Medición de actividad enzimática de la lactasa en el laboratorio de enseñanza

Biology
 

Summary

La actividad enzimática de la lactasa es esencial para el proceso catabólico de la lactosa disacárido. Aquí, la actividad de la lactasa en los suplementos dietéticos se analizan mediante un ensayo colorimétrico. Esto proporciona los estudiantes una plataforma experimental para la comprensión de la actividad de la lactasa y la enzima cinética.

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Leksmono, C. S., Manzoni, C., Tomkins, J. E., Lucchesi, W., Cottrell, G., Lewis, P. A. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. J. Vis. Exp. (138), e54377, doi:10.3791/54377 (2018).

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Abstract

Entender cómo las enzimas trabajan y esto referente a ejemplos de la vida real, son fundamental para una amplia gama de licenciaturas en las ciencias biológicas y biomédicas. Este fácil de seguir protocolo fue desarrollado para estudiantes de pregrado de farmacia primer año y proporciona una introducción básica a reacciones enzimáticas y procedimientos analíticos para el análisis de enzima. La enzima de elección es lactasa, ya que esto representa un ejemplo de una enzima disponible comercialmente relevante para la práctica del farmacéutico de la enfermedad humana. La lactasa se extrae de tabletas de suplemento dietético y evaluó mediante un ensayo colorimétrico basado en la hidrólisis de un sustrato artificial de lactasa (Orto-nitrofenol - -D-betade galactopiranosida, ONPG). Lanzamiento de lactasa después de la ruptura hidrolítica de ONPG Orto-nitrofenol se mide por un cambio en la absorbancia a 420 nm y el efecto de la temperatura en la reacción enzimática se evalúa mediante la realización de la reacción en hielo, a temperatura ambiente y a 37 ° C. Análisis más avanzado se pueden implementar usando este protocolo de evaluación de la actividad enzimática bajo diferentes condiciones y utilizando diferentes reactivos.

Introduction

Las enzimas son un tipo especializado de proteína que actúan como catalizadores biológicos para las reacciones químicas en la vida de los organismos1. La acción de enzimas es fundamental para la vida, proporcionando energía, eliminación de desechos y permitiendo a los organismos funcionar. Las enzimas de la comprensión es, por tanto, fundamental para un entendimiento completo de la vida. Tal conocimiento es esencial para una amplia variedad de programas de grado de nivel universitarios, que van desde las ciencias médicas a la biología. Mientras que un fondo detallado desde principios de la catálisis a modelos teóricos de la actividad enzimática se puede proporcionar a los estudiantes con charlas y material de lectura, las propiedades de las reacciones enzimáticas son mejor comprendidas por las manos en la experiencia práctica de enzimas en acción como ya demostraron2. Este protocolo proporciona un simple seguir el paradigma experimental para medir la actividad enzimática bajo condiciones de laboratorio, utilizando lactasa como un ejemplo de una enzima con una actividad relevante para la salud y nutrición humana.

La lactasa hidrolasa glicosídicos (EC 3.2.1.23/26) es una enzima de importancia nutricional para mamíferos3. La actividad de la lactasa se conserva altamente a través de la evolución y deriva de la familia beta-galactosidasa de enzimas — una familia actual de Escherichia coli a través de Homo sapiens (figura 1, PDB 1JZ8)4. La importancia de la lactasa en un entorno nutricional humana proviene de su papel en permitir la descomposición de la lactosa en sus componentes monosacáridos constituyentes, que se pueden entonces utilizar para generar energía en el cuerpo. La lactasa cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico en la lactosa disacárido, liberando galactosa y glucosa (figura 2)5. Luego, estos monosacáridos se usan principalmente para la generación de trifosfato de adenosina (ATP) vía el ciclo del ácido cítrico y fosforilación oxidativa6. Durante el recién nacido y el desarrollo infantil, la lactasa es altamente expresada en el sistema digestivo humano, romper lactosa proveniente de la leche materna que la lactosa es el componente principal de hidratos de carbono y una de las principales fuentes de nutrición durante los primeros años 7. deficiencia congénita de lactasa (EPC), una condición recesiva de un autosoma rara causada por mutaciones en el gen de la lactasa (LCT) que codifica para la enzima de lactasa8destaca la importancia médica de la lactasa. Recién nacidos con enfermedad pulmonar crónica exhiben muy poca actividad de la lactasa, así no pueden ser alimentados con leche materna, cualquier otro tipo de leche o fórmula que contenga lactosa.

