타액 항체 멀티 플렉스 면역을 개발하는 것은 환경 병원체의 인체 노출을 측정하는

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

병인 및 환경 병원체의 인체 노출의 영향에 따라서, 노출 및 감염을 사용하여 비용 효과적인, 높은 처리량 접근 방식을 평가하는 능력이 필수 불가결 한 것, 전세계 주요 관심사이고. 이 논문은 다수의 병원체를 동시에 인간 타액 항체의 존재를 측정 할 수있는 비드 기반 다중 면역 개발 및 해석을 설명한다. 그것은, 비 침습적 저렴하고 혈청보다 수집하기 쉽기 때문에 침이 응용 프로그램에서 특히 매력적이다. 환경 병원체로부터 항원 카르 미립자 (비드)에 커플 링 비드 기반 용액 상 분석을 이용하여 인간의 타액 샘플의 매우 작은 양의 항체를 측정하는데 사용 하였다. 구슬은 캄 필로 박터 jejuni와, 헬리코박터 파이로리, 톡소 포자충, noroviruses (G I.1과 G II.4)에서 항원과 A 형 간염 바이러스와 결합되었다. 항원이 충분히에 연결되었는지 확인하려면비드가 결합은 비 오티 닐화 항 - 종 차 검출 항체 및 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 R 기자 (SAPE)와 인큐베이션 한 후, 종 특이 동물 유래 기본 캡쳐 항체를 사용하여 확인 하였다. 그것은 임의의 항원에 결합되지 않은 것을 제외하고 비특이적 결합을 측정하기위한 대조군으로서, 하나의 비드 세트는 다른 동일하게 처리 하였다. 항원 - 결합 및 제어 비드는 유동 세포 계측법의 원리에 기초하여 높은 처리량 분석기상에서 측정 전진 수집 된 인간 타액 샘플과 함께 배양하고, 각 항원에 대한 항체의 존재는 중간 형광 세기 단위 (MFI)를 측정했다 . 다중화 면역 적은 샘플 이상의 데이터를 포함하는 장점들을 갖는다; 비용 절감과 노동; 과 능력은 관심이 많은 대상에 분석을 사용자 정의합니다. 결과 침 다중 면역 especia가 될 수있는 이전의 노출과 감염을 식별 할 수있는 것을 나타내는큰 인간 집단을 포함하는 감시 연구 에서야 베드로 유용합니다.

Introduction

설사 관련 질병의 88 %가 전 세계적으로 약 150 만 명이 사망 원인이 오염 된 물에 대한 인체 노출 안전하지 않은 음식, 그리고 가난한 위생 / 위생과 연관되어, 대부분의 어린이 1입니다. 이는 공중 보건 관리 및 정책 결정자에 대한 관심의 주요 원인이다. 수성 및 기타 환경과 관련된 병원체 노출과 질병을 조사하기 위해, 우리는 사람의 샘플 2-4에 대한 항체를 측정하는 다중 면역 분석을 개발 하였다. 이 방법은 이러한 병원체의 인체 노출을 결정하기 위해 더 나은 immunoprevalence 및 사고 감염을 정의하는 역학 연구에 적용 할 수 있습니다.

침은 인간의 바이오 마커 연구를위한 혈청의 대안으로 상당한 약속을 보유하고있다. 타액의 장점 중에서는 비 침입 및 샘플 수집, 저비용의 용이성, 그리고 샘플 아이 쉽게 5-7 <로부터 회수 할 수있다/ SUP>. 혈청 및 타액 샘플 H.에 대한 항체에 대해 광범위하게 연구되어왔다 파이로리 2,3,8, 말라리아 원충 (9), Entamoeba의 아메바 (10),와 포자충 포자충 3,11, 연쇄상 구균 폐렴 (12), 간염 바이러스 A와 C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. 포자충 2-4, 뎅기열 바이러스 16, 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) (17), 대장균 O157 : H7 18.

