installez le logiciel de traitement d'image fournie par le fabricant du convertisseur vidéo USB pour accéder à une plus large gamme de réglages de l'appareil et des paramètres d'acquisition.
  8. Branchez le climatiseur (par "sortie"Sur le dos du régulateur de température) et la sonde de température (par" thermocouple "sur le dos du régulateur de température) au régulateur de température. Placer la sonde dans la zone de comportement.
    Remarque: Le système de régulation de température dans la mise en page est capable de maintenir la température de la boîte comprise entre 18 ° C et 30 ° C. Des températures plus élevées ou plus basses ambiantes pourraient être utiles pour thermogénique (dTrpA1, TRPM8 ou shibire ts) des expériences pour manipuler l' activité neuronale ou inhiber la transmission synaptique. Pour la plupart des expériences, la température est maintenue à 25 ° C.
  9. Assembler le système de distribution des odeurs dans les étapes suivantes (s'il vous plaît voir la figure 1B pour les schémas détaillés et raccords):
    1. Utiliser le régulateur de pression d'air pour commander l'entrée d'air du système d'air central. Connecter un filtre à air en carbone (rempli de charbon de bois) pour le régulateur de pression pour purifier l'air provenant de la centralesystème de ir.
    2. Assembler le système de contrôle de débit comprenant plusieurs canaux réglementés par des tubes du débitmètre à haute résolution.
    3. Connecter la sortie du filtre à air en carbone sur les tubes du débitmètre par l' intermédiaire d' une tubulure comme représenté sur la figure 1B et 2F. Diriger la sortie des tubes du débitmètre à 3 voies électrovannes commandées électroniquement pour réguler si l' air pur en laissant les débitmètres est expulsé dans la pièce ou est entrée en odeur des chambres faites sur mesure 24.
    4. Installez le contrôleur d'électrovanne selon le manuel du fabricant.
  10. Installer le débitmètre d'air électronique en le reliant à un dispositif d'acquisition de données (DAQ) et une alimentation électrique selon le manuel du fabricant. Installez le logiciel d'interface DAQ pour vérifier des débits égaux dans chaque quadrant de l'arène avant chaque expérience.

2. Olfactive Stimuli Préparation

  1. Préparer 5 odeurchambres de fourmis 24 qui se composent d'un récipient extérieur en plastique, le verre contenant intérieur, un couvercle PTFE insert sur ​​-mesure, le couvercle du récipient d' origine avec une partie centrale enlevés, et deux clapets anti-retour.
    Remarque: Un joint torique autour du couvercle de PTFE peut être utilisé pour empêcher la fuite d'air de la chambre d'odeur pendant odeur perfusion. Voir la Figure 1 pour schématique et la figure 2 pour les photos des chambres.
  2. Utilisez quatre chambres odorants pour les contrôles de solvant, et une chambre pour un odorant de test. Remplissez les récipients en verre avec 1000 ul de solvant ou odorant dilution (odorants de test + solvants appropriés, bien mélanger avant les expériences), placez le récipient en verre à l'intérieur de la chambre de plastique correspondante (ne pas renverser le liquide dans la chambre en plastique) et serrer le couvercle . Assurez-vous de toujours utiliser une chambre propre pour le odorant d'essai et les contrôles de solvants.
    Note: attraction olfactive peut être déclenchée par 1/16 dilution du vinaigre de cidre (5% d'acidité) dans water. En revanche, le comportement de répulsion olfactif peut être étudié à l'aide d'une dilution à 10% de propionate d'éthyle dans de l'huile minérale. stimuli de contrôle dans ces cas sont des chambres d'odeur avec une huile minérale pure.

3. Préparation Fly

  1. Arrière vole sur le milieu de la semoule de maïs standard. Placez 30 hommes et 30 mouches parentales femelles dans une bouteille standard, et laissez-les pondent des œufs pendant 5 jours à 25 ° C ou à température ambiante.
  2. Pour chaque expérience, collecter nouvellement éclos (<1 jour) 25 hommes et 25 femmes mouches sous brèves CO 2 anesthésie.
  3. Gardez les mouches dans un flacon avec un milieu de mouche standard pour 2-4 jours.
  4. 40-42 h avant l'expérience, transférer les mouches sans CO 2 anesthésie   un flacon contenant un gel d'agarose ~ 10 ml de 1%. Cela permet de garder les mouches humidifiés sans nourriture, ce qui contribue à augmenter leur activité locomotrice.
    Note: Plus de 90% des mouches devrait survivre à la famine. Certains génotypes sont moins guérirton et ne peut pas le faire à travers une famine de 40 h. Dans ces cas, des périodes plus courtes telles que 24-28 h sont acceptables, mais doivent être conservés les mêmes pour toutes les conditions expérimentales et répétitions.