Durante la infancia, normalmente se reduce la expresión de la lactasa; sin embargo, esta reducción tras destete varía geográficamente, con aproximadamente el 35% de adultos en todo el mundo continúan expresan la enzima9. Expresión sostenida de la lactasa, conocida como persistencia de la lactasa, permite a los individuos a seguir digerir la leche y productos lácteos de una variedad de fuentes. Por el contrario, la pérdida de expresión de la lactasa puede conducir a la intolerancia a la lactosa, también conocido como el adulto-tipo hypolactasia (ATH), resultante de la incapacidad de descomponer la lactosa en el intestino. ATH se caracteriza por una estructura arriba de lactosa en el colon después de la ingestión de lactosa que contienen los productos alimenticios. En el colon, se fermenta la lactosa acumulada por la fauna microbiana intestinal, liberando gases como hidrógeno, metano y dióxido de carbono. La producción de estos gases en individuos con deficiencias de lactasa Enzima promover la distensión abdominal, aumento de flatulencia, dolor, náuseas y borborygmi (ruidos de estómago)7. Aumento de los niveles de lactosa en el tracto digestivo también puede llevar a heces sueltas.

El control de la expresión génica de LCT es modulado por polimorfismos en intrones del gen MCM6 cercano. Individuos con la expresión sostenida de lactasa llevan polimorfismos que funcionan como potenciadores distales fuertes de la expresión génica LCT , compensando así la normal por la regulación de la transcripción de la LCT durante el destete y en consecuencia mantener la expresión de la lactasa en la edad adulta3. Polimorfismos de reforzador se han sugerido por haber sido seleccionado positivamente después de la domesticación del ganado y los camellos en el Medio Oriente hace más de 5 mil años9,10.

Los síntomas resultantes de ATH pueden gestionarse por reducción de la ingesta de lactosa, por ejemplo mediante la eliminación de productos lácteos de la dieta. Un enfoque alternativo para la ATH y el método de elección para la enfermedad pulmonar crónica, es el uso de suplementos de lactasa, ampliamente disponibles en las farmacias. Estos suplementos proporcionan lactasa aislada de una variedad de fuentes, incluyendo levaduras y bacterias, en forma basadas en píldora o líquida que puede ser tomada con o añadida a la lactosa que contiene los alimentos. El suplemento hidroliza una parte de la lactosa presente en los alimentos a los productos glucosa y galactosa, así permitiendo su absorción y evitar la acumulación de sustrato de lactosa no digerida en el intestino.

Basado en el uso de suplementos de lactasa como una ayuda dietética, hemos desarrollado un experimento de laboratorio de enzimología simple adecuado para primer año biomédicos ciencia o farmacia estudiantes. Este experimento aprovecha de suplementos de lactasa disponible comercialmente y de Orto-nitrofenol -beta-D-galactopiranosida (ONPG) para proporcionar un punto final colorimétrico para medir la ruptura de los enlaces glucosídicos de lactasa ( Figura 3)11. ONPG actúa un sustrato artificial para la lactasa, que cuando se someten a hidrólisis por esta enzima produce d-galactosa y Orto-nitrofenol. Este último producto posee un color amarillo, absorción de luz en una longitud de onda de 420 nm. Mediante la cuantificación de los cambios de absorbancia a 420 siguiente nm la exposición de ONPG a lactasa, es posible estimar la actividad de esta enzima. Este experimento de laboratorio ofrece una demostración de la actividad enzimática de la hidrolasa. Construyendo en repeticiones adicionales y llevar a cabo ensayos en diferentes condiciones, es posible incorporar análisis más sofisticados de la cinética de la enzima, proporcionando un valioso ejemplo de la vida real de las enzimas en acción relevante para la salud humana.