멀티 플렉스 면역 동시에 하나의 샘플 볼륨 내에서 단일주기 또는 실행 내에서 여러 분석의 분석이 가능합니다. C.에서 멀티 플렉스 항원 jejuni와, T. 포자충, H. 파이로리는 A 형 간염 바이러스와 두 noroviruses은을 사용하여 병원체 인간 IgG의 타액 2-4 IgA와 IgG의 3,4-2,3- 플라즈마 항체 반응을 측정하는 데 사용했다비드 기반 다중 면역. 물, 토양 및 식품 미생물에 노출 역학적 연구와 함께 사용될 때, 본 연구에 기재된 분석의 유형은 환경 병원체에 의한 감염에 대한 이해를 향상시키기 위해 중요한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 이러한 연구에서 수득 타액 항체 데이터는 위험 평가 모델 19-22을 향상 시키는데 사용될 수있다.

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Protocol

승인 (IRB # 08-1844, 노스 캐롤라이나, 채플 힐, 노스 캐롤라이나, 미국의 대학) 케론 비치, 푸에르토 리코,에서 beachgoers에서 자극 열구 타액 샘플의 수집에 대한 미국의 일환으로 임상 시험 심사위원회로부터 얻은 것 환경 보호청 (USEPA) 국립 역학 및 레크리에이션 (NEEAR) 물 연구 (23)의 환경 평가 수영 관련된 노출과 질병을 평가합니다. 연구 주제는 동의를 제공하고 훈련 USEPA 계약에 의해 타액 수집 장치의 사용에 지시했다. 타액 샘플을 수신하면, 그들이 원심 분리 4 바와 같이 -80 ° C에 저장된 얼음에 제공 하였다.

1. 구슬 활성화

  1. 텍싱 20 초 동안 초음파 처리 및 마이크로 원심 튜브에 주식 비드 (400 μL)의 전송 약 5.0 × 10 (6)에 의해 재현 탁 비드 세트 주식.
    참고 : T를그는 12.5 × 106 비즈 / ml의 농도로 공급된다 구슬.
  2. 2 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여 주식 비드 펠렛.
  3. 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 증류수 (DH 2 O)를 뜨는을 제거하고 100 μL의 펠렛 비드를 재현 탁. 단계를 반복 1.2.
  4. 상층 액을 제거하고 20 초 동안 소용돌이와 초음파 100 mM의 인산 나트륨 염기, 산도 6.2의 80 μL에 세척 된 비드를 재현 탁.
  5. 즉시 사용하기 전에, 10 mg의 설포 NHS의 나누어지는 200 μL의 DH 2 O를 추가하여 50 ㎎ / ㎖ N -hydroxysulfosuccinimide (설포 NHS) 솔루션을합니다. 소용돌이로 섞는다.
  6. 구슬에 50 ㎎ / ㎖ 설포 NHS의 10 μl를 추가합니다. 소용돌이로 섞는다.
  7. 사용 직전에, 10 mg을 EDC 분취 200 μL를 증류수 (DH 2 O)을 첨가하여 50 ㎎ / ㎖ -1- 에틸 [3dimethylaminopropyl] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 용액을 만든다. 소용돌이로 섞는다.
  8. 50의 10 μl를 추가구슬로 ㎎ / ㎖ EDC 솔루션입니다. 소용돌이로 섞는다. 10 분 간격으로 와류에 의해 혼합하여, 어두운 곳에서 실온에서 20 분 동안 비드 부화. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 활성화 된 구슬 펠렛.
  9. 상층 액을 제거하고 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 50 mM의 2- [N -Morpholino] 에탄 설 폰산 (MES), 산도 5.0의 250 μL의 비드를 재현 탁.
  10. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 활성화 된 구슬 펠렛.
  11. 반복 1.9 및 1.10 단계를 반복합니다.
    참고 :이 50 MM의 MES, pH가 5.0이 세척의 총을 제공합니다.
  12. 20 초 동안 소용돌이와 초음파 50 MM의 MES, pH 5.0으로 100 ㎕의 구슬을 재현 탁.

