교육 연구소에 Lactase 효소 활동 측정

Biology
 

Summary

Lactase의 효소 활동의이 당 유 당 catabolic 처리를 위해 필수적 이다. 여기, 식이 보조 제에 lactase의 활동 색도계 분석 결과 사용 하 여 분석 이다. 이 lactase, 효소 활동의 활동을 이해 하기 위한 실험 플랫폼으로 학생을 제공 합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Leksmono, C. S., Manzoni, C., Tomkins, J. E., Lucchesi, W., Cottrell, G., Lewis, P. A. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. J. Vis. Exp. (138), e54377, doi:10.3791/54377 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

효소를 작동 하는 방법, 이해 하 고 실제 사례에이 관련 된 다양 한 생물 학적 및 생물 의학 과학에 있는 학사 학위에 중대 하다. 이 따라 쉽게 첫 해 학부 약 학 학생에 대 한 개발 되었다 프로토콜과 효소 분석에 대 한 효소 반응 및 분석 절차에 엔트리 레벨 소개를 제공 합니다. 선택의 효소는 lactase,이 인간의 질병/제약 연습에 관련 된 상업적으로 이용 가능한 효소의 예를 나타냅니다. Lactase 식이 보충 정제에서 추출 되 고 lactase는 인공 기판의 가수분해에 따라 색도계 분석 결과 사용 하 여 평가 (ortho-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside, ONPG). 직교 nitrophenol ONPG의 가수분해 분열 lactase 다음의 릴리스 420에 흡 광도 있는 변화에 의해 측정 됩니다, 그리고 및 효소 반응에 온도 효과 얼음, 실내 온도에 37에 반응 밖으로 운반 하 여 평가 ° C. 고급 분석은 다른 조건 하에서 효소의 활동을 평가 하 고 다른 시 약을 사용 하 여이 프로토콜을 사용 하 여 구현할 수 있습니다.

Introduction

효소는 특수 유형의 생활에서 화학 반응에 대 한 생물학적 촉매 역할 단백질 유기 체1. 효소의 활동은 생활, 에너지 제공, 폐기물의 처분 및 유기 체 기능을 수 있도록 중요 합니다. 따라서, 이해 효소는 생활의 완전 한 이해에 중요 합니다. 이러한 지식은 다양 한 의료 과학에서 생물학에 이르기까지 대학 수준의 학위 프로그램에 대 한 필수적입니다. 효소 반응의 속성은의 실제적인 경험에 손에 의해 비로소 최고의 촉매의 원리에서 효소 활동의 이론적 모델에 이르기까지 자세한 배경 독서 자료와 강의 사용 하 여 학생 들에 게 제공 될 수 있다, 하는 동안 행동에 효소 이전2를 시연 했다. 이 프로토콜 제공 인간의 영양 및 건강에 관련 된 활동으로 효소의 예를 들어 lactase를 사용 하 여 실험실 조건 하에서 효소의 활동을 측정 하기 위한 실험 패러다임에 따라 간단을 합니다.

Glycosidic 가수분해 효소 락 타 아 제 (적 능력 3.2.1.23/26) 이다 효소 포유류3중앙 영양 중요성의. Lactase의 활동 높은 진화를 통해 보존 하 고 효소의 베타-galactosidase 가족에서 파생- 호모 사피엔스 (그림 1, PDB 1JZ8)4를 통해 대장균 에서 현재 가족. 인간 영양에 lactase의 중요 구성 단 당 류 구성, 시체에서 에너지를 생성 하기 위해 사용할 수 있는 유 당 분해를 허용 하는 역할에서 유래. Lactase catalyzes이 당 유 당, 갈 락 토스와 포도 당 (그림 2) 방출에 있는 glycosidic 유대의 가수분해5. 이 단은 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 6구 연산 산 성 주기 및 산화 인 산화 생성을 위해 주로 사용 됩니다. 신생아 및 유아 개발, lactase은 인간의 소화 시스템, 유 방 우유는 유 당입니다 기본 탄수화물 구성 요소, 그리고 영양의 주요 소스 중 하나 초기 동안 에서 받은 유 당을 무 너 뜨에 매우 표현 7. 선천적인 lactase 결핍증 (CLD), lactase 효소8코딩 lactase 유전자 (LCT)에 돌연변이 의해 발생 한 드문 상 염색체 열성 상태에 의해 lactase의 의학 중요성 강조. CLD와 새로운 태어난 아기 전시 거의 lactase 활동, 따라서 그들은 유 방 우유, 모든 다른 종류의 우유, 또는 유 당을 포함 하는 수식에 먹이 수 없습니다.