4. Les réponses comportementales à Odorants attractifs et répulsifs

  1. Mettez le régulateur de température et réglez-le à 25 ° C.
  2. Connecter les chambres odorants (les odorants contrôle et de test) en insérant le tuyau à la sortie de la chambre odorant et à la poussée to-connect montage sur la boîte de comportement.
  3. Vérifiez le débit dans chaque quadrant en utilisant le débitmètre d'air pour vous assurer que le contrôle et la airstreams odorants sont égales à 100 ml / min.
  4. Nettoyez l'arène à la mouche de PTFE et les plaques de verre avec 70% d'éthanol 2-3 fois et leur permettre de sécher à l'air complètement (~ 3-4 min).
  5. Apposer les plaques de verre à l'arène avec des pinces.
  6. Transfert vole sans CO 2 anesthésie dans l'arène à travers le trou dans l' une des plaques de verre. à l'arrièreer le transfert, placez un maillage circulaire sur le trou pour empêcher les mouches de s'échapper.
    Remarque: CO 2 anesthésie a été montré pour affecter le comportement Drosophila 25 et ne doit pas être utilisé dans les 24 heures d'une expérience comportementale.
  7. Placez l'arène avec des mouches dans la chambre étanche à la lumière, relier les courants d'air quatre de contrôle en raccordant le tube attaché à la mise en place sur la boîte de comportement aux coins de l'aréna push-to-connect, fermer la porte de la chambre et attendre 10 15 min pour laisser les mouches acclimater à ce nouvel environnement. Si possible, éteindre la lumière dans la pièce où les expériences sont réalisées, afin d'éviter toute fuite de lumière minimale qui peut fausser le résultat expérimental.
  8. Exécuter une expérience de contrôle 5-10 min, dans laquelle les mouches sont exposés à des courants d'air 4 de contrôle.
  9. Analyser les données immédiatement (voir la section d'analyse des données ci-dessous) pour vous assurer que les mouches sont répartis uniformément dans l'arène, et l'indice de l'activité est procheà 0. Cette étape est essentielle, car elle vérifie qu'il n'y a pas de sources non contrôlées de préférence ou d' éviter dans l'arène (par exemple , la lumière qui fuit de l'extérieur, la distribution inégale de la température, l' arène inégale, la contamination des odeurs, etc.). Si les mouches sont inégalement répartis ou de leur activité locomotrice est faible, jeter les mouches, nettoyer à nouveau la scène (étape 4.4) et utiliser un nouveau lot de mouches de répéter l'expérience.
  10. Connecter la chambre de odorant d'essai à la configuration en activant les vannes 3 voies ou re-brancher les tubes de connexion.
  11. Exécutez l' expérience de test pendant 5-10 minutes et analyser les données comme décrit dans la section 5 ci - dessous (voir également référence 14 et Figure 3). Les enregistrements de plus de 20 min peut entraîner des fichiers de données qui peuvent être difficiles à traiter informatiquement. Si les enregistrements plus expérimentaux sont souhaités, arrêter rapidement et re-démarrer le programme de suivi. Il en résulte un écart ~ 10 sec entre les enregistrements expérimentaux.
  12. Discarvol d.
  13. arène et plaques de verre propres avec 70% d'éthanol (étape 4.4), et remplacer les tubes de connexion dans l'enceinte étanche à la lumière. Pour accélérer les expériences, une nouvelle arène propre peut être utilisé, et l'arène sale nettoyé tout en effectuant essais expérimentaux.
  14. Exécutez une autre expérience avec un nouveau lot de mouches, si nécessaire. Si plusieurs expériences sont exécutées le même jour, prenez un soin extrême pour veiller à ce qu'aucun odorant est laissé dans le système à partir d'un essai précédent. Ceci est normalement pas un problème avec de faibles concentrations de substances odorantes ou avec CO 2, mais stimuli pour très concentrées jusqu'à un intervalle de 24 heures entre les essais expérimentaux peut être nécessaire. En outre, tous les tubes après que l'écoulement des tubes peut être remplacée en cas de contamination odorant est suspectée au cours des expériences de contrôle. Toujours laisser l'air sec sur entre les expériences pour rincer en permanence le système

Analyse 5. Données

Note: La mouche a suggéré l'acquisition de suivi software (détaillées dans les matériaux), suit des mouches en temps réel lors de l'acquisition, et enregistre l'horodatage et les coordonnées de toutes les mouches détectées au format * .dat. Nous avons développé une routine Matlab fait sur commande pour convertir les données en un format Matlab, et d'analyser les données. Les exemples de code sont fournis dans les matériaux supplémentaires, mais les détails de la mise en œuvre dépendra du logiciel utilisé pour l'acquisition de données.