2. 구슬 커플 링

  1. 표 1에 도시 된 농도를 사용하여 비드 세트 항원.
  2. 활성화 된 구슬 각 항원을 추가하고 50 MM의 MES, pH 5.0으로 500 μL에 총 볼륨을 가지고. 항원을 혼합소용돌이로 D 구슬.
  3. 어둠 속에서 실온에서 회전 (~ 15 RPM)로 혼합하여 2 시간 동안 항원과 구슬을 품어. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation에 의해 결합 된 구슬 펠렛.
  4. 상층 액을 제거하고 인산염 완충 생리 식염수 500 μL에 구슬을 재현 탁 (PBS) -bovine 혈청 알부민 (BSA) -polyoxyethylenesorbitan 모노 라우 레이트 (트윈 20) 소디움 아 지드 (PBS-TBN) 와류 및 초음파에 의해 pH가 7.4. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 펠렛과 뜨는을 제거합니다.
    주의 : 아 지드 화 나트륨은 급성 독성 화학 물질이다. 섭취 또는 피부에 접촉에 들어갔을 경우는 치명적이다. 먼지 / 연기 / 가스 / 안개 / 증기 나 분무를 흡입하지 말 것. 적절한 개인 보호 장비 (PPE의) 처리 할 때 착용하고 적절한 법률에 따라 폐기.
  5. 20 초 동안 소용돌이 및 초음파에 의해 PBS-TBN 1 ㎖의 구슬을 재현 탁.
  6. 2 분 동안 10,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 펠렛.
  7. 반복 2.5 및 2.6 단계를 반복합니다.
    참고 :이 PBS-TBN 두 세척 총을 제공합니다.
  8. PBS 1 ml의 1 % BSA, 0.05 % 아 지드, pH 7.4의 결합에 세정 비드를 재현 탁. 어둠 속에서 2-8 ° C 형 냉장고에 결합 된 구슬을 저장합니다.

3. 구슬 개수

  1. 물 또는 PBS 버퍼에 결합 된 구슬의 1:10 희석을 준비합니다.
  2. 로드 샘플 도입 지점에서 혈구 상 비드 희석액 10 μL.
  3. 4 × 4 코너 그리드 중 하나에서 볼 구슬을 계산합니다. 카운트 (4 × 4 격자의 모서리 1) × (1 × 104) × (희석 배수) 용액에 재현 탁 X 용적은 다음 식을 이용하여 비드에 결합의 총 수를 계산한다.

항원 커플 링 4. 확인

  1. 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 관심의 항원에 결합 된 구슬의 주식 혼합물을 재현 탁.
  2. 마지막으로 결합 된 비드 주식을 희석하여 작업 비드 혼합물을 제조PBS-1 % BSA 완충액 (PBS-1 % BSA, pH 7.4의)에서 설정 한 각 고유 비드 / 100 ㎕의 농도 비드.
  3. 최소 7 PBS-1 % BSA 버퍼 96 웰 둥근 바닥 플레이트 제조업체의 권장 사항에 따라 IgG의 일차 항체 방지 종의 연속 희석을 두 배 준비합니다.
  4. 세척 완충액 100 ㎕ 각 항원 결합 확인 시험 96 웰 필터 바닥 판의 별도의 8 잘 칼럼 (8 행) 사전 습식 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 사전 젖은 우물에 비드 혼합물 (항원 - 결합 구슬) 작업의 50 μl를 추가합니다.
  5. 배경 우물 역할을 희석 ​​항체 대신에 팔을 행하기 위해 96 웰 필터 플레이트의 각 컬럼의 행 1-7과 PBS-1 % BSA 버퍼의 50 μL에 항체 희석의 50 μl를 추가합니다. 로 pipetting하여 5 회 다운 멀티 채널 피펫으로 혼합한다. 모든 항원 - 결합 된 비드 세트에 대해 동일한 절차를 수행하는 확인한다.
  6. 덮고 실온에서 어둠 속에서 부화 할 수 있도록500 rpm에서 마이크로 통에 1 시간 동안 erature. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다.
  7. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 1 배를 반복합니다. 멀티 채널 피펫에 PBS-1 % BSA 50 μL의 비드를 재현 탁.
  8. PBS-1 % BSA에서 16 μg의 / ㎖ 비 오티 닐화 항에 종에게 특정 IgG를 이차 항체 검출을 희석.
  9. 아래로 5 회를 피펫 팅에 의해 각 웰에 희석 차 항체의 50 μl를 추가합니다.
  10. 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다.
  11. 멀티 채널 피펫에 PBS-1 % BSA 50 μL의 비드를 재현 탁.
  12. PBS-1 % BSA 24 μg의 / ㎖로 스트렙 타비 딘-R-피코 에리 트린 기자 (SAPE)를 희석.
  13. 각 기자의 50 μl를 잘 추가로 pipetting에 의해 5 배 아래로 섞는다.
  14. 기음필터 플레이트 위에 것은 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다.
  15. 재현 탁의 PBS-1 % BSA 100 ㎕ 구슬 및 분석기 (29)를 사용하여 50 μl를 분석합니다.
    참고 : 비드 기반 멀티 플렉스 면역의 결과는 중간 형광 강도 (MFI)로 측정된다. 오류를 방지하기 위해 가능한 경우 항상 소프트웨어 설명서의 최신 버전을 참조하십시오.