어린 시절, 동안 lactase 식 일반적으로 감소 된다; 그러나,이 감소 이유 다음 효소9표현 하 성인 전세계 계속의 약 35% 지리적으로, 변화 한다. Lactase, lactase 지 속성로 알려진의 지속적인된 표현 계속 다양 한 소스에서에서 우유 및 낙농 제품을 소화 하는 개인을 허용 한다. 반대로, 유 당 편협로 알려진 또한 성인 형 hypolactasia (ATH) 용기에 유 당을 분해 하는 무 능력에서 유래 lactase 식의 손실 될 수 있습니다. ATH는 빌드를 유 당 유 당 포함 된 식품의 섭취 다음 콜론에서의 특징 이다. 콜론, 축적 된 유 당 창 자 미생물 동물군, 수소, 메탄, 이산화탄소 등 가스를 방출 하 여 발효 이다. Lactase 효소 부족으로 개인에이 가스의 생산 촉진 복 부 bloating, 증가 자만심, 고통, 구역 질, 및 borborygmi (위 소리)7. 유 당 소화 관에서의 증가 수준을 또한 느슨한 발판 이어질 수 있습니다.

LCT 유전자 발현의 통제는 근처 MCM6 유전자의 introns에 있는 동 질 다 상으로 변조 됩니다. Lactase의 지속적인 식이 개인 수행 따라서 이유, 하는 동안 LCT 전사의 규정 아래 정상적인 보상 LCT 유전자 발현에 대 한 강한 원심 강화 기능 동 질 다 상 그리고 결과적으로 성인3유지 lactase 식입니다. 증강 동 질 다 상 긍정적으로 선택 된 가축과 낙 타 중동 지역에서의 순화에 따라 5 천 년 전을 제안 되었습니다9,10.

예를 들어 식단에서 유제품을 제거 하 여 유 당 섭취를 줄여 ATH에서 발생 하는 증상을 관리할 수 있습니다. ATH에 대 한 다른 접근 방법 및 CLD 위한 선택의 접근 lactase 보충, 약국에서 널리 사용할 수의 사용 이다. 이러한 보충제 lactase 촬영 하거나 유 당 포함 된 음식에 추가 수 있는 액체 또는 알 약 형태로 효 모와 박테리아 등의 다양 한 절연을 제공 합니다. 보충 유 당을 포도 당과 갈 락 토스 제품, 따라서 그들의 흡수를 허용 하 고 창 자에서 소화 되지 않은 유 당 기판의 축적을 방지 하는 식품에 존재의 비율은 것 이다.

규정식 도움으로 lactase 보충의 사용을 바탕으로, 첫 해 생물 의학 과학 또는 약 학 학생에 적합 한 간단한 enzymology 실험실 실험을 개발 했습니다. 이 실험실 실험은 상용 lactase 보충, 그리고 사용 하는 직교 활용-nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) lactase ( 여 glycosidic의 분열을 측정 하기 위한 색도계 끝점을 제공 하 그림 3)11. ONPG 역할 lactase 위한 인공 기질이 있는이 효소에 의해 가수분해 생산 직 nitrophenol D-갈 락 토스를 때. 후자의 제품은 노란색, 흡수 하는 420의 파장에 빛 nm. 420 nm 다음에서 흡 광도 변화를 측정 하 여 lactase ONPG의 노출,이 효소의 활동을 예측 가능 하다. 이 실험실 실험 효소 가수분해 효소 활동의 데모를 제공합니다. 추가 복제에서 서로 다른 조건에서 분석 실험을 수행 함으로써, 효소 반응 속도 론, 인간의 건강에 관련 된 행동에 효소의 귀중 한 실제 예제를 제공의 더 정교한 분석을 통합 가능 하다.

Protocol

참고: 프로토콜 아래 목적 교육 실험실에서 개최 되는 2 시간 (를 포함 하 여 클래스에 워크시트의 완료)의 과정을 통해 개발 되었다. 실험 단계 했다 의도적으로 제외 (실시 모델 데이터를 사용 하 여이 과정의 맥락에서); 효소 활동의 더 상세한 분석을 함께 넣어 그러나-토론에 설명 했 듯이-프로토콜 시간, 시설 및 학생 달성 수준에 따라 고급 분석에 대 한 템플릿을 제공 합니다.