Protocol

Nota: El siguiente protocolo fue desarrollado para celebrará a lo largo de dos horas (incluyendo la terminación de las hojas de trabajo en clase) en un laboratorio de enseñanza específico. Los pasos experimentales fueron deliberadamente puesto para excluir un análisis más detallado de la cinética de la enzima (llevado a cabo en el contexto de este curso utilizando datos del modelo); sin embargo, como se señaló en la discusión, el Protocolo prevé una plantilla de análisis más avanzados según nivel de logro de tiempo, las instalaciones y los estudiantes.

SEGURIDAD: Esta práctica debe llevarse a cabo según las reglas de práctica de laboratorio química buena (GCLP) — equipos de protección personal, incluyendo capa sujetada de laboratorio, guantes desechables y gafas de seguridad se deben usar en todo momento en el laboratorio .

1. extracción de la enzima

  1. Triturar una pastilla de lactasa, que contiene 200 mg de enzima, para un polvo incluso utilizando un mortero y una maja.
  2. Coloque el polvo resultante en un tubo de 15 mL con "suspensión" y resuspender en 10 mL de 100 mM fosfato tamponada salino (PBS).
  3. Vortex durante 1 minuto maximizar la extracción de la enzima.
  4. Transferir 1 mL de la suspensión a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y centrifugar por 1 min a 10.000 x g a partículas de sedimento.
  5. Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL con "Extracto de la lactasa".

2. observación de la reacción colorimétrica

  1. Lugar 390 μl de PBS de 100 m m en un tubo de 1,5 mL etiquetados "A la reacción".
  2. Añada 100 μl de solución ONPG de 5 mM y mezclar bien todo con un vórtex.
    PRECAUCIÓN: Este práctico utiliza Orto-nitrofenol -beta-D-galactopiranosida (ONPG) como sustituto de lactosa. ONPG es un compuesto fenólico, deben ser manejado con precaución. En caso de contacto con la piel con ONPG, la piel expuesta se debe lavar inmediatamente. Cualquier derrame debe ser limpiado inmediatamente con toallas de papel sean desechados en la corriente de residuos apropiada.
  3. Añadir 10 μl de extracto en el tubo de reacción A y mezcla bien con un vórtex.
  4. Observar la mezcla de reacción durante 5 minutos y anote cualquier cambio colorimétrico en la solución.

3. medición actividad enzimática

  1. Configurar dos tubos de 1,5 mL: uno marcado con "Reacción B", con un "Control".
  2. Añadir 390 μl de PBS de 100 mM a la reacción tubo B, 400 μL de PBS de 100 mM para el tubo de control y luego agregar 100 μl de 5 mM ONPG a cada tubo.
  3. Mezcle el contenido con un vórtex.
  4. Añada 10 μl de extracto de lactasa al tubo de reacción B, mezclar con un vórtex y permitir la reacción proceder durante 1 min a temperatura ambiente.
  5. Transcurrido 1 minuto, Añadir 500 μl de carbonato de sodio de 1 M a ambos tubos para inhibir la enzima lactasa al aumentar el pH, lo que termina la reacción.
  6. Transferir 500 μl de cada tubo en cubetas de espectrofotómetro limpia y medir la absorbancia a 420 nm con el espectrofotómetro.
  7. Cuenta la absorbancia de la reacción en B y muestras de control y luego restar el valor del control del valor de la reacción para obtener el cambio en la absorbencia debido a hidrólisis de ONPG en presencia de enzima activa.

4. efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

  1. Configurar control tres tubos y tres tubos de reacción según se describe en la sección 3 y etiquetar estos «4 ° C», "Temperatura ambiente" y "37 ° C".
  2. Tras adición de enzima extracto, incubar un tubo de hielo, uno a temperatura ambiente y otro a 37 ° C (en baño de agua previamente calentado).
  3. Permiten que las reacciones a seguir durante 1 minuto y luego terminar la reacción mediante la adición de 500 μl de carbonato de sodio de 1 M a cada tubo.
  4. Medir la absorbancia a 420 nm para cada tubo como se describe en la sección 3. Registrar los valores, restando el valor del control del valor de la reacción en cada caso.