  1. Charger les données brutes. Créer un masque spatial qui suit les contours de l'arène et appliquer le masque aux données brutes pour supprimer tous les points de données qui ne relèvent pas de l'arène , car ils représentent le bruit (figure 4A, complémentaire code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
  2. Supprimer tous les points de données qui se déplacent à une vitesse inférieure à 0,163 cm / s pendant plus de 3s, car ces données sont susceptibles d'être le bruit généré par les mouches ou non mobiles (figure 4B, complémentaire code TemporalFiltering.m).
  3. Visualiser les données restantesdes points en les traçant une seule fois ou que les trajectoires individuelles (Figure 3, Code complémentaire SingleTrajectoryViewer.m).
    Remarque: L'emplacement des limites d'odeur dans le champ quatre dépend probablement un certain nombre de facteurs, tels que les caractéristiques de chaque odorant et les débits d'air utilisé. Par exemple, odorants très volatils vont probablement remplir le quadrant des odeurs plus complètement que odorants moins volatils. Ainsi, il est probable que chaque substance odorante peut présenter légèrement différentes limites d'odeur. L'utilisation d'un détecteur de photoionisation pour mesurer les limites des odeurs peut être problématique car il utilise un vide pour prélever l'air à partir d'un endroit particulier, et ainsi perturbe la concentration odorant à cet endroit. Néanmoins, les limites d'odeurs peuvent être estimées rapidement sur la base de données comportementales de mouches. Par exemple, une limite d'odeur basée sur des pistes de braguette cumulée en réponse à différentes odeurs peut être clairement observé sur les figures 3C et 3D.
  4. Calculer un indice d'attraction pour déterminer si des expériences de contrôle génèrent pas de réponse préférence, ainsi que pour accéder à la réponse à un odorant (ou optogenetic 9) stimulus. Pour calculer une activité Index (AI), utilisez les 5 dernières minutes d'un contrôle ou d'enregistrement de test. Pour obtenir une mesure de l'attraction qui se situe entre +1 (attraction absolue) et -1 (répulsion absolue), la formule suivante est utilisée pour calculer l'AI:
    L'équation 1
    N test est le nombre de points de données dans le quadrant de test, le contrôle N est le nombre moyen de points de données dans les trois quarts de cercle de contrôle. Cette mesure est intuitive car aucune préférence serait indiquée par des valeurs proches de zéro. Toutefois, cela ne signifie pas correctement la proportion du nombre total de mouches qui sont situées dans le quadrant odorante. Pour obtenir cette mesure, un indice Pourcentage (PI) peut être utilisé:
    équation 2N test est le nombre de points de données dans le quadrant de test, et le N total est le nombre total de points de données dans les quatre quadrants. Cette formule donne une mesure qui se situe entre 0 et 1, avec 0,25 correspondant à aucune préférence comportementale (figure 3E et 4C, le code supplémentaire AttractionIndex.m).
  5. Exécutez 5-10 répétitions de chaque condition expérimentale, en utilisant un nouveau groupe de mouches pour chaque répétition. Comparer les indices d'attraction entre les conditions ou contre les contrôles en utilisant le test non paramétrique de Kolmogorov-Smirnov (Figure 3F, fonction kstest2 en Matlab).