안전:이 실제 실행 되어야 좋은 화학 실험실 연습 (GCLP)의 규칙에 따라-걸린된 실험실 외 투, 안전 안경, 일회용 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 한다에 항상 실험실에 .

1. 효소 추출

  1. 효소, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여도 분말의 200 mg를 포함 한 lactase 태블릿 호감.
  2. "정지"를 붙인 15 mL 튜브에 결과 분말을 놓고 100 mM 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 10 mL에 resuspend.
  3. 소용돌이 1 분 효소 추출 극대화입니다.
  4. 침전 물 고체 입자를 현 탁 액 1.5 mL 원심 분리기 튜브와 10000 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기 1 mL 전송.
  5. "Lactase 추출" 셔 서 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.

2. 색도계 반응 관찰

  1. 1.5 mL 튜브에 100 m m PBS의 장소 390 µ L 이라는 "반응 A".
  2. Vortexing에 의해 잘 100 µ L 5mm ONPG 솔루션 및 믹스를 추가 합니다.
    주의:이 실제 사용 하 여 ortho-Nitrophenol-베타-D-galactopyranoside (ONPG) 유 당에 대 한 대용으로. ONPG 페 놀 화합물 이기 때문에, 그것은 신중 하 게 처리 되어야 합니다. ONPG와 피부 접촉 시 노출 된 피부 즉시 세척 되어야 한다. 모든 유출 적절 한 폐기물 스트림으로 처리를 종이 타 올 즉시 닦아 해야 합니다.
  3. Vortexing에 의해 잘 반응 A 관 및 혼합 추출 물 10 µ L를 추가 합니다.
  4. 5 분 동안 반응 혼합물을 관찰 하 고 솔루션에 색도계 변경 합니다.

3. 효소 활동 측정

  1. 두 개의 1.5 mL 튜브를 설정: "반응 B" 이라는 "컨트롤"을 표시 한.
  2. B 관, 제어 튜브를 100 m m PBS의 400 µ L 반응에 100mm PBS의 390 µ L을 추가 하 고 각 튜브를 100 µ L 5 m ONPG m의 추가.
  3. Vortexing에 의해 내용을 혼합.
  4. 반응 B 관에 lactase 추출의 10 µ L을 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합 반응 실내 온도에서 1 분 동안 진행을 허용.
  5. 1 분이 경과 되 면 반응 함으로써 종료 pH를 증가 하 여 lactase 효소를 억제 하기 위해 두 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L를 추가 합니다.
  6. 깨끗 한 분 광 광도 계 큐 벳에 각 관에서 500 µ L를 전송 하 고 420에서 흡 광도 측정 nm은 분 광 광도 계를 사용 하 여.
  7. B 반응과 컨트롤 샘플에 대 한 흡 광도 및 반응 값을 파생 하는 ONPG의 활성 효소의 가수분해로 인해 흡 광도 있는 변화에서 컨트롤 값을 뺍니다.

4입니다. 효소 활동에 온도 효과

  1. 섹션 3에에서 설명 된 대로 3 제어 튜브 및 3 개의 반응 관을 설정 하 고 이러한 레이블 "4 ° C", "방 온도", 그리고 "37 ° C".
  2. 효소의 추가 따라 추출, 얼음, 실내 온도에, 및 37 ° c (에서 미리가 열된 물 욕조)에 대 한 튜브를 품 어.
  3. 다음 각 튜브를 1 M 탄산 나트륨의 500 µ L을 추가 하 여 반응을 종료 1 분을 반응 수 있습니다.
  4. 420에 흡 광도 측정 섹션 3에에서 설명 된 대로 각 튜브에 대 한 nm. 각 경우에 반응 값에서 컨트롤 값을 뺀 값을 기록 합니다.