Representative Results

Resultados representativos para la sección 2 del Protocolo se muestran en la Figura 4A. La reacción de control, en ausencia de la enzima lactasa, sigue siendo clara que la solución de reacción, que contiene extracto de la pastilla de lactasa, se vuelve amarilla como ONPG es hidrolizado liberando Orto- nitrofenol. Figura 4B muestra cuantificación utilizando unidades arbitrarias de la sección 4 del Protocolo, el siguiente análisis de las muestras utilizando el espectrofotómetro. Producción de Orto-nitrofenol es menor cuando la reacción se incuba en hielo y mayor cuando la reacción se lleva a cabo a 37 ° C.

Figure 1
Figura 1 : E. coli beta-galactosidasa. (A) estructura cristalina de la beta-galactosidasa de Escherichia coli, que muestra la estructura tetramérica de activo complejo. (B) Allolactose (mostrado en rojo) enlazado al sitio activo de la beta-galactosidasa. Imágenes generadas a partir de PDB 1JZ84. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Acción enzimática de la lactasa. Hidrólisis de lactosa por lactasa para producir beta-D-galactosa y beta-D-glucosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Hidrólisis de Orto-nitrofenol - beta -D-galactopiranosida. Hidrólisis ONPG por lactasa para producir beta-D-galactosa y Orto-nitrofenol (que es de color amarillo), lo que permite la estimación de la actividad de la lactasa por medición de absorbancia a 420 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4 : Hidrólisis ONPG. Resultados representativos de la hidrólisis ONPG, mostrando los tubos de control y reacción (A) y datos representativos de la sección 4 del Protocolo de grabado en hojas de trabajo en clase, que muestra cruda absorbancia en unidades arbitrarias en 420 nm, corregida para el fondo y a tres diferentes temperaturas (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Condición experimental Variables experimentales
Temperatura 0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Concentración de sustrato 0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Inhibición competitiva lactosa ONPG y 0 mM, 1 mM, 5 mM o 10 mM de 5 mM
Dependencia del tiempo 0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Desnaturalización de calor Extracto de lactasa se calienta a 100 ° C para 10 min antes del ensayo

Cuadro 1: potencial extendida condición experimental. Sugiere experimentos extendidos, a llevarse a cabo por triplicado, investigar aspectos específicos de la biología de la lactasa.

Discussion

Un conocimiento detallado y la comprensión de las enzimas, reacciones enzimáticas y cinética de la enzima se requiere para una amplia gama de temas que abarca la biología, la biomedicina y la farmacología. El protocolo descrito anteriormente utiliza lactasa como un ejemplo de una enzima relevante para la salud humana para demostrar reacciones enzimáticas, proporcionando habilidades clave que pueden utilizarse en experimentos de laboratorio más avanzados.

Este protocolo ha sido diseñado deliberadamente para ser tan robusto como posibles, permitiendo que estudiantes con poca o ninguna experiencia de laboratorio húmedo para producir resultados interpretables en un corto espacio de tiempo. En el año académico 2014/2015 en la Universidad de Reading, escuela de farmacia, un total de 144 alumnos, organizados en grupos de 3, llevó a cabo el experimento de "medición de lactasa", con todos los grupos capaces de detectar algún nivel de la actividad enzimática de tabletas de lactasa extractos.

Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es esencial que la extracción inicial es eficiente, lo que permite la solubilización de suficiente enzima activo para posteriores análisis. En nuestra experiencia, primer año estudiantes pueden lograr esto siguiendo el protocolo descrito; sin embargo algunas orientaciones de manifestantes laboratorio fue requerido en este punto. Aunque parece un punto evidente, un factor clave en el éxito de este protocolo es la capacidad de medir volúmenes, correctamente etiquetar tubos y seguir cuidadosamente las instrucciones. Mientras que un cierto nivel de habilidad puede suponer para muchos estudiantes, la supervisión cuidadosa y una solicitud clara para los estudiantes a pedir ayuda en caso de que no está seguros de qué hacer proporciona la mayor probabilidad de una prueba exitosa.