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Representative Results

Les quatre quadrants olfactomètre dossiers d'analyse et analyse les activités de marche de beaucoup de mouches sur un grand espace de comportement. Odorants peuvent être introduits dans les air-courants qui entrent dans un, deux, trois ou les quatre quadrants. En l'absence d'odeurs, les mouches se déplacer librement entre les quatre quadrants. Ce comportement est essentiel d'observer car elle indique que les biais un-intentionnel n'a pas été introduit dans le dosage. Ces biais peuvent comprendre la lumière, les fluctuations de température, les différences de débit d'air, ou de contaminants odeurs. La figure 3B montre les réponses comportementales dans le olfactomètre à quatre quadrants de 25 hommes et 25 mouches femelles à l' air sec. Une mouche-voie unique à partir des données collectées est également mis en évidence dans la figure 3B, et démontre que cette mouche explore toute l' arène comportementale. Le score de l'indice d'attraction (AI) pour toutes les pistes analysées au cours de la période d'essai de 5 min est proche de 0, indicating un manque d'attirance pour le quadrant des odeurs. De même, l'indice de pourcentage (PI) de l'expérience est de 0,24, ce qui indique que les mouches ont été répartis équitablement, même dans les quatre quadrants au cours de la période d'essai de 5 min.

La réponse comportementale à quatre champ à un odorisant attractif est représenté sur la figure 3C. Le vinaigre de cidre est introduit dans le courant d'air de   en haut à gauche odeur quadrant courant d'air en plaçant une dilution de 6,25% de vinaigre de cidre dans la chambre de l'odeur de test. Les pistes de mouches recueillies en gris montrent que la plupart des mouches se rassemblent dans cette odeur quadrant, et non plus d'explorer les quatre quadrants. Une piste de mouche de couleur unique montre qu'une fois une mouche entre dans le vinaigre de cidre odeur quadrants, il a tendance à rester dans l'odeur quadrant attrayant. L'IA de 0,94 pour l'expérience est proche de 1 indique une forte attirance pour ce odorant. Le PI de 0,92 indique que 92% des mouches remained dans le quadrant des odeurs au cours de la période d'analyse.

La réponse comportementale à quatre champ à un répulsive odorante est représenté sur la figure 3D. Une dilution à 10% de propionate d'éthyle odorant placé dans une chambre d'odeur a été utilisé comme source des odeurs du flux d'air en haut à gauche. Les pistes de mouches massées pour l'expérience analysée démontrent l'évitement du quadrant des odeurs, suggestive de répulsion d'odeur guidée. Une piste de mouche de couleur unique montre qu'une mouche, quand il est entré dans le quadrant des odeurs, se détourna rapidement pour éviter le quadrant des odeurs. L'IA de -0.68 est inférieur à 0, ce qui indique la répulsion, et est proche de -1, indiquant une forte réponse odorant repoussante. PI de 0,06 pour l'expérience suggère que seulement 6% (par rapport à environ 25% dans les expériences d'odeur neutre) des points de données de braguette à chenilles n'a été trouvée dans le quadrant odeur au cours de l'expérience.

Figure 3E diagrammes de la relation entre l' IA et les scores de PI, et comment ces chiffres se rapportent à des comportements attractives ou répulsives.

L'essai de quatre champs se traduit par des comportements olfactifs robustes et reproductibles. Cela permet une comparaison quantitative entre le contrôle et les conditions expérimentales comme le montre la figure 3F, et permet également l'identification de olfactor subtileréponses y qui dévient de la neutralité.

En outre, comme les données sont obtenues à une résolution spatiale et temporelle, il est possible d'étudier de nombreux facteurs de réponses comportementales, comme les trajectoires de vol simples (comme le montre la figure 3), ainsi que de caractériser différentes dynamiques d'activité des mouches un champ d'odeur (par exemple, les changements de direction et de la vitesse 19,20).

Il peut souvent être difficile de positionner l'arène de quatre champs dans le même emplacement exact de chaque expérience, en particulier depuis un nettoyage fréquent de l'arène est nécessaire. À condition que l'analyse des scripts de compenser ces légères variations en ajustant d' abord les données , comme illustré sur la figure 4A. Dans ce cas, la forme de l'arène de quatre champ est calculé, et les points de données qui se trouvent en dehors de cet espace sont supprimés. Ces objets suivis représentent souvent debris ou des réflexions qui sont à tort suivis. Comme ils ne se trouvent pas dans l'arène et représentent ainsi le bruit, il est important que ces points de données sont supprimées pour empêcher l'analyse des données erronées. De même, il est également important de supprimer des points de données de suivi qui pourraient représenter le bruit ou les mouches non-déplacer dans l'arène. Pour ce faire , un script d'analyse est utilisée (et fournie ici) qui élimine les points de données qui essentiellement ne se déplacent pas (comme représenté sur la figure 4B). Ces points de données sont généralement en minorité, mais leur maintien conduirait à des erreurs dans les analyses.

Indice d'activité et les scores de l' indice de préférence peuvent être calculés après une période de temps ensemble (par exemple à la fin d'une expérience de 5 min comme le montre la figure 3). Il convient de noter, cependant, que, comme les mouches sont suivis avec une résolution spatiale et temporelle élevée, des analyses similaires peuvent être réalisées tout au long de l'expérience. C'estreprésenté sur la figure 4C dans laquelle l'activité scores Index et pourcentage Index sont calculés dans des bacs de 10 sec en continu pendant la période de temps. Une telle analyse permet de mieux apprécier les changements olfactifs qui pourraient se produire tout au long de l'expérience, comme l'accoutumance à une substance odorante.

Figure 1
Figure 1:. Schématique du Olfactométre à quatre quadrants (A) La configuration de la conduite se compose d'un système de distribution d'odeur, le système de régulation de température (non schématisé), le système d'acquisition d'images (IR lumières et IR caméra CCD connectés à un ordinateur LED), arène à quatre quadrants et de comportement et de l'aréna boîtes étanches à la lumière. Les cercles rouges désignent les composantes correspondantes de la figure 2. (B) de la conception détaillée du système de distribution d'odeur. Les caractères verts représentent les tailles de connexion / conversion de fittings. Tubes de 1/16 ID et 1/8 OD sont étiquetés en jaune alors que ceux de 1/8 et 1/4 ID OD sont marquées en rose. Abréviations: IR, infrarouge; CF, Compression Fitting; BF, Barbed Fitting, MNPT, Homme National Pipe Thread. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Photos de la configuration Olfactive Assay (A) vue à grand champ de la boîte de la caméra et la boîte de comportement. (B) Voir l' intérieur de la boîte de comportement. La sonde de température, les tubes de connexion, et les tableaux de LED IR sont étiquetés. (C) de l' arène à quatre quadrants. (D) Vue panoramique sur le terrain du système de distribution d'odeur relié à la boîte de comportement. La boîte de l'appareil a été retiré pour révéler la caméra CCD. (E (F) l' exemple des tubes d'odeur reliés au collecteur. (G) des tubes d'écoulement à haute résolution à réguler le flux d' air. (H) Le tube et les connecteurs de distribution d' odeur en aval des régulateurs du tube de mesure. (I) Les électrovannes régulent si l' air est passé à travers une chambre d'odeur ou expulsé vers la chambre. Des chambres (j) d'odeur sont reliés à soupapes unidirectionnelles et contiennent un récipient en verre intérieur de la substance odorante. (K) La boîte de comportement contient des raccords push-to-connect extérieur qui se connectent à la tubulure de distribution d'odeur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Exemple de données généré en utilisant un dosage Olfactive Quatre-champ (A) Schéma de l'arène de quatre champs.. (B) des réponses neutres sont observés lorsque les quatre quadrants ne contiennent que la perfusion de l' air sec. (C) Attraction des réponses à une dilution de vinaigre de cidre de 6,25% perfusé du quadrant supérieur gauche. Comportements (D) de répulsion provoquées par le propionate d'éthyle à 10%. Sur la figure 2B à 2D, une trajectoire unique à partir des données acquises est tracée. Un gradient de couleur est utilisé pour signifier le décours temporel de l'enregistrement avec des couleurs bleues et rouges étant le début et la fin des enregistrements, respectivement. (E) Comparaison de l'indice d'activité (AI) et l'indice Pourcentage (PI). (F) AI de moyenne de 3 à 6 expériences sans odeur (Control), Apple Cider Vinegar (ACV) et 10% Ethyl propionate (EP). Les barres d'erreur indiquent SEM. différence statistique a été évaluée par le Kolmogorov-Smirnov test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Exemple de données généré par les étapes d' analyse de données (A) Le filtrage spatial des données, effectuées par MaskSpatialFiltering.m pour supprimer des points de données qui ne relèvent pas de l'arène. Les cercles rouges montrent les positions initiales des cercles qui sont utilisés pour définir les frontières de l'arène. Les cercles noirs sont les positions finales, acquises en ajustant le cercle donne un aperçu des données (zone grisée à l'intérieur du champ quatre). Les points rouges et noirs flèches indiquent les points qui seront retirés de l'ensemble de données après cette étape de filtrage de données. (B) de filtrage temporel des données, effectuée par TemporalFiltering.m. Cette étape de filtrage élimine les points de données qui se déplacent très slol 'ouest, ou pas du tout, car ils sont susceptibles d'être générés par les mouches non-déplacement ou par terre / réflexions de l'arène. Un point rouge entouré par une boîte rouge en pointillés indique les positions de ~ 6000 points de données avec des coordonnées identiques qui seront supprimés par cette étape de filtrage. (C) Attraction Index (AI) et de l' indice Pourcentage (PI), calculée dans des bacs de 10 sec au cours des 5 dernières minutes d'une expérience par AttractionIndex.m. Profils temporels de ces indices contiennent des informations sur la dynamique des réponses comportementales et peuvent être utilisés pour une analyse détaillée des comportements. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le olfactomètre quatre champ décrit ici est un système polyvalent de comportement pour étudier les réponses olfactives des grandes populations de type sauvage et mutant drosophile mouches. Chaque expérience prend ~ 1 h (y compris l'installation, essais expérimentaux, et le nettoyage), et 4-6 expériences peut être effectuée régulièrement chaque jour. Un essai typique utilisant 40-50 mouches pendant 5 minutes génère environ 450.000 suivis de points de données pour l'analyse. La configuration décrite peut également être utilisé, avec des modifications mineures, pour surveiller les mouvements d'autres insectes ou des larves d'insectes en réponse à olfactives ou d'autres stimuli sensoriels au cours d'une période de temps allant de minutes à quelques jours. L'essai à quatre quadrants est sensible aux effets des deux stimuli attraction et de répulsion. La plupart des odorants génèrent des indices d'attraction (AI) entre -0,9 et +0,9 (équation 1). Une AI dans la gamme de 0,5 à 1 signifie comportement de forte attraction des mouches aux stimuli, alors que AI dans la plage de -0,5 à -1 estdéclenchée par répulsifs forts. D'une manière générale, une réponse neutre par des odeurs de contrôle (air sec, l'air humidifié, l'huile minérale) doit se situer entre +0,1 et -0,1. L'IA change souvent pendant toute la durée de l'expérience de test, ce qui reflète le temps mouches ont besoin pour marcher dans les panaches odorants, attraction initiale et augmentation de l'activité locomotrice vers un nouveau stimulus, et désensibilisation éventuelle en réponse au stimulus. contrôle pré-tests pistes sont essentielles et doivent être effectués avec soin pour assurer que les mouches ont été distribués de manière uniforme dans l'arène en l'absence du stimulus désiré.

Les causes les plus fréquentes de polarisation spatiale des mouches dans l'arène sont: flux irréguliers d'air, peut-être due à un tube déconnecté ou plaques de verre insuffisamment serrées de l'arène en forme d'étoile (dans notre expérience, les mouches sont capables de détecter des différences de débit d'air d'aussi peu que 15 ml / min); la distribution inégale de la température à travers l'arène, qui peut être amélioré en réglant leunité d'air conditionné pour générer des flux plus faibles et plus diffuse l'air et / ou une plus longue période de pré-acquisition (~ 20 min) pour assurer une température de l'arène; fuite de lumière minimale à travers l'ouverture de la sonde de température, qui peut être réduit en scellant l'ouverture avec du ruban noir; odeur résiduelle dans l'arène ou dans le système de distribution d'air, auquel cas la configuration (arène, débitmètres, raccords de l'enceinte étanche à la lumière, etc.) doivent être nettoyés à fond et on laisse sécher pendant plusieurs jours ou remplacé si possible.

Entretien de l'équipement olfactif est important pour obtenir des résultats fiables et cohérents. Push-to-connect raccords sur la boîte de comportement et des entrées d'air et les parois intérieures de l'arène doivent être nettoyés avec de l'éthanol après chaque expérience, si les odeurs fortes sont utilisées, et on laisse sécher complètement. Les plaques de verre doivent être lavés trois fois avec de l'éthanol à 70%, ce qui est généralement suffisant pour éliminer les odeurs et la saleté résiduelles à partir des plaques, mais l'hexane est utiledans l' élimination des composés organiques déposés par les mouches (par exemple, les phéromones constitué de longues chaînes hydrocarbonées). Le savon est généralement pas recommandé car il contient généralement des composants aromatiques, ce qui affecterait les comportements olfactifs. La boîte de comportement doit rester connecté aux entrées d'air sec entre les expériences (par exemple la nuit) pour faciliter l' élimination des odeurs résiduelles du système.

Si l'activité locomotrice des mouches est faible, ils peuvent générer trop peu de points de données, ce qui se traduit souvent par un indice d'activité bruyante et variable. Plus longues famine et d'enregistrement temps peuvent aider à résoudre ce problème. En revanche, si les mouches sont malades, 24-28 h de la famine serait généralement suffisante pour améliorer l'activité de locomotion aussi longtemps qu'elle est cohérente dans l'ensemble des expériences. Il y a un bon équilibre entre le maintien d'un état sain des mouches et l'augmentation de la locomotion. 40 h la famine peut être utilisé comme un point de départ, et plus tard modifié commenécessaires en fonction des résultats expérimentaux. Les indices d'attraction seront peu affectés par la durée de la famine, il est donc essentiel d'affamer tous les animaux de laboratoire pour la même période de temps afin d'éviter les effets confondants de temps de famine. De plus longs temps de famine font habituellement des réponses répulsives plus faible (proche de 0), et les réponses attrayantes plus fort. flux d'air de contrôle de l'air sec ont tendance à dessécher les mouches, et ne doivent pas être utilisés pendant plus de 40 min.

Le olfactomètre à quatre quadrants peut être utilisé pour étudier les réponses de mouches simples 16,18 ou multiples à un seul stimulus ou d'étudier le choix de préférence entre les stimuli. Par exemple, des odeurs différentes peuvent être utilisées dans chacun des quatre quarts de cercle. Cela pourrait également être utilisé pour déterminer les réponses à l'odeur des mélanges en examinant les limites des odeurs quadrants. Il convient de noter que, même si le système de suivi des pistes individuelles permet d'être isolés à partir des données recueillies, il estpossible que les mouches individuelles peuvent se comporter différemment lors de l'analyse en tant que partie d'un groupe que lorsqu'ils sont testés seuls. Par exemple, les groupes de mouches présentent une augmentation de répulsion d'odeur guidée due à des interactions physiques entre les mouches 26. Le système de suivi et la disposition peuvent également être adaptés pour être utilisés dans des analyses non olfactives. Le cadre d'analyse peut facilement accueillir un réseau de LED 9 pour la stimulation optogenetic, ou une plaque thermique 27 pour thermogenetics. Le système peut également être adapté pour étudier les choix comportementaux d'une échelle de temps de plusieurs heures, par exemple pour étudier le comportement de ponte 14. Dans ce cas, le taux de trame d'acquisition doit être ajustée pour éviter la production de gros fichiers de données, et une source d'humidité et le substrat (gel d'agarose à 1%) doivent être fournis en tant que substrat de ponte.

Une limitation de cette configuration est que les mouches sont suivis comme des objets réfléchissant les IR et en dessous de la Arena- si un élément d'un optogenetic ouexpérience thermogénétique reflète IR, les points de données non pertinentes devront être enlevés au cours de post-traitement. Actuellement, il est également impossible de filmer les mouches à une résolution spatiale qui permet aux différentes mouches d'être continuellement distingués, mais cela peut être amélioré à l'avenir en utilisant des caméras vidéo plus avancées. Une autre limitation du système actuel est que le mouvement de mouches est contrainte à deux dimensions pour promouvoir des comportements de marche, et permettra d'éviter les réponses de vol olfactifs-induite.

Il convient de noter que les tests automatisés supplémentaires ont également été mis au point pour étudier les comportements olfactifs de simple ou de groupes de mouches. La conception la plus similaire à l'essai décrit ici est une méthode développée par Beshel et Zhong 28. Dans cet essai, les réponses de ~ 30 mouches sont surveillées dans une petite arène circulaire (environ un quart de la superficie de l'arène de quatre champs) dans lequel les odeurs sont livrés à partir de 1 4 ports d'odeurs le long de la wa arènell, et enlevé à travers un trou dans le centre de la scène circulaire. Outre une arène plus petite, d'autres différences de conception comprennent les comportements étant effectuées dans des conditions de lumière, et odorants se concentrant principalement à proximité des ports d'odeur (au lieu de dans tout le quadrant odorant comme dirigé par les parois plissées de l'arène de quatre champs). Néanmoins, l'arène circulaire est un procédé approprié pour le criblage des réponses olfactives des mouches, et peut être adaptée à la conception de suivi de braguette décrit ici.