5. 타액 멀티 플렉스 면역

  1. -80 ° C 냉장고에서 침을 제거하고 실온에서 해동 할 수 있습니다.
  2. 재현 탁 항원은 20 초 동안 소용돌이와 초음파에 의해 비드 주식을 결합.
  3. PBS-1 % BSA 버퍼 내의 각각의 고유 한 세트의 비드 / 100 μl의 비드의 최종 농도로 결합 된 비드 주식 희석 작업 비드 혼합물을 제조한다.
  4. 타액의 4 희석 w : 1 준비PBS-1 % BSA의 96에서 버퍼 아니라, 깊은 우물 판 번째.
  5. 사전 젖은 필터 세척 버퍼 100 ㎕와 함께 접시 진공에 의해 뜨는을 제거합니다.
  6. 8 최종 희석 작업 비드 혼합물 1의 96 웰 필터 플레이트의 95 우물에 희석 타액의 같은 부피의 50 μl를 추가합니다. 멀티 채널 피펫으로 반응을 섞는다. 물론 하나의 제어에 50 μl의 항원 결합 비즈 플러스 (타액의 대체 등) PBS-1 % BSA 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
  7. 커버 500 rpm에서 마이크로 플레이트 진탕 기에서 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다.
  8. 멀티 채널 피펫 터로 PBS-1 % BSA 50 μL에 재현 탁 구슬.
  9. PBS-1 % BSA에서 16 μg의 / ml의 바이오틴 화 된 염소 항 - 인간 IgG 이차 항체 검출을 희석.
  10. 각 웰에 차 항체를 희석하여 50 μl를 추가로 내용을 혼합멀티 채널 피펫.
  11. 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다.
  12. 멀티 채널 피펫 터로 PBS-1 % BSA 50 μL에 재현 탁 구슬.
  13. PBS-1 % BSA 24 μg의 / ㎖로 스트렙 타비 딘-R-피코 에리 트린 기자 (SAPE)를 희석.
  14. 각 50 μL 기자를 잘 추가하고 멀티 채널 피펫과 함께 섞는다.
  15. 필터 판을 포함하고, 플레이트 쉐이커상에서 실온에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양 할 수 있습니다. 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 완충액 100 ㎕로 우물을 세척하고 진공에 의해 뜨는을 제거합니다. 세척 1 배를 반복합니다.
  16. 재현 탁의 PBS-1 % BSA 100 ㎕ 구슬 및 분석기 (29)를 사용하여 50 μl를 분석합니다.
    참고 : 다중 면역의 결과는 중간 형광 강도 (MFI) 단위로 측정된다. 항상 참조소프트웨어 설명서의 최신 버전은, 가능하면하는 오류를 방지 할 수 있습니다.

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Representative Results

고유 한 비드 세트 다양성을 샘플링 비특이적 결합을 측정하기 위해 제어 및 시료로 하였다. 이러한 비드가 결합 단계에있는 항원과 함께 배양하지 않은 것을 제외하고는 항원 결합 비즈와 동일하게 처리 하였다. 상기 혈청에서 의심 오염으로 인해 분석하고, 나머지 응답은 분산 로그 된 모든 타액 샘플과 함께 배양 제어 비드에서 얻은 MFI 값> (500)는 제거되었다. 잇몸이 수집 장치 나 연구 참가자가 치주 질환이있는 경우 첨부 된 스폰지로 너무 적극적으로 문질러하는 경우 타액은 혈청으로 오염 될 수있다. 로그는 MFI 데이터 평균 플러스 로그 MFI 값의 3 표준 편차에 기초하여 505 MFI의 면역 양성 컷오프 포인트를 계산하기 위해 사용 된 변형. 또한, 항원 - 결합 구슬 DIL 제외한 모든 방식으로 테스트 우물로 처리 된 특정 웰에 첨가 하였다uted 타액은 배경 형광 및 교차 - 반응성을 평가하기 위해 PBS-1 % BSA로 대체 하였다. 이러한 배경 우물에서 얻은 MFI 값은 각각의 타액 샘플에 대한 각각의 항원 결합 비드 세트에서 MFI 값에서 제외되었다.

비드 결합 각 항원에 특이 동물 유래 종 특이 차 검출 항체를 사용하여 확인 하였다. 2 바와 같이 항원 결합 비드 분석의 동적 범위에 접근 할 수 있다고 보장하기 위해, 우리는 MFI ≥18,000, 용량 반응 일차 항체 및 <10 %의 비 표적 간의 교차 반응의 관찰 원료 적절한 결합을 정의 . C. 대표적인 커플 링 확정 jejuni와와 T. 분석에서 항원의 포자충은 그림 1에 나타내었다.

(505 MFI) 설립 컷 - 오프 포인트에 기초하여, immunoprevalence 속도샘플에 대한들 (N = 2078)를 약 2 % (N = 41)에서 T. 위해 원거리 포자충 노로 바이러스의 GI.1 (그림 2)에 대해 약 50 % (N = 1009)이다. 데이터는 immunoprevalence 속도가 noroviruses 대한 높은 간염 바이러스 및 H. 다음되었음을 나타낼 파이로리.

샘플의 32 % (N = 672)가 상기 분석에서 병원균의 모든 immunonegative 동안, 68 %가 (N = 1406)는도 3. 하나 이상의 병원체 면역 양성이었다 하나 또는 그 이상으로의 면역 반응의 분해를 도시 병원균.

그림 1
그림 1 : 커플 링 확인은 멀티 플렉스 면역의 생물이에 대한 분석 커플 링 확인은 항원의 모든 수행과 그래프 C.에 대한했다. jejuni와와 T. 이 그림에서 포자충은 파트 :있다대의 적 다중 면역의 항원에 대한 결합 확인서의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 멀티 플렉스 면역의 특정 병원균에 특정 병원균에 Immunoprevalence Immunoprevalence 약 2 %에서 T. 위해 원거리 포자충 노로 바이러스의 GI.1에 대한 약 50 %이다. 노로 바이러스 항원에 대한 항체가 더 일반적 HAV (A 형 간염 바이러스)와 H. 다음 관찰되었다 파이로리. T. gondii에와 C. jejuni와 항체 분석 타액 샘플에서 자주 나타났다. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

그림 3
그림 3 :. 여러 병원체의 면역 반응의 고장 동시에 멀티 플렉스 면역 동시에 50 μL 샘플 볼륨에 여러 병원체의 면역 반응의 분석이 가능합니다. 거의 분석 타액 샘플의 세 번째는 멀티 플렉스의 항원 모두에 대한 항체에 대한 immunonegative했다. 1/4이 항원에 양성 동안 약 샘플의 31 %는 하나의 항원에 대한 면역 양성이었다. 9.4 %는 세 가지 항원에 대한 면역 양성이었다. 3 %는 동시에 네 개 이상의 항원에 양성이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항원 구슬 세트 커플 링 버퍼 AG 농도 (μg의) 1 모서리에 구슬 # 구슬 # / μL 집. 4 ml의 100 B / UL (μL)에 대한
C. jejuni와 8 MES 5.0 (50) (64) 6,400 (94)
H. 파이로리 (33) MES 5.0 (25) (71) 7,100 (85)
A 형 간염 (42) MES 5.0 (100) (91) 9,100 (66)
T. gondii에 (30) MES 5.0 (25) (85) 8,500 (71)
노로 바이러스 GII.4 (55) MES 5.0 (5) (72) 7,200 (83)
노로 바이러스 GI.1 67 MES 5.0 (5) (63) 6,300 (95)
비 결합 (80) MES 5.0 (60) 6,000 (100)
구슬의 총 용적 (μL) 594
필요한 버퍼의 총 볼륨 (μL) 3,406