Evaluación de los estudiantes puede llevarse a cabo por la clase hoja de cálculo (disponible como material suplementario), pidiendo a los estudiantes observar datos de los experimentos, comente sus resultados y el enlace al fondo información y lectura del material de la Conferencia, o más detallado de evaluación de la clase con modelo datos permitiendo análisis cinéticos trató y evaluar.

El protocolo aquí presentado es un ejemplo simple de un ensayo de actividad de la lactasa bajo condiciones de laboratorio de enseñanza, y hay una gran oportunidad para aumentar la complejidad del experimento que permite análisis más avanzados. En particular, el protocolo presentado ofrece una introducción al concepto de cinética de la enzima pero no permite el análisis cinético de los datos experimentales. Como tal, se recomienda ver el protocolo descrito como una plantilla inicial de clases, con las precisiones que adaptarse a los objetivos específicos y los talentos de la cohorte de estudiantes llevando a cabo los experimentos. Ejemplos de experimentos extendidos podrían incluir: repetir las mediciones a diferentes temperaturas, utilizando concentraciones de sustrato diferentes para permitir el análisis estadístico, análisis cinético de los datos (convenientes para los estudiantes de bioquímica/mayores), a partir de varios diferentes tabletas y permitiendo a los estudiantes evaluar la actividad de la enzima en cada uno (con la adición de tabletas de control, adecuadas para estudiantes/mayores de ciencia forense), evaluar el impacto de la desnaturalización de calor o llevar a cabo la competencia experimentos de adición de lactosa o inhibidores de la lactasa (tabla 1). Un protocolo detallado para el análisis cinético de la lactasa ha sido previamente publicado12.

Una fuerza importante de este protocolo es que combina una introducción básica a la cinética de la enzimología y la enzima con un estudio de caso reales de enzimología en medicina. Esto hace que este laboratorio experimento de particular relevancia para los estudiantes de medicina, farmacia, ciencias biomédicas y temas relacionados. Lo importante, el hecho de que existe una condición médica grave y un problema dietético más generalizado asociada a catabolismo de la lactosa proporciona la oportunidad de plantear una amplia gama de problemas médicos y éticos con los estudiantes. Esto podría incluir las cuestiones relacionadas con las pruebas genéticas para afecciones y asociados debates relativos a la terapia genética y asesoramiento genético, así como el uso y venta de suplementos medicinales. Una limitación importante es que el Protocolo no permite para la estimación precisa de la concentración de enzima, debido al material de partida utilizado para la extracción. Una modificación para tener en cuenta esto, sin embargo, sería utilizar enzimas de grado reactivo para el análisis. Lo importante, esto permitiría también para el cálculo más preciso de la cinética de la enzima lactasa.

En conclusión, ensayando la actividad de la lactasa en un laboratorio de enseñanza entorno proporciona una introducción robusta, atractiva e interesante en el campo de la biología de la enzima para estadios iniciales universitarios.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Acknowledgments

PAL fue financiado por beca de investigación en Reino Unido un Parkinson (grant F1002). Este trabajo fue apoyado por una beca MRC de investigación investigador del nuevo (Señor/L010933/1) y MRC programa concede Señor/N026004/1 y PAL por beca BBSRC BB/M017222/1 a JET. Agradecemos a la cohorte 2014-15 de MPharm parte 1 estudiantes de la Universidad de Reading, para tomar parte en la primera iteración de este práctico y posteriores cohortes para su retroalimentación y la entrada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactase tablet Lamberts 8511-60
Phosphate buffered saline (powdered) Sigma P3813 Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM
ONPG Sigma N1127 Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM
Sodium Carbonate Sigma 451614 Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M
De-ionized water NA NA
Pestle and mortar VWR
Spectrophotometer Jenway 6315
Pipettes Gilson
15 mL tubes VWR
1.5 mL tubes Eppendorf
Spectrophotometer cuvettes Jenway
Vortex Vortex genie 2
Centrifuge Beckman
Ice bucket VWR
Water bath Thermo-Scientific
Weighing scales Thermo-Scientific

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References

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