एक लार एंटीबॉडी मल्टीप्लेक्स Immunoassay का विकास पर्यावरण रोगजनकों के लिए मानव एक्सपोजर को मापने के लिए

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

एटियलजि और पर्यावरण रोगजनकों के लिए मानव जोखिम के प्रभावों दुनिया भर में प्रमुख चिंता का विषय हैं और इस प्रकार, जोखिम और संक्रमण का उपयोग कर लागत प्रभावी, उच्च throughput दृष्टिकोण का आकलन करने की क्षमता अपरिहार्य होगा। इस पांडुलिपि के विकास और एक मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स एक साथ कई रोगजनकों के लिए मानव लार में एंटीबॉडी की उपस्थिति को मापने में सक्षम प्रतिरक्षा के विश्लेषण का वर्णन है। क्योंकि यह noninvasive, सस्ता और सीरम से इकट्ठा करने के लिए आसान है लार इस आवेदन में विशेष रूप से आकर्षक है। पर्यावरण रोगजनकों से एंटीजन Carboxylated microspheres (मोती) के लिए मिलकर कर रहे थे और एक मनका आधारित, समाधान चरण परख का उपयोग मानव लार के नमूने की बहुत छोटी मात्रा में एंटीबॉडी को मापने के लिए इस्तेमाल किया। मोती कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी, हेलिकोबेक्टर, Toxoplasma gondii, noroviruses (जी I.1 और जी II.4) से एंटीजन और हेपेटाइटिस ए वायरस के साथ मिलकर कर रहे थे। यह सुनिश्चित करें कि एंटीजन पर्याप्त करने के लिए मिलकर कर रहे थेमोती, युग्मन प्रजातियों विशिष्ट, पशु व्युत्पन्न प्राथमिक कब्जा एंटीबॉडी का उपयोग कर पुष्टि की गई थी, biotinylated विरोधी प्रजातियों का पता लगाने माध्यमिक एंटीबॉडी और streptavidin-R-phycoerythrin रिपोर्टर (SAPE) के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया। एक नियंत्रण बाध्यकारी को मापने के लिए गैर विशिष्ट रूप में, एक मनका सेट दूसरों को हूबहू इलाज किया गया था सिवाय इसके कि यह किसी भी प्रतिजन के लिए युग्मित नहीं किया गया था। प्रतिजन मिलकर और नियंत्रण मोती तो भावी एकत्र मानव लार के नमूनों के साथ incubated रहे थे, एक उच्च throughput प्रवाह cytometry के सिद्धांतों पर आधारित विश्लेषक पर मापा जाता है, और प्रत्येक प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों में मापा गया था (एमएफआई) । इस मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा कम नमूने के साथ अधिक डेटा सहित लाभ के एक नंबर है; कम लागत और श्रम; और क्षमता के हित के कई ठिकानों को परख अनुकूलित करने के लिए। परिणाम से संकेत मिलता है कि लार मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा पिछले जोखिम और संक्रमण की पहचान करने में सक्षम हो सकता है, हो सकता है जो especiaनिगरानी बड़ी मानव आबादी को शामिल अध्ययन में lly उपयोगी है।

Introduction

डायरिया से संबंधित बीमारी के अस्सी आठ प्रतिशत दुनिया भर में, दूषित पानी के लिए मानव जोखिम, असुरक्षित भोजन, और गरीब स्वच्छता / स्वच्छता के साथ जुड़ा हुआ है लगभग 1.5 लाख लोगों की मृत्यु का कारण बनता है, जिनमें से अधिकांश बच्चों 1 रहे हैं। यह सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों और नीति निर्माताओं के लिए चिंता का एक प्रमुख कारण है। जोखिम और जलजनित और अन्य पर्यावरणीय रोगजनकों के साथ जुड़े बीमारियों की जांच करने के प्रयास में, हम मानव नमूने 2-4 में एंटीबॉडी को मापने के लिए एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा विकसित की है। इस विधि इन रोगजनकों के लिए मानव जोखिम का निर्धारण करने के लिए और बेहतर immunoprevalence और घटना के संक्रमण को परिभाषित करने के महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।