표 1. 결합 및 확인이 완료된 후 도시 된 바와 같이 다중 대한 면역 비드 혼합 작업은 각 비드 세트 이루어진 마스터 믹스를 제조 하였다. 마스터 믹스는 분산 된96 웰 플레이트의 우물 게요. 모든 웰은 구슬 및 PBS-1 % BSA 버퍼를 함유 한 배경 제어 웰 제외한 타액과 함께 배양 하였다.

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Discussion

이러한 결과는 멀티 플렉스 면역 방법은 면역 양성 또는 immunonegative 있습니다 타액 샘플을 구별하는 데 유용 있음을 나타냅니다. 의 면역 반응을 결정하기 위해, 하나의 차단 점 평균 플러스 타액 샘플 모두에서 테스트 제어 비결 비드 로그 변환 MFI 응답의 세 개의 표준 편차를 계산하여 개발되었다. 컷 - 오프 포인트는 단일 또는 다수의 병원체에 노출 immunoprevalence을 평가하는 능력을 수득 하였다. 이 차별적 전력은 환경과 다른 병원균에 대한 노출과 관련된 건강 위험을 조사 인구 연구에 유용 할 수있다.

상기 MFI의 분포, 비 결합 제어 어떤 연구가 응답하도록 설계 문제에 따라 컷오프 포인트를 결정하는데 사용될 수있는 몇 가지 다른 방법이있다. 컷 - 오프를 결정하기위한 몇 가지 예는, 유한 혼합 모델링 24-26을 포함 뜻 플러스 3컨트롤에 대한 응답의 표준 편차는 컨트롤에 대한 응답의 2 표준 편차 및 컨트롤 27, 28에 대한 응답의 세 번 평균 더한 의미한다. 단순 검사의 경우, 덜 엄격한 기준이 이용 될 수 있지만, 역학 연구의 경우, 위양성보고 가능성을 줄이기 위해보다 엄격한 정의를 사용하는 것이 더 적합 할 수있다. 우리의 초기 응용 프로그램은 수영과 비 수영 사이 immunoconversion 및 immunoprevalence 보는 것입니다. 이 연구에서, 비 결합 제어 MFI를 정상적으로 분포되지 않은 결과는 로그 변환시켰다.

비드 기반 다중 면역을 수행하는 장점은 시간 및 노동과 시약의 최소량을 요구하면서 동시에 최대 500 분석에 대한 응답을 측정 할 수있는 매우 낮은 샘플 볼륨의 사용 감소를 포함한다. 반면, 노출 및 / 또는 감염을 나타내는 항체 수준을 평가하는 전통적인 방법 (예 : ELISA 시험)은 노동 집약적이고, 완료하기 위해 수 시간이 걸릴 수 있으며, 한 번에 하나의 분석 물을 측정하는데 사용될 수있다. 이러한 전통적인 방법은 환자 / 참가자 샘플의 큰 볼륨을 필요로한다. 다중화 면역 50 μL 이하 필요할 수도 있지만, 예를 들어, 대부분의 ELISA의 시료의 적어도 100 μl를 필요로한다.