Representative Results

프로토콜의 섹션 2에 대 한 대표적인 결과 그림 4A에 표시 됩니다. Lactase 정제에서 추출 포함 된 반응 솔루션으로 ONPG 방출 분해는 노란색 동안 제어 반응 lactase 효소의 부재에서 명확한 남아 직교-nitrophenol. 그림 4B 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플의 다음과 같은 분석 프로토콜의 섹션 4에서 임의의 단위를 사용 하 여 표시 합니다. 직교 nitrophenol의 생산은 반응은 얼음에 알을 품을 때 최저 / 최고 반응 37 ° c.에 실시

Figure 1
그림 1 : 대장균 베타-galactosidase. (A)에서 대장균, 복잡 한 활성의 tetrameric 구조를 보여주는 베타-galactosidase의 결정 구조. (B) Allolactose (빨간색으로 표시)의 베타-galactosidase 활성 사이트에 바인딩된. PDB 1JZ84에서 생성 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 의 lactase 효소 행동. 베타-D-갈 락 토스와 베타-D-포도 당을 생산 lactase에 의해 유 당 가수분해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 의 직교 가수분해-nitrophenol- 베타 -D galactopyranoside. Lactase 베타-D-갈 락 토스와 직교-nitrophenol (색상에 노란색이), 420에 흡 광도의 측정에 의해 lactase의 활동의 추정을 허용 하 여 ONPG 가수분해 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 4
그림 4 : ONPG 가수분해. ONPG 가수분해의 대표적인 결과, 420에 임의의 단위로 원시 흡 광도 보여주는 클래스에 워크시트에 기록 제어 및 반응 튜브 (A) 및 프로토콜의 섹션 4에서 대표 데이터를 보여주는 nm, 배경에 대 한 수정 및 3 다른 온도 (B)에서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

실험 조건 실험 변수
온도 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
기질 농도 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
경쟁 저해 5 mM ONPG 플러스 0 m m, 1 mM, 5 m m 또는 10 m m 유 당
시간 의존 0 s, 15, 30 s, 1 분, 5 분, 10 분, 20 분
열 변성 Lactase 추출 시험 하기 10 분 전에 100 ° C에가 열

표 1: 실험 상태를 확장 하는 잠재력. Lactase 생물학의 특정 측면을 조사 하는 3 중에 실시 하는 확장된 실험을 제안 했다.

Discussion

효소, 효소 반응 및 효소 활동의 이해와 상세한 지식은 생물학, 의학 및 약 학에 걸친 주제의 넓은 범위에 대 한 필요 합니다. 위에서 설명한 프로토콜 보여주는 더 많은 고급 실험실 기반 실험에 사용할 수 있는 핵심 기술을 제공 하는 효소 반응에 대 한 인간의 건강에 관련 된 효소의 예를 들어 lactase를 사용 합니다.

이 프로토콜 시간의 짧은 공간에서 해석할 결과를 거의 또는 전혀 젖은 실험실 경험을 가진 가능한, 허용 학생 수를 의도적으로 설계 되었습니다. 2014/2015 학년도 약 학 대학의 독서 학교에서 총 144 학생, 3의 그룹으로 구성 된 모든 그룹이 lactase 정제에서 효소 활동의 어느 정도 감지할 수 있는 "lactase 측정" 실험 실시 추출합니다.

이 프로토콜에서 중요 한 단계는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 초기 추출 후속 분석을 위해 충분 한 활성 효소의 가용 화를 수 있도록 효율적이 필수적 이다.입니다. 우리의 경험에서는, 첫 해 대학생이 달성할 수 있는 설명;는 프로토콜에 따라 그러나 실험실 논증 자에서 몇 가지 지침이 시점에서 필요 했다. 자명한 포인트 것입니다, 하지만이 프로토콜의 성공에 핵심 요소 신중 하 게 볼륨을 측정, 올바르게 레이블 튜브 및 지시의 수입니다. 동안 많은 학생 들, 주의 깊은 모니터링과의 확실 하지 않은 경우에 도움을 요청 하는 학생에 대 한 취소 요청에 대 한 일정 정도의 능력을 추측 될 수 있다 무엇을 해야할지 다음 성공적인 분석 결과의 가장 큰 가능성을 제공 합니다.

학생 평가 클래스에 워크시트 (보충 자료로 사용 가능), 학생 들이 참고 실험, 그들의 결과 배경 정보/읽기 강의 자료에서 개인에서에서 데이터를 요청 하거나 더 밖으로 실행 될 수 있다 자세한 모델 데이터 제공 시도 하 고 평가 하는 운동 분석에 대 한 허용 클래스 평가에서.