Une autre approche consiste à surveiller simultanément l'activité de nombreuses mouches simples en réponse aux odeurs. Dans l'essai Flywalk, les mouches individuels sont placés dans de petits tubes, et leurs réponses suivies lorsque odorants sont perfusés à travers le tube 29,30. Les changements de direction avant ou arrière, ou des changements de vitesses, peuvent être utilisés pour évaluer si une substance odorante est généralement attractives ou répulsives. Ce test, comme l'essai de quatre champs, suit automatiquement mouche movements, et ainsi peut être utilisé pour mesurer rapidement les réponses olfactives à un large éventail d'odeurs. Cependant, contrairement au champ quatre, la dynamique des moteurs complexes, tels que la trajectoire tourner les angles et les interactions sociales potentielles, peut-être manqués dans l'enregistrement d'essai Flywalk.

Suivi automatique des simples mouches de marche a également été adapté à un type labyrinthe en T test 31,32. Dans cet essai, les mouches sont placées dans de petites chambres dans lesquelles les odeurs sont perfusées de chaque extrémité de la chambre, et la sortie via un port au milieu de la chambre. Les positions des mouches sont automatiquement suivis. Cela imite, sur une échelle de mouche unique, un cadre T-labyrinthe. En combinaison avec optogénétique, cet essai a été particulièrement bien adapté pour le dosage de circuits neuraux apprentissage olfactif et de la mémoire, et peut également être utilisé pour évaluer les préférences olfactives de mouches simples. Semblable à Flywalk, il ne peut pas contrôler la dynamique des activités complexes qui pourraient se produire sur les zones spatiales plus grandes, Tels que ceux qui se produisent pendant la recherche de nourriture 14, ou des comportements qui se produisent seulement dans les populations de mouches.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air delivery system  (Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds Cole-Parmer, IL, USA R-31522-31 1
Hex reducing  nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) McMaster-Carr, IL, USA 5232T314 1
Tubing (ID:1/8) McMaster-Carr, IL, USA 5108K43 50 Ft
Tubing (ID:1/16) McMaster-Carr, IL, USA 52355K41 100 Ft
Barbed tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5117K71 1 pack
Push-to-connect tube fittings McMaster-Carr, IL, USA 5779K102 4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K439 1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K438 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) McMaster-Carr, IL, USA 5463K4 2 pack (10) 
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) McMaster-Carr, IL, USA   5670K84 1
Hex head plug McMaster-Carr, IL, USA 48335K152 1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters (Quantity needed)
Labatory gas drying unit W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA Model: L68-NP-303; stock #26840 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-30 1
Multitube frames for 150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R03215-76 1
150 mm flowtubes Cole-Parmer, IL, USA R-03217-15 9
Valve Cartridge Cole-Parmer, IL, USA R-03218-72 9
Precision Air regulator McMaster-Carr, IL, USA 6162K13 1
Soleniod valves Automate Scientific, Berkeley, CA 02-10i 4
Solenoid valve controller ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA 01-18 1
Electronic flow meter Honeywell AWM3100V 1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a  National Instruments NI USB-6009 1
Power supply Extech Instruments 382200 1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml Nalgene 562118-0002 At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz Sunburst Bottle LB4B At least 5 are required per experiment 
"In" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 214224PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber Smart Products, Inc., CA, USA 224214PB-0011S000-4074 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring RT Dygert International, MN, USA AS568-029 Buna-N O-R 1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes (Quantity needed)
Behavior and camera box material Interstate plastics, CA, USA ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) 1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" McMaster-Carr, IL, USA 8545K27  1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" McMaster-Carr, IL, USA 8476K191  2
Dual action thermoelectric controller WAtronix Inc, CA, USA DA12V-K-0 1
IR LED array Advanced Illumination, Rochester, VT, USA AL4554-88024, PS24-TL 2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit Melcor Store  MAA280T-12 1
Imaging system (Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA PEC21211 KP 1
CCXC-12P05N Interconnect Cable B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SOCCXC12P05N 1
DC-700 Camera Adapter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA SODC700 1
B+W 40,5 093 IR filter B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA 65-072442 1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer Amazon 1
IR Videocamera Industrial Vision Source, FL, USA Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) 1
USB video converter The Imagingsource, NC, USA DFG/USB2-It 1
iFlySpy2 (fly tracking software) Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com iFlySpy2 1
IC Capture 2.2 software The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Miscellaneous (Quantity needed)
Dremel rotary tool Dremel, Racine, WI, USA Dremel 8000-03  1
Diamond-coated drill bits for glass cutting Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY 90606328 1

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References

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