다중화 면역의 한계 일차 및 이차 캡처 검출 항체, 항원 및 리포터의 최적 농도를 결정하기 위해 엄격한 최적화의 필요성을 포함한다. 특정 항원에 대한 항체가 다른 유기체에서 항원과 교차 반응하여 위양성 판독의 원인으로 교차 반응은 면역의 주요 관심사입니다. 최적화는 교차 - 반응성 및 비 - 특이 적 결합은 앞서 언급 된 2-4. 이러한 분석의 성공은 특정 antibo뿐만 아니라 높은 면역 원성 항원을 수득 할 수있는 능력에 크게 의존비드 커플 링 및 커플 링 확인 단계에 사용하기 위해 이러한 항원에 죽는다. 또 다른 제한은 분석의 유효성을 검사하는 특징 (진단 학적 양극과 음극) 샘플의 제한된 가용성이다.

프로토콜 내의 중요한 단계가 있습니다. 이들은 다음을 포함한다 : 외국 단백질, 아 지드, 글리신, 트리스 또는 차 아민을 포함하지 않는 비드에 결합되는 항원을 보장한다. 이러한 에이전트 중 항원 제제에 존재하는 경우, 투석 또는 크로마토 그래피에 의해 제거되어야한다. 하나가 500 만 구슬 당 항원의 5 μg의 시작과 최적의 농도를 찾아 적정 것이 좋습니다. 최고의 감도와 동적 범위를 제공하는 최적의 검출 항체 농도를 선택합니다. 신호가 항원 검출 항체 농도 증가 (후크 효과)로 감소하는 경향을 명심. 항원 농도 증가 후 검출 예를 들어, 신호가 감소하면이온 항체는 제한 될 수있다. 반대로, 신호는 리포터 (SAPE)를 검출 항체가 증가함에 따라 감소하는 경우 제한 될 수있다. 각 단백질 (물론 당 설정 한 각 비드 5000)에 대한 최적의 커플 링을 결합하여 상호 반응의 멀티 플렉스를 확인합니다. 최적의 검출 항체의 양을 결합하여 다중화 된 비드 세트를 테스트합니다. 기자를 최적화하고 개별적으로 각각의 항원을 테스트하여 항원의 표준 곡선을합니다.

감도를 개선하기 위해 중앙값 형광 신호를 증가시키기 위해 다중 면역 문제 해결 중요하다. 감도를 개선하기 위해 하나 또는 비드 검출 항체 농도에 결합 된 항원의 양을 감소시킨다. 포획 및 / 또는 검출에 대한 높은 친 화성 항체의 이용은 감도를 향상시킬 수있다. 비드에 결합 된 항원의 양을 증가하면 평균 형광 신호를 증가시킬 수있다. 한 연구 polyvinylal와 혈청 샘플을 미리 배양 시연cohol 플러스 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVX) 버퍼는 우리가 여기에서 설명하는 하나 비드 기반 다중 분석 (30)을 이용하여 혈청 학적 분석에서 결합 비특이적을 억제 할 수있다. 그러나, 우리의 공동 작업자에 의해 또 다른 연구는 PBS-BSA와 PVX 버퍼 사이에 유의 한 영향을 찾을 수 없습니다. 이들은 더 때문에 PVX 버퍼의 높은 점도, 그것은 마이크로 웰 3의 분석기 비드 포착 형성된 발포 문제를 생성한다는 결론을 내렸다.

결론적으로, 우리는 동시에 아주 적은 샘플 량 여러 병원체 인간 타액의 IgG 항체의 존재를 측정 할 수있는 방법을 제시 하였다. 미래에,이 분석은 수영 관련 노출 또는 감염과 관련된 타액 항체의 존재를 검출하고, 위험 평가 모델을 알리는 데 사용된다. 또한, 분석은 공기와 인성 exposur와 관련된 항체를 측정하는데 사용될 수있다에스, 입사 감염이나 immunoconversions을 결정하고 설문 형 인구 연구를 수행 전염병에 중요한 면역 학적 정보를 제공합니다.

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Disclosures

연구 개발의 오피스를 통해 미국 환경 보호국 (EPA)이 자금을 지원하고 여기에 설명 된 연구 관리. 이 기관의 관리 검토를 실시하고 게시 승인되었습니다. 상품명 또는 상용 제품에 대한 언급은 사용 승인 또는 추천을 구성하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

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