लार एक वैकल्पिक मानव बायोमार्कर अनुसंधान के लिए सीरम के रूप में काफी संभावनाएं हैं। लार का उपयोग कर के फायदे के अलावा गैर invasiveness और नमूना संग्रह, कम लागत में आसानी रहे हैं, और नमूने आसानी से बच्चों 5-7 <से एकत्र किया जा सकता है/ Sup>। सीरम और लार के नमूने एच के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है पाइलोरी 2,3,8, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम 9, एटामोइबा हिस्टोलिटिका 10, Cryptosporidium parvum 3,11, स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 12, हेपेटाइटिस वायरस ए और सी 13-14, noroviruses 2-4,15, टी gondii 2-4, डेंगू वायरस 16, मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) 17, और कोलाई O157: H7 18।

एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा एक साथ एक ही नमूना मात्रा के भीतर और एक एकल चक्र या चलाने के भीतर कई analytes के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। सी से मल्टिप्लेक्स एंटीजन जेजुनी, टी gondii, एच पाइलोरी, हेपेटाइटिस ए वायरस, और दो ​​noroviruses इनमें से एक का उपयोग कर रोगजनकों के लिए मानव लार आईजीजी 2-4 और आईजी ऐ 3,4 और प्लाज्मा आईजीजी 2,3 प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गयामनका-आधारित बहुसंकेतन प्रतिरक्षा। जब पानी, मिट्टी और भोजन में रोगाणुओं के लिए जोखिम के महामारी विज्ञान के अध्ययन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, परख के प्रकार के इस अध्ययन में वर्णित बहुमूल्य जानकारी पर्यावरण रोगजनकों की वजह से संक्रमण की समझ बढ़ाने के लिए प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, लार एंटीबॉडी इस तरह के अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों जोखिम मूल्यांकन मॉडल 19-22 सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

अनुमोदन संस्थागत समीक्षा बोर्ड से प्राप्त हुई थी (# 08-1844 आईआरबी, उत्तरी कैरोलिना, चैपल हिल, नेकां, संयुक्त राज्य अमरीका के विश्वविद्यालय) संयुक्त राज्य अमेरिका के एक भाग के रूप Boquerón समुद्र तट, प्यूर्टो रिको, पर beachgoers से प्रेरित crevicular लार के नमूनों के संग्रह के लिए पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (USEPA) राष्ट्रीय महामारी विज्ञान और मनोरंजक (NEEAR) जल अध्ययन 23 के पर्यावरण आकलन तैराकी जुड़े जोखिम और बीमारियों का आकलन करने के लिए। अध्ययन विषयों सूचित सहमति प्रदान की है और प्रशिक्षित USEPA ठेकेदारों द्वारा लार संग्रह डिवाइस के प्रयोग पर निर्देश दिए थे। लार के नमूने बर्फ पर भेज दिया गया है और प्राप्त होने पर, वे centrifuged और वर्णित के रूप में 4 -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया।

1. मनका एक्टिवेशन

  1. Vortexing और 20 सेकंड के लिए sonicating और हस्तांतरण लगभग 5.0 x 10 6 microcentrifuge ट्यूबों के लिए शेयर मोती (400 μl) के द्वारा Resuspend मनका सेट शेयरों।
    नोट: टीवह मोती 12.5 x 10 6 मोती / एमएल की एकाग्रता में आपूर्ति की जाती है।
  2. 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर centrifuging द्वारा शेयर मोती गोली।
  3. 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा तैरनेवाला निकालें और आसुत जल (DH 2 हे) 100 μl में pelleted मोती resuspend। दोहराएँ कदम 1.2।
  4. तैरनेवाला निकालें और 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा 100 मिमी सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार, पीएच 6.2 से 80 μl में धोया मोती resuspend।
  5. तुरंत उपयोग करने से पहले, 10 मिलीग्राम Sulfo एनएचएस विभाज्य 200 μl DH 2 हे जोड़कर एक 50 मिलीग्राम / एमएल एन -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo एनएचएस) समाधान करें। भंवर से मिलाएं।
  6. मोती के लिए 50 मिलीग्राम / एमएल Sulfo एनएचएस के 10 μl जोड़ें। भंवर से मिलाएं।
  7. तुरंत उपयोग करने से पहले, 10 मिलीग्राम ईडीसी विभाज्य 200 μl आसुत जल (DH 2 हे) जोड़कर एक 50 मिलीग्राम / एमएल 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) समाधान करें। भंवर से मिलाएं।
  8. 50 के 10 μl जोड़ेमोती के लिए मिलीग्राम / एमएल ईडीसी समाधान। भंवर से मिलाएं। 10 मिनट के अंतराल पर भंवर से मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मोती सेते हैं, अंधेरे में। 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifugation से सक्रिय मोती गोली।
  9. तैरनेवाला निकालें और 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा 50 मिमी 2- [एन -Morpholino] ethanesulfonic एसिड (एमईएस), पीएच 5.0 के 250 μl में मोती resuspend।
  10. 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifugation से सक्रिय मोती गोली।
  11. दोहराएँ 1.9 और 1.10 कदम।
    नोट: यह 50 मिमी एमईएस, पीएच 5.0 के साथ दो washes के एक कुल प्रदान करता है।
  12. 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा 50 मिमी एमईएस, पीएच 5.0 के 100 μl में मोती resuspend।

2. मनका युग्मन

  1. युगल सांद्रता तालिका 1 में दिखाया गया है का उपयोग कर मनका सेट करने के लिए एंटीजन।
  2. सक्रिय मोती करने के लिए प्रत्येक प्रतिजन जोड़े और 50 मिमी एमईएस, पीएच 5.0 में 500 μl के लिए कुल मात्रा लाने के लिए। एंटीजन मिक्स एकभंवर द्वारा डी मोती।
  3. अंधेरे में कमरे के तापमान पर रोटेशन (~ 15 rpm) द्वारा मिश्रण के साथ एंटीजन और 2 घंटे के लिए मोती सेते हैं। 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifugation से मिलकर मोती गोली।
  4. तैरनेवाला निकालें और फॉस्फेट खारा बफर के 500 μl में मोती resuspend (पीबीएस) -bovine सीरम albumin (बीएसए) -polyoxyethylenesorbitan monolaurate (बीच -20) -sodium azide (पीबीएस TBN) भंवर और sonication से 7.4 पीएच। 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifugation द्वारा मोती गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    सावधानी: सोडियम azide एक तीव्रता से जहरीले रसायन है। यह घातक अगर निगल या त्वचा के साथ संपर्क में हो जाता है। धूल / धूआं / गैस / धुंध / वाष्प या स्प्रे साँस नहीं है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) की जब से निपटने पहनें और उचित कानूनों के अनुसार के निपटान के।
  5. 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा पीबीएस TBN के 1 मिलीलीटर में मोती resuspend।
  6. 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर microcentrifugation द्वारा मोती गोली।
  7. दोहराएँ 2.5 और 2.6 कदम।
    नोट: यह पीबीएस देख के साथ दो washes के एक कुल प्रदान करता है।
  8. पीबीएस के 1 मिलीलीटर, 1% बीएसए, 0.05% Azide, 7.4 पीएच में मिलकर और धोया मोती resuspend। अंधेरे में एक 2-8 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में मिलकर मोती स्टोर।

3. मनका गणना

  1. पानी या पीबीएस बफर में मिलकर मोतियों की एक 1:10 कमजोर पड़ने को तैयार है।
  2. लोड नमूना परिचय बिंदु पर एक hemocytometer पर मनका कमजोर पड़ने के 10 μl।
  3. मोती 4 x 4 कोने ग्रिड में से एक के रूप में देखा गणना। गणना (4 x 4 ग्रिड के 1 कोने) एक्स (1 एक्स 10 4) एक्स (कमजोर पड़ने कारक) मिलीलीटर में एक्स मेजबान मात्रा: निम्न सूत्र का उपयोग मिलकर मोती की कुल संख्या की गणना।

4. एंटीजन युग्मन की पुष्टि

  1. 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा ब्याज की एंटीजन को मिलकर मोती का जायजा मिश्रण Resuspend।
  2. एक अंतिम करने के लिए मिलकर मनका शेयरों गिराए द्वारा एक काम मनका मिश्रण तैयार करें100 मोती प्रत्येक अद्वितीय पीबीएस 1% BSA बफर (पीबीएस 1% बीएसए, 7.4 पीएच) में स्थापित मनका के / μl की एकाग्रता।
  3. कम से कम 7 आईजीजी प्राथमिक एंटीबॉडी दो गुना विरोधी प्रजातियों के धारावाहिक dilutions पीबीएस 1% BSA बफर के साथ 96 अच्छी तरह गोल नीचे की थाली में निर्माता की सिफारिशों के अनुसार तैयार करें।
  4. धोने बफर के 100 μl के साथ प्रत्येक प्रतिजन युग्मन पुष्टि परीक्षण के लिए एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर नीचे की थाली का एक अलग 8 अच्छी तरह से कॉलम (8 पंक्तियों) पूर्व गीला और वैक्यूम से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पूर्व गीला कुओं के लिए मनका मिश्रण (प्रतिजन मिलकर मोती) काम के 50 μl जोड़ें।
  5. पतला एंटीबॉडी के एवज में 8 पंक्ति के लिए पृष्ठभूमि कुओं के रूप में सेवा करने के लिए 96 अच्छी तरह से फिल्टर थाली के प्रत्येक स्तंभ की पंक्तियों 1-7 और पीबीएस 1% BSA बफर के 50 μl के लिए एंटीबॉडी dilutions के 50 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और 5 बार नीचे एक मल्टी चैनल pipettor के साथ मिक्स। हर प्रतिजन मिलकर मनका सेट के लिए एक ही प्रक्रिया का प्रदर्शन पुष्टि की।
  6. कवर और कमरे में अस्थायी पर अंधेरे में सेते दें500 rpm पर एक microplate प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए erature। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  7. धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 1x दोहराएँ। एक मल्टी चैनल pipettor के साथ पीबीएस 1% बीएसए के 50 μl में मोती resuspend।
  8. 16 माइक्रोग्राम / पीबीएस 1% BSA में मिलीलीटर पतला biotinylated विरोधी प्रजातियों विशिष्ट आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने।
  9. नीचे 5 बार ऊपर pipetting और एक अच्छी तरह से पतला एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें।
  10. फिल्टर प्लेट कवर और एक थाली प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते दें। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। धोने 1x दोहराएँ।
  11. एक मल्टी चैनल pipettor के साथ पीबीएस 1% बीएसए के 50 μl में मोती resuspend।
  12. 24 माइक्रोग्राम / पीबीएस 1% BSA में मिलीलीटर streptavidin-R-phycoerythrin रिपोर्टर (SAPE) पतला।
  13. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए रिपोर्टर के 50 μl जोड़ें और ऊपर pipetting द्वारा और 5 बार नीचे मिश्रण।
  14. सीफिल्टर प्लेट पर और एक थाली प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते दें। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। धोने 1x दोहराएँ।
  15. पीबीएस 1% बीएसए के 100 μl में Resuspend मोती और विश्लेषक 29 का उपयोग कर 50 μl का विश्लेषण।
    नोट: मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा का परिणाम माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) में मापा जाता है। यदि उपलब्ध हो त्रुटियों से बचने के लिए हमेशा की तरह, सॉफ्टवेयर मैनुअल के नवीनतम संस्करण को देखें।

5. लार मल्टीप्लेक्स Immunoassay

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से लार निकालें और कमरे के तापमान पर पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. Resuspend प्रतिजन 20 सेकंड के लिए भंवर और sonication द्वारा मनका शेयरों मिलकर।
  3. पीबीएस 1% BSA बफर में 100 मोती प्रत्येक अद्वितीय मनका सेट के / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए युग्मित मनका शेयरों गिराए द्वारा एक काम मनका मिश्रण तैयार करें।
  4. लार के 4 कमजोर पड़ने डब्ल्यू: एक 1 तैयारएक 96 में पीबीएस 1% BSA बफर खैर, गहरी अच्छी तरह से थाली ith।
  5. धोने बफर के 100 μl के साथ पूर्व गीला फिल्टर प्लेट और वैक्यूम से सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. 8 अंतिम कमजोर पड़ने: एक काम मनका मिश्रण और एक 1 के लिए 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटों के 95 कुओं को पतला लार की एक समान मात्रा के 50 μl जोड़ें। एक मल्टी चैनल pipettor के साथ प्रतिक्रियाओं मिक्स। एक नियंत्रण में अच्छी तरह से करने के लिए, 50 μl प्रतिजन मिलकर मोती प्लस पीबीएस 1% BSA बफर के 50 μl (लार के लिए एक स्थानापन्न के रूप में) जोड़ें।
  7. कवर और अंधेरे में 500 rpm पर एक microplate प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते दें। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। धोने 1x दोहराएँ।
  8. एक मल्टी चैनल pipettor के साथ पीबीएस 1% बीएसए के 50 μl में Resuspend मोती।
  9. 16 माइक्रोग्राम / पीबीएस 1% BSA में मिलीलीटर biotinylated बकरी विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने पतला।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 50 μl जोड़ें और साथ सामग्री मिश्रणएक मल्टी चैनल pipettor।
  11. फिल्टर प्लेट कवर और एक थाली प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते दें। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। धोने 1x दोहराएँ।
  12. एक मल्टी चैनल pipettor के साथ पीबीएस 1% बीएसए के 50 μl में Resuspend मोती।
  13. 24 माइक्रोग्राम / पीबीएस 1% BSA में मिलीलीटर streptavidin-R-phycoerythrin रिपोर्टर (SAPE) पतला।
  14. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 50 μl संवाददाता जोड़ें और एक pipettor मल्टी चैनल के साथ मिश्रण।
  15. फिल्टर प्लेट कवर और एक थाली प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते दें। वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें। धोने बफर के 100 μl के साथ कुओं धो और वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें। धोने 1x दोहराएँ।
  16. पीबीएस 1% बीएसए के 100 μl में Resuspend मोती और विश्लेषक 29 का उपयोग कर 50 μl का विश्लेषण।
    नोट: मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा का परिणाम माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) इकाइयों में मापा जाता है। हमेशा के लिए देखेंसॉफ्टवेयर मैनुअल के नवीनतम संस्करण, यदि उपलब्ध हो त्रुटियों से बचने के लिए।

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Representative Results

एक अद्वितीय मनका सेट परिवर्तनशीलता नमूने के लिए एक नियंत्रण गैर विशिष्ट बंधन को मापने के लिए और नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ये मोती अपवाद के साथ मिलकर मोती प्रतिजन है कि वे युग्मन कदम में किसी भी प्रतिजन के साथ incubated नहीं थे हूबहू इलाज किया गया। आगे सीरम से संदिग्ध संदूषण की वजह से विश्लेषण करती है और शेष प्रतिक्रियाओं वितरित लॉग रहे थे से एमएफआई मूल्यों> 500 सब लार के नमूनों के साथ incubated नियंत्रण मोतियों से प्राप्त हटा दिया गया। लार सीरम के साथ दूषित किया जा सकता है, तो मसूड़ों स्पंज संग्रह डिवाइस के लिए या यदि अध्ययन भागीदार periodontal रोग है संलग्न के साथ भी सख्ती मला जाता है। लॉग तब्दील एमएफआई डेटा मतलब प्लस लॉग एमएफआई मूल्यों के 3 मानक विचलन के आधार पर 505 एमएफआई के एक immunopositive कट ऑफ बिंदु की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इसके अतिरिक्त, प्रतिजन मिलकर मोती विशिष्ट कुओं कि दिल को छोड़कर हर तरीके से परीक्षण कुओं के रूप में इलाज किया गया करने के लिए जोड़ा गया थाuted लार पीबीएस 1% BSA के साथ बदल दिया गया था पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और पार जेट का मूल्यांकन करने के लिए। इन पृष्ठभूमि कुओं में प्राप्त एमएफआई मूल्यों प्रत्येक लार के नमूने के लिए प्रत्येक प्रतिजन मिलकर मनका सेट से एमएफआई मूल्यों से घटाया गया था।

मनका युग्मन पशु निकाली गई प्रजाति विशेष के प्राथमिक पता लगाने के एंटीबॉडी प्रत्येक प्रतिजन के लिए विशिष्ट का उपयोग कर पुष्टि की गई। यह सुनिश्चित करें कि प्रतिजन मिलकर मोती परख के गतिशील रेंज के करीब पहुंच करने में सक्षम थे, हम के रूप में वर्णित 2 एक एमएफआई ≥18,000, खुराक प्रतिक्रिया और प्राथमिक एंटीबॉडी और <10% की गैर लक्ष्यों के बीच पार जेट के अवलोकन के रूप में उचित युग्मन परिभाषित । सी के लिए प्रतिनिधि युग्मन की पुष्टि जेजुनी और टी परख में एंटीजन की gondii चित्र 1 में दिखाया गया है।

कट ऑफ बिंदु की स्थापना (505 एमएफआई) के आधार पर, immunoprevalence दरनमूने के लिए एस (एन = 2,078) टी के लिए के बारे में 2% (एन = 41) से लेकर gondii नोरोवायरस GI.1 (चित्रा 2) के लिए लगभग 50% (एन = 1,009) करने के लिए। आंकड़ों से संकेत मिलता था कि immunoprevalence दर noroviruses के लिए उच्चतम द्वारा हेपेटाइटिस ए वायरस और एच पीछा किया पाइलोरी।

जबकि नमूनों की 32% (एन = 672) परख में रोगाणुओं की सभी के लिए immunonegative थे, 68% (एन = 1,406) एक या एक से अधिक रोगजनकों के लिए immunopositive थे। चित्रा 3 में से एक या अधिक करने के लिए immunopositivity के टूटने से पता चलता है रोगजनकों।

आकृति 1
चित्रा 1: युग्मन पुष्टि मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा में जीवों के दो लोगों के लिए विश्लेषण करती है युग्मन पुष्टि एंटीजन के सभी के लिए प्रदर्शन किया गया था और सी के लिए रेखांकन। जेजुनी और टी इस आंकड़े में gondii प्रतिनिधि कर रहे हैंमल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा में एंटीजन के लिए युग्मन की पुष्टि की सरीखे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विशिष्ट रोगजनकों के लिए Immunoprevalence मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा में विशिष्ट रोगजनकों के लिए Immunoprevalence टी के लिए के बारे में 2% से लेकर gondii नोरोवायरस GI.1 के लिए लगभग 50% करने के लिए। नोरोवायरस एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी अधिक सामान्यतः हवलदार (हेपेटाइटिस ए वायरस) और एच के द्वारा पीछा मनाया गया पाइलोरी। टी gondii और सी जेजुनी एंटीबॉडी का विश्लेषण किया लार के नमूनों में कम बार दिखाई दिया। वें में से एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। कई रोगजनकों के लिए immunopositivity के टूटने के साथ-साथ मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा एक साथ एक 50 μl नमूना मात्रा में कई रोगजनकों के लिए immunopositivity के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। लगभग यत्न लार के नमूने की एक तिहाई मल्टीप्लेक्स में एंटीजन के सभी के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए immunonegative था। लगभग नमूने के 31%, जबकि एक चौथाई दो एंटीजन को सकारात्मक था एक प्रतिजन के लिए immunopositive था। 9.4% तीन एंटीजन को immunopositive था। 3% एक साथ चार या उससे अधिक एंटीजन को सकारात्मक था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीजन मनका सेट युग्मन बफर एजी एकाग्रता (माइक्रोग्राम) 1 कोने में मोतियों की # मोतियों की # / μl वॉल्यूम। 100 बी / 4 मिलीलीटर के लिए उल (μl) के लिए
सी जेजुनी 8 एमईएस 5.0 50 64 6400 94
एच पाइलोरी 33 एमईएस 5.0 25 71 7,100 85
हेपेटाइटिस ए 42 एमईएस 5.0 100 91 9100 66
टी gondii 30 एमईएस 5.0 25 85 8500 71
नोरोवायरस GII.4 55 एमईएस 5.0 5 72 7200 83
नोरोवायरस GI.1 67 एमईएस 5.0 5 63 6,300 95
uncoupled 80 एमईएस 5.0 60 6000 100
मोतियों की कुल मात्रा (μl) 594
बफर की कुल मात्रा की जरूरत है (μl) 3406

तालिका 1:। मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा के लिए कार्य करना मनका मिश्रण युग्मन और पुष्टि के पूरा कर रहे थे के बाद, प्रत्येक मनका सेट से मिलकर एक मास्टर मिश्रण के रूप में दिखाया तैयार किया गया था। मास्टर मिश्रण एक के बीच वितरित किया गया96 अच्छी तरह से थाली में कुओं की डालूँगा। कुओं की सभी जो केवल माला और पीबीएस 1% BSA बफर निहित एक पृष्ठभूमि नियंत्रण में अच्छी तरह के अपवाद के साथ लार के साथ incubated रहे थे।

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Discussion

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा विधि लार के नमूने है कि immunopositive या immunonegative के बीच भेदभाव करने के लिए उपयोगी है। immunopositivity का निर्धारण करने के लिए, एक भी कट ऑफ बिंदु मतलब प्लस नियंत्रण uncoupled लार के नमूने के सभी के साथ परीक्षण किया मोतियों की लॉग तब्दील एमएफआई प्रतिक्रियाओं के तीन मानक विचलन की गणना के द्वारा विकसित किया गया था। कट ऑफ बिंदु या तो एक या एकाधिक रोगजनकों के लिए जोखिम और immunoprevalence आकलन करने की क्षमता afforded। इस विशेषक शक्ति जनसंख्या अध्ययन में उपयोगी स्वास्थ्य पर्यावरण और अन्य रोगाणुओं के लिए जोखिम के साथ जुड़े जोखिम की जांच करने के लिए हो सकता है।

वहाँ कई अन्य तरीकों कि एमएफआई का वितरण, uncoupled नियंत्रण और क्या सवाल अध्ययन जवाब देने के लिए बनाया गया है के आधार पर एक कट ऑफ बिंदु निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कट-ऑफ निर्धारण करने के लिए कुछ उदाहरण परिमित मिश्रित मॉडलिंग 24-26 शामिल मतलब प्लस 3नियंत्रण करने के लिए प्रतिक्रियाओं का मानक विचलन, नियंत्रण करने के लिए प्रतिक्रियाओं के 2 मानक विचलन, और तीन बार नियंत्रण 27,28 के लिए प्रतिक्रियाओं का मतलब प्लस मतलब है। साधारण प्रदर्शन के लिए, कम कड़े मापदंड इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए, यह एक और अधिक कठोर परिभाषा को रोजगार के लिए झूठी सकारात्मक रिपोर्टिंग की संभावना को कम करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। हमारे प्रारंभिक आवेदन immunoconversion और तैराकों और गैर तैराकों के बीच immunoprevalence पर लग रहा है। इस अध्ययन में, uncoupled नियंत्रण एमएफआई सामान्य रूप से वितरित नहीं कर रहे थे और परिणाम लॉग तब्दील हो गया।

एक मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा प्रदर्शन को लाभ समय और श्रम की और साथ ही साथ अप करने के लिए 500 analytes के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए है जबकि अभिकर्मकों की एक न्यूनतम राशि की आवश्यकता होती है की क्षमता में बहुत कम नमूना संस्करणों का उपयोग करते हैं, में कमी शामिल हैं। इसके विपरीत, जोखिम और / या संक्रमण का संकेत एंटीबॉडी के स्तर का आकलन करने के पारंपरिक तरीकों (जैसे

एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा की सीमाएं कठोर अनुकूलन के लिए जरूरत के प्राथमिक और माध्यमिक कब्जा पता लगाने के एंटीबॉडी, एंटीजन और रिपोर्टर का इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने में शामिल हैं। पार जेट भी immunoassays में एक प्रमुख चिंता का विषय के रूप में एक विशेष प्रतिजन के खिलाफ एंटीबॉडी सकता अन्य जीवों से एंटीजन के साथ पार प्रतिक्रिया और इस तरह की झूठी सकारात्मक रीडिंग के लिए नेतृत्व है। अनुकूलन, पार जेट और गैर विशिष्ट बंधन में पहले 2-4 संबोधित कर रहे थे। ऐसे किसी भी परख की सफलता के विशिष्ट antibo के साथ ही बड़े पैमाने पर अत्यधिक immunogenic एंटीजन प्राप्त करने की क्षमता पर निर्भर करता हैमनका युग्मन और युग्मन पुष्टि चरणों में इस्तेमाल के लिए इन एंटीजन को मर जाता है। एक और सीमा की विशेषता (diagnostically सकारात्मक और नकारात्मक) नमूने की सीमित उपलब्धता assays मान्य करने के लिए है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर रहे हैं। इनमें शामिल हैं: एंटीजन कि मोती को युग्मित किया जाएगा विदेशी प्रोटीन, azide, ग्लाइसिन, Tris या किसी प्राथमिक amines शामिल नहीं है सुनिश्चित करने। इन एजेंटों के किसी भी प्रतिजन तैयारी में मौजूद हैं, वे डायलिसिस या क्रोमैटोग्राफी द्वारा हटाया जाना चाहिए। यह सिफारिश की है कि एक 5 लाख मोतियों के प्रति प्रतिजन के 5 ग्राम के साथ शुरू और इष्टतम एकाग्रता लगाने के लिए titrate चाहिए। इष्टतम पता लगाने के एंटीबॉडी एकाग्रता सबसे अच्छा है कि संवेदनशीलता और गतिशील रेंज देता चुनें। ध्यान रखें कि संकेतों प्रतिजन और पता लगाने के एंटीबॉडी सांद्रता वृद्धि (हुक प्रभाव) के रूप में कम करने के लिए करते हैं में रखिए। उदाहरण के लिए, संकेत कम हो जाती है, तो के रूप में प्रतिजन एकाग्रता बढ़ जाती है तो पता लगाआयन एंटीबॉडी को सीमित किया जा सकता है। इसके विपरीत, यदि संकेत तो रिपोर्टर (SAPE) का पता लगाने एंटीबॉडी वृद्धि के रूप में कमी सीमित हो सकता है। प्रत्येक प्रोटीन (प्रत्येक मनका प्रति अच्छी तरह से सेट के 5000) के लिए इष्टतम युग्मन के संयोजन से पार जेट के लिए मल्टीप्लेक्स की जाँच करें। इष्टतम पता लगाने के एंटीबॉडी राशि के साथ संयोजन के द्वारा परीक्षण मल्टिप्लेक्स मनका सेट। संवाददाता अनुकूलन और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रतिजन परीक्षण द्वारा प्रतिजन का एक मानक वक्र बनाते हैं।

एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा समस्या निवारण संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए और मंझला फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ाने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए, मोती या पता लगाने के एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए मिलकर प्रतिजन की मात्रा को कम हैं या तो। कब्जा है और / या पता लगाने के लिए एक उच्च आत्मीयता के एंटीबॉडी का उपयोग भी संवेदनशीलता सुधार हो सकता है। मोती के लिए युग्मित प्रतिजन की राशि बढ़ाने से मंझला फ्लोरोसेंट संकेत वृद्धि हो सकती है। एक अध्ययन में प्रदर्शन किया है कि पूर्व incubating polyvinylal साथ सीरम नमूनोंअल्कोहल प्लस polyvinylpyrrolidone (PVX) बफर ऐसा ही एक है कि हम यहाँ वर्णन कर रहे हैं के रूप में गैर विशिष्ट मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स परख 30 का उपयोग सीरम वैज्ञानिक assays में बाध्यकारी को दबाने के लिए सक्षम है। हालांकि, हमारे सहयोगियों द्वारा एक अन्य अध्ययन पीबीएस बीएसए और PVX buffers के बीच कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पाया। उन्होंने आगे कहा कि PVX बफर के उच्च चिपचिपाहट के कारण, यह microplate कुओं 3 में विश्लेषक में मनका अधिग्रहण और गठन फोम के साथ समस्या पैदा कर संपन्न हुआ।

अंत में, हम एक तरीका है कि एक साथ एक बहुत छोटा सा नमूना मात्रा में कई रोगजनकों के लिए मानव लार आईजीजी एंटीबॉडी की उपस्थिति मापने में सक्षम है प्रस्तुत किया है। भविष्य में, इस परख लार तैरना संबंधित जोखिम या संक्रमण के साथ जुड़े एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए और मदद करने के लिए जोखिम मूल्यांकन मॉडल को सूचित किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, परख हवाई और खाद्य जनित exposur के साथ जुड़े एंटीबॉडी को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताes, घटना के संक्रमण या immunoconversions का निर्धारण और प्रश्नावली प्रकार जनसंख्या अध्ययन का आयोजन epidemiologists के लिए महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा जानकारी प्रदान करते हैं।

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Disclosures

अनुसंधान और विकास के अपने कार्यालय के माध्यम से संयुक्त राज्य अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और वित्त पोषित अनुसंधान यहाँ वर्णित कामयाब रहे। यह एजेंसी प्रशासनिक समीक्षा के अधीन है और प्रकाशन के लिए अनुमोदित किया गया है। व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख उपयोग के लिए बेचान या सिफारिश का गठन नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364, (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38, (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62, (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182, (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173, (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26, (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5, (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6, (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52, (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1, (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50, (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198, (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26, (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134, (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74, (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309, (1-2), 200-204 (2006).

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