여기에 소개 하는 프로토콜은 가르치는 실험실 조건에서 lactase 활동 분석 결과의 간단한 예 이며 고급 분석을 허용 하는 실험의 복잡성이 증가 하는 충분 한 기회. 특히, 제시 프로토콜에서는 효소 활동의 개념을 소개 하지만 실험 데이터의 운동 분석을 허용 하지 않습니다. 이와 같이, 우리가 세밀 하 게 특정 목표와 학생 코 호트 사업 실험의 재능에 맞게 적응와 클래스에 대 한 초기 템플릿으로 설명된 프로토콜 보기 권하고 싶습니다. 확장 된 실험의 예 포함 될 수 있습니다: 서로 다른 온도에서 통계 분석, 운동 데이터를 분석 (생화학 학생/전공 적합), 시작 수 있도록 다른 기질 농도 사용 하 여 측정 반복 여러 다른 정제 및 효소 (제어 정제, 법의학 과학 학생/전공 적합의 추가)와 함께 각각의 다른 활동 평가, 열 변성의 영향을 평가 또는 경쟁 수행 유의 추가 또는 억제제 lactase (표 1)의 실험. Lactase의 운동 분석에 대 한 자세한 프로토콜 이전 게시12되었습니다.

이 프로토콜의 중요 한 강도 의학에서 enzymology의 진짜-생활 사례 연구와 함께 enzymology 및 효소 활동에 대 한 기본적인 소개는 결합입니다. 이것은이 실험실 의학, 약 학, 생물 의학 및 관련된 과목의 학생 들에 게 특정 한 관련성의 실험. 중요 한 것은, 심각한 건강 상태와 관련 된 유 당 놓과 더 광범위 한 식이 문제는 사실 다양 한 학생 들과 의료 및 윤리적인 문제를 기회를 제공 한다. 이 의료 조건에 대 한 유전자 검사를 둘러싼 문제를 포함할 수 있습니다 및 유전자 치료 및 유전 상담, 뿐 아니라 사용과의 약 보조 식품의 판매에 관련 된 토론. 한 가지 주요 한계는 프로토콜 추출에 사용 된 시작 물자로 인해 효소 농도의 정확한 예측에 대 한 허용 하지 않습니다. 그러나, 수정이를 담당 하는 시 약 학년 효소를 사용 하 여 분석 결과 대 한 것. 중요 한 것은,이 것 또한 lactase 효소에 대 한 속도의 더 정확한 계산에 대 한 허용.

결론적으로, 활동 시 금 교육 연구소에 lactase의 환경 소개를 제공 합니다 강력 하 고 매력적인 하 고 재미 있는 분야에 효소 생물학의 초기 단계에 대 한 대학생.

Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

PAL는 파 킨 슨 병 영국 연구 친교 (그랜트 F1002)에 의해 투자 되었다. 이 일과 MRC 새로운 조사 연구 그랜트 (미스터/L010933/1)에 의해 지원 되었다 MRC 프로그램에 의해 권한을 부여 미스터/N026004/1 PAL, 고 BBSRC 재학 BB/M017222/1 JET. 우리는 그들의 의견 및 입력에 대 한이 실용적인, 그리고 이후 동료의 첫 번째 반복에 대 한 읽기의 대학에서 학생 들 MPharm 파트 1의 2014-15 일대 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactase tablet Lamberts 8511-60
Phosphate buffered saline (powdered) Sigma P3813 Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG Sigma N1127 Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate Sigma 451614 Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water NA NA
Pestle and mortar VWR
Spectrophotometer Jenway 6315
Pipettes Gilson
15 mL tubes VWR
1.5 mL tubes Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes Jenway
Vortex Vortex genie 2
Centrifuge Beckman
Ice bucket VWR
Water bath Thermo-Scientific
Weighing scales Thermo-Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. Biochemistry. 8th, Palgrave Macmillan. (2015).
  2. Jittam, P., et al. Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).
  3. Troelsen, J. T. Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression. Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).
  4. Juers, D. H., et al. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).
  5. Plimmer, R. H. On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose. Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).
  6. Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body. The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).
  7. Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. Lactose intolerance. Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).
  8. Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia. Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).
  9. Swallow, D. M. Genetics of lactase persistence and lactose intolerance. Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).
  10. Enattah, N. S., et al. Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture. American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).
  11. Lowe, G. H. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase. Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).
  12. Russo, S. F., Moothart, L. Kinetic study of the Enzyme Lactase. Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics