तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विषाक्त पुफेरफिश की बेहतर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन-प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग

Genetics
 

Summary

एक बेहतर पोलीमरेज़ चेन तरल क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुफेरफिश प्रजातियों जीनोटाइपिंग के लिए प्रतिक्रिया प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता विधि वर्णित है। एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ पचा amplicons को अलग करने के लिए कार्यरत है। इस विधि oligonucleotides के monoisotopic जनता है, जो आधार संरचना की पहचान करने के लिए उपयोगी है स्पष्ट कर सकते हैं।

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Miyaguchi, H. Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (115), e54402, doi:10.3791/54402 (2016).

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Abstract

एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) -restriction टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) तरल क्रोमैटोग्राफी / electrospray आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस) द्वारा विषाक्त पुफेरफिश प्रजातियों जीनोटाइपिंग के लिए विधि के एक उन्नत संस्करण में वर्णित है। डीएनए निष्कर्षण एक सिलिका झिल्ली आधारित डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग किया जाता है। पीसीआर प्रवर्धन एक डिटर्जेंट मुक्त पीसीआर बफर का उपयोग करने के बाद, प्रतिबंध एंजाइमों प्रतिक्रिया समाधान सफ़ाई के बिना समाधान के लिए जोड़ रहे हैं। एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ और एक फूरियर उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर एक संशोधित Kingdon जाल विश्लेषक होने स्पेक्ट्रोमीटर, क्रमशः जुदाई और पता लगाने के लिए कार्यरत हैं। मोबाइल चरण, 400 मिमी 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol से मिलकर, 15 मिमी triethylamine (7.9 पीएच) और मेथनॉल, 0.4 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर दिया जाता है। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस विश्लेषण के लिए समय चक्र स्तंभ का संतुलन सहित 8 मिनट है। Deconvolution सॉफ्टवेयर एक आइसोटोप वितरण मॉडल ओ होनेoligonucleotide च जन स्पेक्ट्रम से इसी monoisotopic द्रव्यमान की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (रेंज 26-79 न्यूक्लियोटाइड) के विश्लेषण के लिए, जन सटीकता था 0.62 ± 0.74 पीपीएम (एन = 280) और उत्कृष्ट सटीकता और परिशुद्धता एक ताला बड़े पैमाने पर मानक के उपयोग के बिना 180 घंटे के लिए निरंतर थे।

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) न्यूक्लिक एसिड, मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) और electrospray आयनीकरण (ईएसआई) के तेजी से और विश्वसनीय पहचान के लिए एक स्वीकृत प्रौद्योगिकी आयनीकरण 1,2 के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। MALDI तकनीक को आम तौर पर एक समय की उड़ान (TOF) विश्लेषक के साथ संयुक्त है; हालांकि, MALDI-TOF एमएस के आवेदन कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स तक सीमित है (~ 25 न्यूक्लियोटाइड (एनटी)) बाद के विखंडन, अभिवर्तन गठन और कम आयनीकरण दक्षता 1,2 के कारण। इसके विपरीत, ईएसआई अब ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स (> 100 NT) के लिए लागू है, लेकिन कई के कई राज्यों के प्रभारी आयनों का आरोप ([एम-राष्ट्रीय राजमार्ग] एन) Biomacromolecules से एक साथ उत्पादन कर रहे हैं और इसलिए, analyte की बड़े पैमाने पर ऊपरी पार कर सकते हैं स्पेक्ट्रोमीटर की मी / z रेंज की सीमा। इस जटिल स्पेक्ट्रा की व्याख्या, यानी, एक आरोप राज्य श्रृंखला के परिवर्तन के लिए इसी मास में की आवश्यकता हैdeconvolution के माध्यम से।

एक छोटा सा अणु की बड़े पैमाने पर माप, monoisotopic जन की चोटी, यानी के मामले में, प्रत्येक तत्व का एकमात्र सबसे आम आइसोटोप युक्त अणु की बड़े पैमाने पर सबसे प्रचुर मात्रा में है और स्वाभाविक रूप से मनाया 3। आणविक वजन बढ़ता है, उच्च मी / z और monoisotopic पीक करने के लिए समस्थानिक वितरण पारियों आधारभूत शोर 3-5 से छिप जाता है। एक बार जब monoisotopic चोटी अब कोई 10 से अधिक केडीए 3 आम जनता के लिए detectable है, औसत आणविक जन monoisotopic बड़े पैमाने पर 5 के बजाय माप के लिए प्रयोग किया जाता है। ऐसे मामलों में, समस्थानिक वितरण में जो व्यक्ति चोटियों में से प्रत्येक 1 दा से अलग है ही देखा जा सकता है जब एक उच्च संकल्प जन विश्लेषक एक TOF, एक फूरियर संशोधित बदलने Kingdon जाल विश्लेषक 6, या एक फूरियर आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि के रूप में इस तरह के विश्लेषक के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, सबसे प्रचुर मात्रा में चोटी s हैometimes औसत आणविक जन 5 के साथ संगत नहीं। इन समस्याओं को सही analytes का निर्धारण करने के लिए कठिनाई पैदा कर सकते हैं।

स्थिर आइसोटोप की प्राकृतिक बहुतायत में भिन्नता और करने में कठिनाइयों का औसत आणविक जन के निर्धारण को देखते हुए, monoisotopic द्रव्यमान का माप biomolecules 3,4 की बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए आदर्श है। अभ्यास में, चाहे एक monoisotopic चोटी या मनाया जा सकता है नहीं, monoisotopic बड़े पैमाने पर सैद्धांतिक एक गणना की एक मॉडल analyte 4,7-10 से करने के लिए मनाया समस्थानिक वितरण के पैटर्न की तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। फिटिंग एल्गोरिथ्म 8 अब मालिकाना सॉफ्टवेयर में शामिल किया है।

ईएसआई एमएस के संदर्भ में, एक डीएनए द्वैध, शुद्धि और desalting की हदबंदी आयन दमन और अभिवर्तन गठन 2,10-14 के कारण आयनीकरण की विफलता से बचने के लिए प्रत्यक्ष माप के लिए आवश्यक हैं। इन प्रक्रियाओं troubl हैंesome, तथापि, पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों विश्लेषणात्मक व्यावसायिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), नमूना तैयार करने और ईएसआई एमएस रोगजनकों 15-20 का पता लगाने के लिए शामिल करने के लिए विकसित किया गया है। एक और दृष्टिकोण अलग होने के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) पेश कर रहा है। नियंत्रण रेखा coexisting पदार्थों से analytes की एक ऑन लाइन जुदाई प्रदान करता है और 21,22 आयनीकरण करने के लिए एक श्रमसाध्य नमूना तैयार करने से पहले की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एक एमएस-संगत मोबाइल चरण का उपयोग कर न्यूक्लिक एसिड की जुदाई ऐसी दवाओं, पेप्टाइड्स और प्रोटीन न्यूक्लियोटाइड की polyanionic प्रकृति के कारण के रूप में सबसे अन्य यौगिकों के लिए अधिक से अधिक कठिन है। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस के सबसे सफल उदाहरण आयन-जोड़ी के इस्तेमाल को शामिल रिवर्स चरण नियंत्रण रेखा। 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol के एक मोबाइल चरण (HFIP) -triethylamine (चाय) -methanol शुरू में Apffel एट अल द्वारा। अलग करने और कम ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 23 का पता लगाने के लिए प्रस्तावित किया गया था। नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस differentiatio के लिए जीनोटाइपिंग के आवेदनरोगज़नक़ प्रजातियों, एकल nucleotide बहुरूपताओं और कम मिलकर दोहराता की n एक केशिका बहुलक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ अब ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 1,21,24-33 अलग नहीं कर सकता है कि का उपयोग कर सूचना दी गई है।

जापान और संयुक्त राज्य अमेरिका में, गंभीर विषाक्त भोजन गलत पहचान और पुफेरफिश के अनुचित तैयारी के कारण हुई है, और इस तथ्य यह है कि वितरण और पुफेरफिश की तैयारी सख्ती से खाद्य सुरक्षा कानून 34,35 द्वारा नियंत्रित किया जाता है के बावजूद है। इसके अलावा, एक जानबूझकर पुफेरफिश निकालने का उपयोग हत्या जापान 36 में होती थी। इसलिए, पुफेरफिश प्रजातियों के भेदभाव दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और फॉरेंसिक जांच पहलुओं से आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि Takifugu rubripes पुफेरफिश के अन्य प्रकार की तुलना में कहीं अधिक महंगा है, एक भेदभाव क्षमता भी भोजन धोखाधड़ी जांच के संदर्भ में की जरूरत है।

इधर, मीटर का निर्धारण करने के लिए एक विस्तृत विधिनियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस द्वारा एक पीसीआर उत्पाद एक रिवर्स चरण सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ और एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने का onoisotopic बड़े पैमाने पर वर्णित है। विशेष रूप से, दृष्टिकोण विषाक्त पुफेरफिश पीसीआर प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) विधि 37, जो एमएस का उपयोग कर जानवरों की प्रजातियों में भेदभाव के लिए पहला उदाहरण है के उपयोग पर आधारित प्रजातियों के भेदभाव की अनुमति के लिए विकसित किया गया है।

Protocol

1. डीएनए निष्कर्षण

नोट: इस तरह के जेल वैद्युतकणसंचलन और नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस के रूप में डीएनए निष्कर्षण और बाद पीसीआर परीक्षाओं के लिए एक अलग कमरे का प्रयोग करें। इथेनॉल बफर 1 (युक्त guanidine हाइड्रोक्लोराइड) और धोने बफर 2 (guanidine हाइड्रोक्लोराइड युक्त नहीं) डीएनए निष्कर्षण किट प्रोटोकॉल के अनुसार धोने के लिए जोड़ें। मछली नमूने मछली के थोक विक्रेताओं और जापान में खुदरा बाजारों से प्राप्त किया गया।

  1. मछली के ऊतकों की 30-50 मिलीग्राम एक 0.5 मिलीलीटर या 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखें। (फिन और त्वचा के लिए छोड़कर) एक माइक्रो-रंग का उपयोग ऊतक स्क्वैश।
    नोट: फिन के मामले में भिगोने के लिए एक 0.5 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें।
  2. lysis बफर के 180 μl और proteinase कश्मीर और भंवर संक्षिप्त के 40 μl जोड़ें। 2 घंटा या रात भर के लिए एक ब्लॉक हीटर पर 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। संक्षेप में गर्मी के दौरान हर 15 मिनट vortexing द्वारा मिक्स।
    नोट: पूरा सेल आवश्यक नहीं है।
  3. पर 13,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। centrifugation के बाद, अगर एक छोटे से एमोतेल की UNT ऐसे जिगर के रूप में एक फैटी नमूना के मामले में सतह पर मौजूद है, यह त्यागें। एक नया 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  4. guanidine हाइड्रोक्लोराइड युक्त chaotropic बफर के 200 μl जोड़ें और vortexing द्वारा मिश्रण। फिर vortexing द्वारा इथेनॉल (99.5%) और मिश्रण के 200 μl जोड़ें।
  5. स्पिन स्तंभ एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा में मिश्रण स्थानांतरण। पर 13,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    सावधानी: क्योंकि guanidine ब्लीच के साथ उच्च प्रतिक्रियाशील यौगिकों के रूप में कर सकते हैं बर्बाद करने के लिए ब्लीच न जोड़ें।
  6. पर 13,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए धोने बफर 1 (युक्त guanidine हाइड्रोक्लोराइड) और सेंट्रीफ्यूज के 500 μl जोड़ें। के माध्यम से प्रवाह और संग्रह ट्यूब त्यागें।
  7. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह किट के साथ प्रदान की ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें। पर 20,000 एक्स जी 3 मिनट के लिए धोने बफर 2 और अपकेंद्रित्र के 500 μl जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें। एक नया करने के लिए स्पिन स्तंभ स्थानांतरण1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब।
  8. Pipet स्पिन स्तंभ झिल्ली के केंद्र के लिए क्षालन बफर के 200 μl। 1 मिनट के बाद, पर 6000 x जी 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  9. Pipet एक डिस्पोजेबल यूवी क्युवेट eluate के 50 μl और 220-300 एनएम पर eluate की यूवी स्पेक्ट्रम और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 260 एनएम पर absorbance के उपाय।
  10. 260 एनएम पर चोटी के साथ डीएनए की यूवी स्पेक्ट्रम की जाँच करें। सरल समीकरण का उपयोग अनुमानित डीएनए एकाग्रता की गणना "डीएनए एकाग्रता (एनजी / μl) 260 एनएम x 50 पर absorbance ="।
    नोट: विशिष्ट डीएनए एकाग्रता पुफेरफिश के पंख से निकाले गए 63 ± 30 एनजी / μl (एन = 20) है।
  11. डीएनए एकाग्रता अधिक से अधिक 10 एनजी / μl है, तो 5 एनजी / μl के लिए Tris EDTA (ते) बफर (पीएच 8) के साथ डीएनए नमूने पतला।
  12. -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर या पीसीआर प्रवर्धन (खंड 2) करने के लिए आगे बढ़ें।

2. पीसीआर

  1. प्रत्येक extr के लिए 25 μl पीसीआर सेट अपडीएनए नमूने, सकारात्मक नियंत्रण (0.2 माइक्रोन संश्लेषित oligonucleotide लक्ष्य ते बफर पीएच 8.0 में अनुक्रम वाले) एक स्वच्छ बेंच पर टेबल्स 1 और 2 के अनुसार बर्फ पर और नकारात्मक नियंत्रण (डीएनए नमूने के बजाय ultrapurified पानी) संक्रमण से बचने के लिए काम किया।
    नोट: आसान ऑपरेशन के लिए, टेम्पलेट डीएनए के बिना सभी अभिकर्मकों युक्त कॉकटेल के लिए पर्याप्त मात्रा में बनाने के लिए और इसे बांटना। डीएनए पोलीमरेज़ होने प्रूफरीडिंग गतिविधि का उपयोग पीसीआर उत्पाद के लिए 3 'ए overhangs के अलावा बचने के लिए।
  2. एक थर्मल साइक्लर तालिका 3 में दिखाया गया है चक्र कार्यक्रम के प्रयोग पर पीसीआर प्रवर्धन बाहर ले।

3. enzymatic पाचन

  1. समाधान पीसीआर समाधान के लिए 100 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 100 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी dithiothreitol और 500 मिमी NaCl युक्त के 2 μl जोड़ें।
  2. प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम की 1 μl (नाटकीय रहा और न्यूनतम समर्थन मूल्य में खोज) जोड़ें और धीरे मिश्रण। वें पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेतेermal साइक्लर।
  3. 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते शेष डीएनए पोलीमरेज़, जो एमएसपी आई द्वारा उत्पन्न चिपचिपा अंत भरता सक्रिय करने के लिए
  4. वैकल्पिक: 15 की 3.33 (wt%) के एक क्रॉस लिंक अनुपात (% सी, bisacrylamide का प्रतिशत) और एक polyacrylamide जेल एकाग्रता (% टी) का उपयोग कर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिक्रिया समाधान के प्रत्येक 2.5 μl विश्लेषण (% w / v) 38। फ्लोरोसेंट डीएनए दाग का उपयोग कर जेल दाग और एक एम्बर स्क्रीन का उपयोग कर एक नीली बत्ती transilluminator पर डबल कतरा डीएनए निरीक्षण करते हैं।
  5. clogging रोकने के लिए एक 0.2-0.5 माइक्रोन केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस के साथ प्रतिक्रिया समाधान फिल्टर है, जो विश्लेषणात्मक स्तंभ को नुकसान होगा।
  6. विश्लेषण जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एक पतला polypropylene शीशी और स्टोर करने के छानना स्थानांतरण।

4. नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस विश्लेषण

  1. HFIP के 67.2 ग्राम (सीए 42 एमएल) और एक 1 एल बोतल में चाय की 1.52 ग्राम (सीए 2.0 एमएल) वजन। ultrapurified पानी (नियंत्रण रेखा / एमएस gra के 955 मिलीलीटर जोड़ेंडी) और हलचल एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर जब तक अभिकर्मकों पूरी तरह से भंग कर रहे हैं। समाधान के एक विभाज्य लो और पीएच जांच (7.85 और 7.95 के बीच; आदर्श पीएच = 7.9) एक पीएच मीटर का उपयोग कर।
    नोट: बोतल के लिए विभाज्य लौटने के धातु आयनों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए नहीं है। अगर पीएच 7.9 नहीं है, पीएच को समायोजित करने और पीएच फिर से मापने के लिए या तो HFIP या चाय की एक छोटी राशि जोड़ सकते हैं।
  2. एक प्रत्यक्ष ठंडा पोर्टेबल रेफ्रिजरेटर (घरेलू उपयोग के लिए) का उपयोग वाष्पीकरण को रोकने के लिए बोतल का ठंडा करने के साथ तरल chromatograph की एक पंक्ति को बोतल से कनेक्ट। बी लाइन के लिए मेथनॉल के साथ भरा एक और बोतल कनेक्ट
  3. गार्ड स्तंभ और विश्लेषणात्मक स्तंभ (2.0 x 50 मिमी, mesopore आकार = 30 एनएम) तरल chromatograph से कनेक्ट करें। कॉलम को संतुलित करने के लिए प्रारंभिक मोबाइल चरण (95% और 5% बी) बहने लगे।
  4. एक calibrant 39 के रूप में 0.5 मिलीग्राम / एमएल सोडियम trifluoroacetate (3.5 पीएच) तैयार करें।
    1. Trifluoroacetic एसी के 50 मिलीग्राम (सीए 34 μl) वजनएक बीकर में आईडी।
    2. ultrapurified पानी की 30 मिलीलीटर जोड़ें और एक पीएच मीटर की सहायता से 10 मिमी सोडियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 3.5 पीएच को titrate।
    3. ultrapurified पानी के साथ 50 मिलीलीटर तक भरें। acetonitrile की 50 मिलीलीटर (नियंत्रण रेखा / एमएस ग्रेड) और मिश्रण जोड़ें।
    4. काम समाधान के एक हिस्से को ले लो और कमरे के तापमान पर स्टोर। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के बाकी स्टोर।
  5. इस प्रकार के रूप में सी-जाल से नाइट्रोजन दबाव कम करें।
    नोट: हाल फूरियर मास स्पेक्ट्रोमीटर, जो बरकरार प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं बदलने, दबाव को नियंत्रित करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर है।
    1. मास स्पेक्ट्रोमीटर की बाईं शीर्ष कवर निकालें। सी-जाल वाल्व छोड़ दिया अग्रभूमि के कोने पर है।
    2. नियंत्रण सॉफ्टवेयर का साधन स्थिति विंडो में उच्च वैक्यूम दबाव मूल्य की जाँच करें।
      नोट: मूल्य आमतौर पर है, 3 एक्स 10 -8 बार।
    3. घुंडी खींचो अनलॉक और घुंडी वामावर्त बारी के लिए बहुत धीरे-धीरे उच्च वैक्यूम प्रेस को कम करने के लिए1/3 (आमतौर पर, 1 एक्स 10 -8 बार) को Ure। संकेत दिया दबाव एक देरी ढंग से धीरे-धीरे परिवर्तन होना चाहिए। कम दबाव के बारे में चेतावनी संदेश पर ध्यान न दें। घुंडी बंद करने के लिए पुश।
    4. सुरक्षा के लिए शीर्ष कवर पुनर्स्थापित।
  6. सोडियम trifluoroacetate 39 का उपयोग कर मास स्पेक्ट्रोमीटर जांचना।
    नोट: डेली बड़े पैमाने पर अंशांकन इस प्रोटोकॉल के द्वारा बदला जा सकता है, हालांकि, निर्माता द्वारा सुझाव की सिफारिश की अंशांकन इस अंशांकन करने से पहले पूरा किया जाना चाहिए था।
    1. इस प्रकार के रूप स्कैन मापदंडों और ट्यूनिंग सॉफ्टवेयर के साधन नियंत्रण बॉक्स में गर्म ईएसआई स्रोत मानकों सेट: प्रकार स्कैन पूर्ण एमएस; स्कैन रेंज मी / z 500-4,000; विखंडन (में स्रोत टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) वोल्टेज 60 eV; polarity नकारात्मक; स्वत: प्राप्त नियंत्रण (एजीसी) को लक्षित 1 एक्स 10 6, अधिकतम इंजेक्षन समय 50 मिसे, म्यान गैस प्रवाह की दर 5; aux गैस प्रवाह की दर 0; झाडू गैस प्रवाह की दर 0; स्प्रे वोल्टेज 3 केवी; केशिका तापमान 320 डिग्री सेल्सियस; एस लेंस रेडियोफ्रीक्वेंसी (आरएफ) स्तर 100; हीटर का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस।
      1. इनपुट नकारात्मक आयनों की सूची मी / z 792.85908, 1064.80870, 1336.75832, 1608.70794, 1880.65755, 2152.60717, 2424.55679, 2696.50640, 2968.45602, 3376.38045 के रूप में नजर रखी जा सके।
    2. गर्म ईएसआई जांच मास स्पेक्ट्रोमीटर (स्थिति बी) के इंटरफेस के करीब ले। जांच और एक ट्यूब के साथ एक सिरिंज कनेक्ट।
    3. 10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर लगातार calibrant दिखे एम्बेडेड सिरिंज पंप का उपयोग कर। अनुकूलित अंशांकन तालिका में केवल 6 कम द्रव्यमान आयनों (मी / z 792.85908-2,152.60717) की जाँच करें।
      1. अंशांकन के साथ आगे बढ़ें बाद संकेतों की तीव्रता स्थिर हो जाता है। अंशांकन के बाद, केवल छह उच्च द्रव्यमान आयनों (मी / z 1880.65755-3376.38045) की जाँच करें और अंशांकन के साथ आगे बढ़ें। एक बार में सभी आयनों का उपयोग विफलता से बचने के लिए औजार से बचें।
  7. appropria को जांच के लिए ले जाएँ0.4 मिलीग्राम / मिनट (स्थिति डी) और के प्रवाह की दर के लिए ते स्थिति एक निष्क्रिय धातु ट्यूब के साथ तरल chromatograph से कनेक्ट।
  8. इस प्रकार के रूप ट्यूनिंग सॉफ्टवेयर के साधन नियंत्रण बॉक्स में गर्म ईएसआई स्रोत मापदंडों के सेट: म्यान गैस प्रवाह की दर 50; aux गैस प्रवाह की दर 15; झाडू गैस प्रवाह की दर 1; स्प्रे वोल्टेज 2.5 केवी; केशिका तापमान 350 डिग्री सेल्सियस; एस लेंस आरएफ स्तर 100; हीटर तापमान 350 डिग्री सेल्सियस।
  9. भूमिका निभाई सेटअप विंडो में मास स्पेक्ट्रोमीटर के अधिग्रहण के मानकों सेट इस प्रकार है: विधि अवधि 8 मिनट; वाल्व, मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए 3.5-6 मिनट, 0-3.5 और 6-8 मिनट बर्बाद करने के लिए हटाने; 6 मिनट के लिए क्रम 3.5; नकारात्मक polarity; स्रोत सीआईडी ​​वोल्टेज 15.0 EV में; microscans 3; नाममात्र संकल्प शक्ति (मीटर की ऊंचाई पर / z 200) 140000; एजीसी लक्ष्य 1 एक्स 10 6; अधिकतम आयन समय 50 मिसे; स्कैन 1 की संख्या; स्कैन रेंज मी / z 700-3,500; स्पेक्ट्रम डेटा प्रकार प्रोफ़ाइल।
  10. तरल chromatograph के निर्धारित मापदंडों इस प्रकार है: स्तंभ ओवन का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस; samplई ट्रे तापमान 10 डिग्री सेल्सियस; ढाल कार्यक्रम 0-0.5 मिनट 5% बी, 0.5-1 मिनट 5-30% बी, 1-3.5 मिनट में 30-40% बी, 3.5-5 मिनट 40-98% बी, 5-6 मिनट 98% बी, 6 6.05 मिनट 98-5% बी, 6.05-8 मिनट 5% बी; प्रवाह की दर 0.4 मिलीग्राम / मिनट।
  11. शुद्ध शीशियों के नीचे से दोहन से बुलबुले। नमूना रैक पर नमूना शीशियों सेट और autosampler का उपयोग कर विश्लेषण शुरू करने के लिए एक नमूना के 1.0 μl इंजेक्षन।
  12. वेब ब्राउज़र को अपडेट के साथ कच्चे डेटा फ़ाइलों को खोलने और पुष्टि करते हैं कि सभी अधिग्रहण सफलतापूर्वक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित, खत्म हो रहे हैं।
    नोट: आमतौर पर, दो या तीन चोटियों 4-5.5 मिनट की एक प्रतिधारण समय कुल आयन वर्तमान वर्णलेख में मनाया जाएगा जब पुफेरफिश डीएनए सफलतापूर्वक प्रवर्धित और पच जाता है।

5. Deconvolution और व्याख्या

  1. deconvolution सॉफ्टवेयर शुरू करो। प्रयोग चुनें प्रकार "ऑटो निकालने (isotopically सुलझाया)"।
  2. निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक विधि संपादित करें: उत्पादन बड़े पैमाने पर एम; एस / एन thresholडी 3, रिश्तेदार बहुतायत दहलीज 0; नकारात्मक चार्ज हाँ; वर्तमान वर्णलेख (XIC) आयन निकाले गणना हाँ, मी / z रेंज 700-3,500; प्रभारी वाहक एच +; पता चला शुल्क 3 की न्यूनतम संख्या; आइसोटोप अनुपात न्यूक्लियोटाइड; फिट कारक 80%; शेष सीमा 0%; ओवरलैप पर विचार हाँ; रेंज 3-50 चार्ज; न्यूनतम तीव्रता 1; उम्मीद तीव्रता त्रुटि 3।
    1. एक नई विधि के रूप में सहेजें और इसे चुनें।
  3. निर्देशिका जहां कच्चे डेटा फ़ाइलें मौजूद चयन करें। कच्चे डेटा फ़ाइलों विश्लेषण किया जा चयन करें और क्लिक करें बटन 'कतार में जोड़ें।
  4. deconvolution शुरू करने के लिए 'भागो कतार' टैब पर 'रन' बटन पर क्लिक करें।
  5. कतार पूरा हो गया है के बाद, एक पंक्ति का चयन करें और deconvolution के परिणामों को प्राप्त करने के लिए ऊपरी कैप्शन में क्लिक करें 'ओपन परिणाम'।
  6. तालिका 4 का उपयोग कर 4-5.5 मिनट की एक अवधारण समय पर चोटियों से निकाली गई monoisotopic जनता से परिणामों की व्याख्या।

Representative Results

तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम 100-400 μl / मिनट के प्रवाह दरों पर लंबी ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स की जुदाई के लिए मूल्यांकन किया गया। एक विस्तृत ताकना octadecyl कार्बन श्रृंखला (सी 18) -bonded कण सिलिका स्तंभ (एक), एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाली (styrene-divinylbenzene) (पी एस-डीवीबी) केवल पत्थर का खंभा स्तंभ (ख) और एक सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ ( ग) की तुलना में थे (चित्रा 1)। डीएनए duplexes (26, 37 और 53 बीपी) के तीन जोड़े अलग सभी स्तंभों का उपयोग कर रहे थे, और सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ बाद के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था।

टी की पेशी से निकाले गए एक डीएनए नमूने के विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम के रूप में चित्रा 2A में दिखाया गया rubripes, चित्रा 2 में दिखाया गया है। isotopically सुलझाया चोटियों, सफलतापूर्वक monoisotopic द्रव्यमान की गणना के लिए आवश्यक हैं। सैद्धांतिक और Measटी का आश्वासन दिया monoisotopic बड़े पैमाने पर rubripes चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है। क्योंकि endonucleases के साथ पाचन शुद्धि के बिना सिर्फ पीसीआर प्रवर्धन के बाद किया जाता है, 3'-चिपचिपा एमएसपी मैं endonuclease द्वारा उत्पन्न अंत शेष डीएनए पोलीमरेज़ के साथ भरा है। सिंथेटिक डीएनए टेम्पलेट्स से निकाली गई amplicons के विश्लेषण के अनुसार, जन सटीकता -2.48 से 2.40 पीपीएम (औसतन 0.62 ± 0.74 पीपीएम, एन = 280) तक बताया गया। इस प्रकार, 3 पीपीएम के एक बड़े पैमाने सहिष्णुता प्रजातियों फर्क (तालिका 4) के लिए इस्तेमाल किया गया था। तालिका का उपयोग करना, बाजारों और दुकानों से प्राप्त पुफेरफिश नमूने के सभी ठीक से विशिष्ट प्रजातियों 37 के रूप में भेदभाव कर रहे थे।

टी के सिंथेटिक डीएनए टेम्पलेट से प्राप्त नमूने के विश्लेषण के अनुसार समय-समय पर chrysops, analytes की सभी monoisotopic जनता को सफलतापूर्वक पर ले लिए भीतर ± 3 पीपीएम निर्धारित किया गया हैकिसी भी बड़े पैमाने पर अंशांकन बिना एएसटी 180 मानव संसाधन (चित्रा 3)। इसका मतलब यह है कि बड़े पैमाने पर अंशांकन एक साप्ताहिक आधार पर की आवश्यकता होगी।

आकृति 1
चित्रा 1: पीसीआर RFLP टी का संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट से निकाली गई उत्पाद की कुल आयन वर्तमान chromatograms pardalis एक सी 18 -bonded कण सिलिका स्तंभ (ए, 3 × 250 मिमी, कण आकार 3 मीटर), एक पाली (styrene-divinylbenzene) का उपयोग (पी एस-डीवीबी) केवल पत्थर का खंभा स्तंभ (बी, 1.0 × 250 मिमी) और एक सी 18 -bonded केवल पत्थर का खंभा सिलिका स्तंभ (सी, वर्तमान पद्धति) (क) के लिए शर्तें:। प्रवाह की दर 0.2 मिलीग्राम / मिनट; मेथनॉल के अनुपात, 0-2 मिनट 5%, 2-5 मिनट के 5% -25%, 5-20 मिनट 25% -40%, 20-35 मिनट 40% -98%, 35-50 मिनट 98%, 50 51 मिनट 98% -5%, 51-65 मिनट 5%। के लिए शर्तें (ख):प्रवाह की दर 0.1 मिलीग्राम / मिनट; मेथनॉल के अनुपात, 0-2 मिनट 5%, 2-5 मिनट के 5% -25%, 5-35 मिनट 25% -40%, 35-40 मिनट 40% -98%, 40-55 मिनट 98%, 55 56 मिनट 98% -5%, 56-70 मिनट 5%। दोनों स्तंभों के लिए तापमान 20 डिग्री सेल्सियस था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: टी के कच्चे मांसपेशियों का विश्लेषण करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम rubripes। (एक) विशिष्ट कुल आयन वर्तमान chromatograms और जन स्पेक्ट्रम। (ख) पीसीआर RFLP टी का संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट से व्युत्पन्न उत्पादों की सैद्धांतिक और मापा monoisotopic जनता rubripes। एक बड़ी देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की आर संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3:। स्थिरता परीक्षण पचा amplicons टी के सिंथेटिक डीएनए से निकाली गई chrysops हर 10 घंटा विश्लेषण किया गया। मास अंशांकन परीक्षण के दौरान प्रदर्शन नहीं कर रहा था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नाम अनुक्रम
lago86F 5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3'
taki114F 5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3'
fugu86-114R 5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3'

तालिका 1: पीसीआर प्राइमरों।

पीसीआर अभिकर्मक मात्रा का इस्तेमाल किया अंतिम एकाग्रता
Ultrapurified पानी 15.75 μl
डिटर्जेंट मुक्त 5x बफर 5.0 μl 1x
dNTP मिश्रण (10 मिमी प्रत्येक) 0.5 μl 0.2 मिमी
प्राइमर मिश्रण (10 माइक्रोन के lago86F, taki114F और fugu86-114R के प्रत्येक ते बफर पीएच 8.0 में) 1.0 μl 0.4 माइक्रोन के प्रत्येक
डीएनए पोलीमरेज़ (2.5 यूनिट / μl) 0.25 μl 0.1 यूनिट / μl
ते बफर पीएच में टेम्पलेट डीएनए 8.0 (5.0-10 एनजी / निकाले नमूना के लिए μl, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सिंथेटिक डीएनए के लिए 0.2 माइक्रोन) 2.5 μl 0.5-1.0 nनिकाले डीएनए के लिए जी / μl और सिंथेटिक डीएनए के लिए 20 एनएम
कुल: 25 μl

तालिका 2: एक 25 μl पैमाने पर पीसीआर के अवयव।

चक्र शर्त समारोह
1 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट प्रारंभिक विकृतीकरण
2 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस विकृतीकरण
3 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस एनीलिंग
4 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस बढ़ाव
5 2-4 (पूरी तरह से 30 चक्र) दोहराएँ
6 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट अंतिम बढ़ाव
7 नमूना को हटाने की जब तक 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो

तालिका 3: पीसीआर कार्यक्रम।

4.0-5.5 मिनट की अवधारण समय पर पीक नंबर श्रृंखला में तीसरी शिखर की monoisotopic द्रव्यमान (डीए) श्रृंखला में दूसरी चोटी के monoisotopic द्रव्यमान (डीए) पुफेरफिश प्रजातियों
छोटे किनारा बड़ी किनारा छोटे किनारा बड़ी किनारा
2 15890.707-15890.803 16177.531-16177.629 एल inermis
15921.702-15921.797 16146.537-16146.634 एल gloveri
15930.713-15930.809 16137.525-16137.622 एल lunaris
15937.697-15937.792 16131.537-16131.634 एल wheeleri
24173.034-24173.179 24566.905-24567.053 टी chrysops
3 16295.706-16295.804 16467.610-16467.709 11341.851-11341.919 11466.875-11466.944 टी pardalis
टी snyderi
टी ocellatus
टी xanthopterus
टी stictonotus
11654.908-11654.978 11770.920-11770.991 टी niphobles
16296.701-16296.799 16468.605-16468.704 टी rubripes
16311.701-16311.799 16452.610-16452.709 टी poecilonotus
टी exascurus
16320.713-16320.811 16443.599-16443.697 टी porphyreus
टी obscurus
16599.751-16599.851 16780.667-16780.767 टी vermicularis

सारणी 4: नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस से निकाली गई monoisotopic जनता से पुफेरफिश के भेदभाव।

तालिका 5
तालिका 5: प्रवर्धित डीएनए अनुक्रम (क) के अनुक्रम के समान है।कि अन्य प्रजातियों पुफेरफिश तालिका 4 में वर्णित के रूप में की। यहां इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

डीएनए निकालने के लिए, रक्त और ऊतकों से डीएनए निकालने के लिए एक वाणिज्यिक किट मामूली संशोधन (proteinase कश्मीर की राशि और सेल समाधान की centrifugation) के साथ निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है। हालांकि, किसी भी निकासी किट के रूप में लंबे समय के रूप में सेलुलर डीएनए उचित वसूली और पीसीआर के लिए पवित्रता के साथ निकाला जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि मांसपेशियों, पंख, लीवर, अंडाशय, और त्वचा 37 का उपयोग कर परीक्षण किया गया है। फिन जो proteinase लालकृष्ण ताजा, जमे हुए, सूखे उबला हुआ और पके हुए पुफेरफिश नमूने सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया 37 के साथ तेजी से सेल में सक्षम बनाता है बड़े सतह क्षेत्र, की वजह से विशेष रूप से उपयुक्त है।

पीसीआर प्राइमर सेट (तालिका 1) पुफेरफिश के लिए बनाया गया है और mitochondrial -16 पुफेरफिश की ribosomal शाही सेना जीन बढ़ाता है। बढ़ाना लक्ष्य डीएनए 114-115 बीपी (जीनस Takifugu) और 86 बी पी (जीनस Lagocephalus) (5 तालिका) है। विधि विकास की सुविधा के लिएNT, संश्लेषित लक्ष्य दृश्यों होने ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स बजाय प्रामाणिक पुफेरफिश नमूनों को एकत्रित करने की संदर्भ के लिए इस्तेमाल किया गया। प्राइमर सेट एक और प्राइमर उद्देश्य के जवाब में सेट द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, तथापि, enzymatic पाचन के बाद अंतिम डीएनए लंबाई NT कम से कम 100 जन स्पेक्ट्रम सफल deconvolution के लिए आवश्यक की गुणवत्ता को बनाए रखने के संदर्भ में किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, सी-जाल में नाइट्रोजन दबाव कम किया जाना चाहिए जब लक्ष्य oligonucleotide के बारे में 75 NT से अधिक लंबी है और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता में सफल deconvolution के लिए अपर्याप्त है। ऐसी सीमाओं साधन सॉफ्टवेयर में हाल की घटनाओं के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है, प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में अन्यथा चेसिस के अंदर सी-जाल के लिए वाल्व देखते जाना चाहिए। नमूना तैयार करने के लिए के रूप में, डिटर्जेंट मुक्त अभिकर्मकों के उपयोग के उचित शिखर आकार, पर्याप्त शिखर तीव्रता और स्थिर अवधारण समय 31 के मामले में बाद में नियंत्रण रेखा के लिए महत्वपूर्ण है।

21,24-33, एक सी 18 रिवर्स चरण कण सिलिका स्तंभ 23,40,41 और एक हाइड्रोफोबिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) स्तंभ 42 नियंत्रण रेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है / oligonucleotides के ईएसआई एमएस विश्लेषण। उनमें से, केशिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ जुदाई क्षमता के मामले में दूसरों से बेहतर है, हालांकि, केशिका केवल पत्थर का खंभा पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल स्तंभ घर में बना है और एक कम प्रवाह दर (2 μl / मिनट) है, जो इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता पर संचालित किया गया था माइक्रो नियंत्रण रेखा को समर्पित किया। आसान आपरेशन की सुविधा के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम उच्च प्रवाह दर (100-400 μl / मिनट) पर लंबी ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स की जुदाई के लिए मूल्यांकन किया गया। डीएनए duplexes (26, 37 और 53 बीपी) के तीन जोड़े कॉलम उपर्युक्त का उपयोग कर अलग हो गए थे, हालांकि, सी 18 -bonded कण सिलिका स्तंभ और पी एस-डीवीबी केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के चक्र बार 65 और 70 मिनट थे, क्रमशः है, जबकि सी की है कि (चित्रा 1) था। ध्यान में तेजी से विश्लेषण ले रहा है, सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ सीमित जुदाई क्षमता के बावजूद हमारे उद्देश्यों के लिए चुना गया था; हालांकि शेष दो कॉलम जब बेहतर जुदाई की आवश्यकता है नियोजित किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, एक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के मामले में, वहाँ कोई मध्य मात्रा है और मोबाइल चरण ठोस चरण के छिद्रों के माध्यम से प्रवाह करने के लिए, जबकि एक सुसंगत पथ की लंबाई को बनाए रखने के लिए, इस प्रकार एक कुशल जुदाई 27 को सक्षम करने के लिए मजबूर हो जाएगा। ऐसी प्रक्रियाओं बड़े अणुओं की धीमी गति से प्रसार के रूप में इस तरह के एक oligonucleotide के रूप में प्रकट होता है, विशेष रूप से Biomacromolecules के विश्लेषण में। एक केवल पत्थर का खंभा स्तंभ के व्यावहारिक गुण का एक यह है कि वापस दबाव एक कण सिलिका स्तंभ 27 की तुलना में कम है। उच्च प्रवाह दर (400 μl / मिनट) और कम स्तंभ तापमान (20 डिग्री सेल्सियस), की अधिकतम वापस दबाव के बावजूदप्रणाली 12.5 एमपीए 37 था। यह एक लंबी oligonucleotide के तेजी से विश्लेषण के लिए एक सी 18 -bonded सिलिका केवल पत्थर का खंभा स्तंभ का लाभ का पहला प्रदर्शन है। उच्च प्रवाह की दर के कारण, इंटरफेस में सूक्ष्म नियंत्रण रेखा और सटीक संरेखण के लिए एक समर्पित साधन की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, एक गर्म ईएसआई जांच डीएनए द्वैध अलग कर देना और के रूप में बाद में वर्णित डीएनए के आयनीकरण की सहायता के लिए आवश्यक है।

आयन जोड़ी क्रोमैटोग्राफी सामान्यतः oligonucleotides के एमएस-संगत अलग होने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, एक आयन-जोड़ी अभिकर्मक आम तौर पर ईएसआई प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप और ईएसआई-एमएस की संवेदनशीलता कम हो जाती है। इसलिए, HFIP अक्सर oligonucleotide की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए मोबाइल चरण के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, HFIP (क्वथनांक 59 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल (क्वथनांक 65 डिग्री सेल्सियस) और इसलिए, विलायक के इस नुकसान पीएच बढ़ जाती है और आयन जोड़ी अभिकर्मक की हदबंदी को बढ़ावा देता है (यानी, चाय) से पहले इंटरफेस में तेजी से वाष्पीकृतoligonucleotide से। क्योंकि वर्तमान पद्धति एक गर्म ईएसआई जांच, जो 350 डिग्री सेल्सियस पर गर्म नाइट्रोजन गैस के साथ eluate nebulizes कार्यरत हैं, इस आशय पर बल दिया हो सकता है। क्योंकि धातु का पता लगाने के आयनों 33 के साथ अभिवर्तन गठन में कमी की जीनोटाइपिंग विश्लेषण के लिए; HFIP-चाय बफर के बजाय, Erb और Oberacher cyclohexyldimethylammonium एसीटेट (पीएच 8.4 CycHDMAA) की सिफारिश की। लेखकों deduced है कि CycHDMAA खुद धातु अभिवर्तन के गठन को दबा दिया। साहित्य के बावजूद, महत्वपूर्ण अभिवर्तन गठन वर्तमान पद्धति में नहीं रखा गया है। इसके अतिरिक्त, HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली की उल्लेखनीय लाभ यह है कि शिखर क्षेत्र HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली के साथ प्राप्त 17 बार जब टी के एक 86 बीपी amplicon का विश्लेषण CycHDMAA-acetonitrile प्रणाली से प्राप्त है कि अधिक से अधिक से अधिक किया गया है poecilonotus (डेटा) नहीं दिखाया। HFIP-चाय-मेथनॉल प्रणाली का एक नुकसान यह है, तथापि, CycHDMAA-acetonitrile व्यवस्था करने के लिए लागत में वृद्धि हुई रिश्तेदार है।

monoisotopic द्रव्यमान की गणना गुणा आयनों का आरोप लगाया समस्थानिक चोटियों की जुदाई की आवश्यकता है। इसलिए, संकल्प उपस्थित विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि अपेक्षित संकल्प शक्ति analyte की आधार जोड़ी लंबाई पर निर्भर है, पारंपरिक TOF एनालाइजर, जो हजारों के कई दसियों के एक संकल्प की शक्ति है, लघु ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के विश्लेषण के लिए सीमित किया जा सकता है।

तालिका 4 में दिखाया गया है सैद्धांतिक monoisotopic जनता analytes की इसी आधार रचनाओं से गणना की गई। वैकल्पिक रूप से, Muddiman एट अल। एक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग सटीक जन 43 से आधार संरचना गणना करने के लिए विकसित की है। ऐसा ही एक कार्यक्रम स्वचालित ईएसआई एमएस प्रणाली 16-18 में एकीकृत किया गया था। क्योंकि एक मापा monoisotopic बड़े पैमाने पर हमेशा के लिए एक अनूठा आधार संरचना ओ के अनुरूप नहीं है इन एल्गोरिदम का उपयोग वर्तमान पद्धति की मजबूती सुधार हो सकता है3 पीपीएम अपरिहार्य माप त्रुटि से उत्पन्न की बड़े पैमाने पर सहिष्णुता के पंख। दुर्भाग्य से, हम वर्तमान अध्ययन के लिए इन सॉफ्टवेयर उत्पादों को प्राप्त नहीं कर सका।

क्योंकि वर्तमान पद्धति के आधार संरचना का विश्लेषण पर आधारित है और एक प्रक्रिया विशेष रूप से पुफेरफिश के लिए डिजाइन को शामिल नहीं करता उपस्थित monoisotopic बड़े पैमाने पर आधारित प्रजातियों दृढ़ संकल्प न केवल पुफेरफिश के भेदभाव के लिए बल्कि अन्य डीएनए बहुरूपताओं का पता लगाने के लिए उपयुक्त हो सकता है। डीएनए बहुरूपता का पता लगाने के लिए के रूप में, समर्पित ईएसआई एमएस प्रणाली पूरी तरह से स्वचालित और आसान काम है, इस तरह के रोगजनकों 15,17,18,20,30 का पता लगाने के रूप में नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके विपरीत, वर्तमान पद्धति आम अनुसंधान यंत्र और उपकरण और इसलिए, अनुसंधान उपयोगों के लिए उपयुक्त के साथ संभव है। ईएसआई एमएस पहले से ही इस तरह के एकल nucleotide बहुरूपता 13,28,32, लघु मिलकर पुनरावृत्ति 26 के रूप में मानव डीएनए बहुरूपता करने के लिए लागू किया गया हैऔर mitochondrial डीएनए 16,19 analsis। माइक्रो आरएनए भी केशिका नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस 44 के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। ये प्रकाशित आवेदन भी वर्तमान विधि द्वारा महसूस किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि जैसे एंटीबायोटिक्स की बातचीत और ribosomal शाही सेना 45 कम तापमान जुदाई के कारण के रूप में oligonucleotide और कम आणविक भार यौगिकों, के बीच बातचीत की निगरानी के लिए उपयुक्त हो सकता है। ऐसे मामलों में, ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स और कम आणविक वजन यौगिकों में एक साथ पता लगाया जाना चाहिए, नियंत्रण रेखा / ईएसआई एमएस का उपयोग करने का एक फायदा है।

वहाँ एक सीमा है कि इस तरह के इंस्ट्रूमेंटेशन सेंगर अनुक्रमण और वास्तविक समय पीसीआर के रूप में पारंपरिक तकनीक में के रूप में समानांतर विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान पद्धति को पहचानती ही आधार संरचना और एक ही अणु के भीतर किसी भी आधार प्रतिस्थापन प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, एमएस आधारित डीएनए यहाँ वर्णित विश्लेषण अभी भी अवधि में योग्यता हो सकता हैडीएनए बाध्यकारी ऐसी जेल वैद्युतकणसंचलन और वास्तविक समय पीसीआर के रूप में डाई आधारित तकनीकों के साथ तुलना में सटीकता की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Qiagen 69504 DNA extraction kit
Proteinase K Qiagen 19131
Ethanol (99.5+ vol%) Wako 054-07225 For dilution of wash buffers
TE buffer (pH 8.0) Wako 310-90023 For dilution of DNA sample
PCR primer Fasmac NA Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier
Template DNA Eurofins Genomics NA Purified by HPLC by the supplier
Ultrapurified water NA NA Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation
Detergent Free 5x Phusion HF Buffer Thermo Fisher F-520L Use instead of the provided buffer of DNA polymerase
Pfu-X DNA polymerase Jena Bioscience PCR-207S
dNTP mix (20 mM each) Jena Bioscience NA Supplied with the DNA polymerase
10× Universal buffer M Takara Bio NA Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl
Dra I Thermo Fisher FD0224 Restriction enzyme
Msp I Thermo Fisher FD0544 Restriction enzyme
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) Fluka 42060-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Triethylamine (TEA) Fluka 65897-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 For preparation of calibrant.
Sodium hydroxide (1.0 M) Fluka 72082 Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.
Acetonitrile Fluka 34967 For preparation of calibrant, LC/MS grade.
Methanol Kanto 25185-76 For mobile phase, LC/MS grade.
Water Thermo Fisher W6-1 For mobile phase, LC/MS grade.
Microcentrifuge tube (0.5 ml) Eppendorf 0030123301 PCR clean grade
Microcentrifuge tube (1.5 ml) Eppendorf 0030123328 PCR clean grade
UVette Eppendorf 0030106300 Disposable UV cuvette.
Gel Green Biotium 41004 Fluorescent DNA stain
Cosmospin filter G (0.2 μm) Nakalai Tesque 06549-44 Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.
300 μl PP screw vial American Chromatography Supplies V0309P-1232
Preassembled screw cap and septa Finneran 5395-09R
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) Kyoto Monotech 2050H30ODS Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard column Kyoto Monotech GCSET-ODS3210 Holder included.
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) Imtakt CW036 C18-bonded particulate silica column
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) Thermo Fisher 066640 Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column
Themo Mixer C Eppendorf 5382 000.023 For digestion of fish tissues.
Spectrophotometer Shimadzu UV-3150 Quantification of DNA concentration.
Thermal cycler Bio-Rad T100
Portable refrigerator Twinbird D-CUBE For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.
Ultimate 3000 liquid chromatograph Thermo Fisher NA
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher NA Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.
Protein deconvolution 3.0 Thermo Fisher NA Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.

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