פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

האטיולוגיה ואת ההשפעות של חשיפה אנושית פתוגנים סביבתיים הם של דאגה גדולה ברחבי העולם, ובכך, את היכולת להעריך באמצעות חשיפה וזיהומים חסכוניות, גישות תפוקה גבוהה תהיה הכרחית. כתב יד זה מתאר את ההתפתחות וניתוח של immunoassay זמנית מבוסס חרוז ליכולת למדוד את הנוכחות של נוגדנים ברוק אדם פתוגנים רב בו זמנית. רוק הוא אטרקטיבי במיוחד ביישום זה בגלל זה אינו פולשני, זול יותר וקל יותר לאסוף מ בסרום. אנטיגנים של פתוגנים סביבתיים היו מצמידים את microspheres carboxylated (חרוזים) ומשמשים למדידת נוגדנים בנפחים קטנים מאוד של דגימות רוק אנושיים באמצעות assay מבוסס חרוז, פתרון פאזיים. חרוזים היו מצמידים עם אנטיגנים מ קמפילובקטר jejuni, הליקובקטר פילורי, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 ו- G II.4) ודלקת כבד נגיפית A וירוס. כדי להבטיח כי אנטיגנים היו מצמידים מספיק כדיהחרוזים, צימוד אושרו באמצעות נוגדני מינים ספציפיים, לכידה עיקרית-מחי, ואחריו דגירה עם נוגדני איתור משני אנטי-מיני biotinylated כתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE). כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב, סט חרוז אחד טופל באופן זהה לאחרים אלא שזה לא היה מצמיד את כל אנטיגן. האנטיגן מצמיד ובקרת חרוזי הודגרו אז עם דגימות רוק אנושיות-שנאספו פרוספקטיבית, נמדדו על נתח תפוקה גבוהה על בסיס העקרונות של cytometry זרימה, ואת הנוכחות של נוגדנים לכל אנטיגן נמדדה ביחידות עוצמות קרינה החציונית (MFI) . יש immunoassay זמנית זו מספר יתרונות, כולל נתונים נוספים עם מדגם פחות; עלויות עבודה מופחתות; ואת היכולת להתאים את assay מטרות רבות של עניין. תוצאות מחקר מראים כי immunoassay זמנית הרוק עשויה להיות מסוגל לזהות חשיפות וזיהומים קודמים, אשר יכול להיות especially שימושי במחקרי מעקב המעורבים אוכלוסיות אנושיות גדולות.

Introduction

שימונים ושמונה אחוזים של מחלה הקשורים שלשולים ברחבי העולם קשור לחשיפת אדם למים מזוהמים, מזון בטוח, והיגיינה / תברואה הירודה, גרימה כ -1.5 מיליון מקרי מוות, רובם הם ילדים 1. זהו גורם עיקרי לדאגה עבור אנשי בריאות ציבור וקובעי מדיניות. במאמץ לחקור חשיפות ומחלות הקשורות waterborne ופתוגנים סביבתיים אחרים, פיתחנו immunoassay זמנית למדוד נוגדנים בדגימות אדם 2-4. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אפידמיולוגיים לקבוע חשיפה אנושית פתוגנים אלה עדיף להגדיר זיהומי immunoprevalence ואירוע.

רוק טומן בחובו הבטחה ניכרה כחלופת סרום המחקר ביו-מרקר אדם. בין היתרונות של שימוש רוק הם-הפולשנות הלא וקלות אוסף מדגם, בעלות נמוכה, ודוגמאות ניתן לאסוף בקלות מילדים 5-7 </ Sup>. סרום דגימות רוק נחקרו רבות עבור נוגדנים כנגד H. פילורי 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס 12, וירוסים הפטיטיס A ו- C 13-14, noroviruses 2-4,15, ט גונדי 2-4, דנגה וירוס 16, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 17, ו Escherichia coli O157: H7 18.

Immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של analytes מרובים בו זמנית בתוך נפח דגימה אחת ותוך מחזור אחד או לרוץ. אנטיגנים Multiplexed מ ג jejuni, ט גונדי, H. pylori, הפטיטיס וירוס, ושני noroviruses שמש למדידת אדם רוק IgG 2-4 ו IgA 3,4 ופלזמת תגובות 2,3 נוגדן IgG לפתוגנים אלה באמצעותחרוז מבוסס ריבוב immunoassay. הפועל בשיתוף עם מחקרים אפידמיולוגיים של חשיפה לחיידקים במים, אדמה ומזון, הסוג של assay המתואר במחקר זה עשוי לספק מידע רב ערך על מנת לשפר את ההבנה של זיהומים הנגרמים על ידי פתוגנים סביבתיים. יתר על כן, נתוני נוגדן רוק שהתקבלו ממחקרים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר את המודלים להערכת סיכוני 19-22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התקבל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדיים (IRB # 08-1844, אוניברסיטת צפון קרוליינה, צ'אפל היל, צפון קרוליינה, ארה"ב) לאיסוף דגימות רוק crevicular מגורה מ beachgoers בחוף Boqueron, פורטו ריקו, כחלק ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה (USEPA) הלאומי אפידמיולוגיים הערכה סביבתית של פנאי (NEEAR) מים לימוד 23 להעריך הקשורים שחייה חשיפות ומחלות. משתתפי המחקר סיפקו הסכמה מדעת הונחו על השימוש בהתקן אוסף הרוק ידי קבלנים USEPA מאומן. דגימות הרוק נשלחו על קרח, עם קבלה, הם היו centrifuged ומאוחסנים ב -80 ° C כמתואר 4.

1. הפעלת חרוז

  1. מניות סט חרוז גלולה ידי vortexing ו sonicating במשך 20 שניות ולהעביר כ 5.0 x 10 6 של חרוזים המניות (400 μl) צינורות microcentrifuge.
    הערה: Tהוא החרוזים מסופקים בריכוז של 12.5 x 10 6 חרוזים / ml.
  2. גלולת חרוזי המניות על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  3. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים pelleted ב 100 μl מים מזוקקים (DH 2 O) על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות. חזור על שלב 1.2.
  4. הסר את supernatant ו resuspend חרוזים שטף ב -80 μl של 100 monobasic נתרן פוספט מ"מ, pH 6.2 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  5. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) הפתרון על ידי הוספת 200 μl DH 2 O ל aliquot 10 מ"ג sulfo-NHS. מערבבים על ידי מערבולת.
  6. הוסף 10 μl של 50 מ"ג / מ"ל ​​sulfo-NHS על חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת.
  7. מיד לפני השימוש, להכין 50 מ"ג / מ"ל 1-ethyl- [3dimethylaminopropyl] hydrochloride carbodiimide (EDC) הפתרון על ידי הוספת 200 μl מים מזוקקים (DH 2 O) אל aliquot 10 מ"ג EDC. מערבבים על ידי מערבולת.
  8. הוסף 10 μl של 50מ"ג / מ"ל ​​פתרון EDC אל חרוזים. מערבבים על ידי מערבולת. דגירה חרוזים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך, עם ערבוב ידי מערבולת ב 10 מרווחי דקות. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  9. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 250 μl של 50 מ"מ 2 [N -Morpholino] חומצה ethanesulfonic (MES), pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  10. גלולת החרוזים מופעלים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  11. חזור על שלבים 1.9 ו 1.10.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם 50 מ"מ MES, pH 5.0.
  12. Resuspend את החרוזים 100 μl של 50 MES מ"מ, pH 5.0 ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.

2. חרוז זיווגים

  1. זוג אנטיגנים על הסטים החרוזים באמצעות הריכוזים שניתן לראות בטבלת 1.
  2. הוסף כל אנטיגן כדי חרוזים מופעל ולהביא את הנפח הכולל עד 500 μl ב 50 מ"מ MES, pH 5.0. מערבבים את האנטיגניםחרוזי ד ידי מערבולת.
  3. דגירה אנטיגנים וחרוזים עבור שעה 2 עם ערבוב על ידי סיבוב (~ 15 סל"ד) בטמפרטורת החדר בחושך. גלולת החרוזים מצמידים ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  4. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים 500 μl של בופר פוספט (PBS) אלבומין -bovine (BSA) monolaurate -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) -sodium אזיד (PBS-TBN) pH 7.4 ידי מערבולת sonication. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant.
    זהירות: אזיד הנתרן הוא כימיקל רעיל בחריפות. זה קטלני אם בלע או מקבל במגע עם העור. לא לנשום אבק / קטר / גז / ערפל / אדים או תרסיס. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE של) בעת טיפול ולהיפטר בהתאם לחוקים המתאימים.
  5. Resuspend את החרוזים 1 מ"ל של PBS-TBN ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  6. גלולה חרוזים על ידי microcentrifugation ב XG 10,000 במשך 2 דקות.
  7. חזור על שלבים 2.5 ו -2.6.
    הערה: זה מספק סך של שני שוטף עם PBS-TBN.
  8. Resuspend החרוזים מצמידים ורחץ ב 1 מ"ל של PBS, 1% BSA, 0.05% אזיד, pH 7.4. אחסן את החרוזים מצמידים במקרר 2-8 מעלות צלזיוס בחושך.

3. ספירת חרוז

  1. כן 1:10 דילול של החרוזים בשילוב במים או חיץ PBS.
  2. טען 10 μl של דילול חרוז גבי hemocytometer בנקודת מבוא המדגם.
  3. רוזן חרוז ראה באחד הרשתות בפינה 4 x 4. חשב את המספר הכולל של חרוזים מצמידים באמצעות הנוסחה הבאה: הרוזן (1 בפינת 4 x 4 רשת) x (1 x 10 4) x (גורם לדילול) x resuspension נפח מ"ל.

4. אישור של Antigen זיווגים

  1. Resuspend את תערובת המניות של חרוזי מצמידי אנטיגנים של עניין על ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  2. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים את סופיריכוז של 100 חרוזים / μl של כל חרוז ייחודי להגדיר במאגר PBS-1% BSA (PBS-1% BSA, pH 7.4).
  3. הכן לפחות 7 שני דילולי סדרה של מינים אנטי נוגדני IgG עיקריים על פי המלצות היצרן בצלחת תחתונה 96-גם עגולה עם חיץ BSA% PBS-1.
  4. טרום להרטיב טור 8-גם נפרד (8 שורות) של צלחת 96-גם מסנן תחתונה עבור כל בדיקת אישור צימוד אנטיגן עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. הוסף 50 μl של עובד תערובת חרוז (חרוזי מצמידי אנטיגן) אל הבארות טרום הרטובות.
  5. הוסף 50 μl של דילולים נוגדנים שורות 1-7 של כל עמודה של צלחת מסנן 96-היטב 50 μl של חיץ PBS-1% BSA לחתור 8 במקום נוגדן מדולל לשמש בארות רקע. מערבבים עם פיפטור רב ערוצית על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. בצע אותו התהליך עבור כל סט חרוז מצמידי אנטיגן כדי להיות מאושר.
  6. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפ 'החדרerature עבור שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום.
  7. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור 1x. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  8. לדלל biotinylated אנטי-מינים ספציפיים נוגדן זיהוי משני IgG ל -16 מיקרוגרם / מ"ל ​​BSA% PBS-1.
  9. הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדולל היטב כל על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  10. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  11. Resuspend את החרוזים 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  12. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  13. הוסף 50 μl של כתב היטב כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
  14. Cמעל צלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  15. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית מבוסס החרוז נמדדות בעוצמת קרינת חציון (MFI). תמיד מתייחס לגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

5. הרוק Multiplex Immunoassay

  1. סר רוק מהמקפיא -80 ° C ולאפשר להפשיר בטמפרטורת חדר.
  2. Resuspend אנטיגן מצמיד מניות חרוז ידי מערבולת sonication במשך 20 שניות.
  3. הכינו תערובת חרוז עובד על ידי דילול מניות חרוז מצמידים לריכוז סופי של 100 חרוזים / μl של כל קבוצה חרוז ייחודי חיץ BSA% PBS-1.
  4. הכן דילול 1: 4 של הרוק wה- i-PBS 1% חיץ BSA בתוך 96 באר, צלחת באר עמוקה.
  5. צלחת מסנן טרום רטוב עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום.
  6. הוסף 50 μl של תערובת חרוז עבודת נפח שווה של רוק מדולל ל 95 בארות של 96 הצלחות המסננות גם עבור דילול 1: סופי 8. מערבב תגובות עם פיפטור רב ערוצים. הפיקוח אחד היטב, מוסיפים 50 חרוזים μl מצמידים אנטיגן פלוס 50 μl של חיץ PBS-1% BSA (כתחליף הרוק).
  7. מכסים ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 על שייקר microplate ב 500 סל"ד. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  8. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  9. לדלל נוגדן זיהוי משני אנטי אנושי עז biotinylated IgG ל -16 מ"ל מיקרוגרם / ב BSA% PBS-1.
  10. הוסף 50 μl מדולל נוגדנים משני זה טוב ומערבבים תוכן עםפיפטור רב ערוצים.
  11. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  12. חרוזים Resuspend ב 50 μl של BSA% PBS-1 עם פיפטור רב ערוצי.
  13. לדלל הכתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE) עד 24 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב BSA% PBS-1.
  14. הוסף 50 μl כתב היטב כל ומערבבים עם פיפטור רב ערוצים.
  15. מכסים בצלחת מסנן ולאפשר כדי לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר צלחת. הסר supernatant ידי ואקום. לשטוף בארות עם 100 μl של חיץ לשטוף ולהסיר supernatant ידי ואקום. חזור על לשטוף 1x.
  16. חרוזים Resuspend ב 100 μl של BSA% PBS-1 ולנתח 50 μl באמצעות מנתח 29.
    הערה: תוצאות של immunoassay זמנית נמדדות Intensity חציון הקרינה (MFI) יחידות. תמיד מתייחסיםאת הגרסה האחרונה של מדריך התוכנה, אם היא זמינה, כדי למנוע טעויות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סט חרוז ייחודי אחת שמש כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב מדגם לדגום השתנות. חרוזים אלה טופלו באופן זהה חרוזים בשילוב אנטיגן למעט העובדה שהם לא הודגרו עם כל אנטיגן בשלב צימוד. ערכי MFI> 500 מתקבל החרוזים המלאים מודגרות עם כל דגימות הרוק הוצאו עוד מנתח עקב זיהום חשוד בסרום ואת התגובות שנותרו יומן מבוזרות. הרוק יכול להיות מזוהם עם סרום אם החניכיים הם שפשפו גם נמרצות עם הספוג המצורף למכשיר האוסף או אם המשתתף במחקר יש מחלת חניכיימיים. יומן טרנספורמציה נתונים MFI ששימשו בחישוב נקודת חתוכים immunopositive של 505 MFI מבוסס על ממוצע פלוס 3 סטיות תקן של ערכי MFI יומן. בנוסף, חרוזי מצמידי אנטיגן נוספו בארות ספציפיות אשר טופלו כפי בארות בכל דרך חוץ דילרוק התנהגותיות בילדים הוחלף PBS-1% BSA להעריך קרינת רקע ו ​​תגובתיות הצולבת. ערכי MFI שהושגו בארות רקע אלה מכל אלה מפחיתים את ערכי MFI מכל סט חרוז מצמידי אנטיגן לכל דגימת רוק.

צימוד החרוז אושר באמצעות מינים ספציפיים מחי זיהוי ראשונים נוגדנים ספציפיים לכל אנטיגן. כדי להבטיח כי חרוז בשילוב אנטיגן היו מסוגלים מתקרב את הטווח הדינמי של assay, הגדרנו צימוד נכון בתור MFI ≥18,000, תצפית של מנת תגובה ו תגובתיות הצולבת בין נוגדנים ראשוניים-מטרות אי <10% כמתואר 2 . אישורי צימוד נציג עבור ג jejuni וט גונדי של אנטיגנים ב assay מוצג באיור 1.

בהתבסס על נקודת החיתוך הוקמה (505 MFI), שיעור immunoprevalenceים עבור דגימות (n = 2,078) נע בין כ -2% (n = 41) עבור ט גונדי 50% כמעט (n = 1,009) עבור GI.1 norovirus (איור 2). הנתונים מצביעים על כך ששיעור immunoprevalence היה גבוה ביותר עבור noroviruses ואחריו הפטיטיס וירוס וח ' פילורי.

בעוד 32% (n = 672) מהדגימות היו immunonegative עבור כל פתוגנים assay, 68% (n = 1,406) היו immunopositive לפתוגנים אחד או יותר. איור 3 מציג את התפלגות immunopositivity לאחד או יותר פתוגנים.

איור 1
איור 1: צימוד אישור מנתח עבור שני של אורגניזמים immunoassay זמנית אישור זיווגים בוצע עבור כל אנטיגנים ואת הגרפים עבור ג. jejuni וט גונדי בנתון זה הוא representative של אישורי הצימוד עבור אנטיגנים של immunoassay זמנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. Immunoprevalence כדי פתוגנים ספציפיים Immunoprevalence לפתוגנים ספציפיים immunoassay זמנית נע בין כ -2% עבור ט גונדי לכמעט 50% עבור GI.1 norovirus. נוגדנים כנגד אנטיגנים norovirus היו יותר נפוץ נצפו ואחריו HAV (הפטיטיס וירוס) וח ' פילורי. ט גונדי ו- C. נוגדני jejuni הופיעו בתדירות נמוכה יותר של דגימות הרוק נתחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של ההוא דמות.

איור 3
איור 3:. פילוח immunopositivity לפתוגנים מרובים בו זמנית immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של immunopositivity לפתוגנים בו זמנית נפח דגימה 50 μl. כמעט שליש של דגימות רוק assayed היה immunonegative נוגדנים כנגד כל אנטיגנים הקומפלקס. כ 31% מהדגימות היו immunopositive עבור אנטיגן אחד בעוד רבע היה חיובי לשני אנטיגנים. 9.4% היו immunopositive לשלושה אנטיגנים. 3% היו חיוביים עד ארבעה או יותר אנטיגנים בעת ובעונה אחת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אַנְטִיגֵן חרוז סט חיץ צימוד ריכוז Ag (מיקרוגרם) # של חרוזים 1 בפינה # של חרוזים / μl Vol. עבור 100 B / UL עבור 4 מ"ל (μl)
ג jejuni 8 MES 5.0 50 64 6,400 94
הליקובקטר פילורי 33 MES 5.0 25 71 7,100 85
הפטיטיס A 42 MES 5.0 100 91 9,100 66
ט גונדי 30 MES 5.0 25 85 8,500 71
norovirus GII.4 55 MES 5.0 5 72 7,200 83
norovirus GI.1 67 MES 5.0 5 63 6,300 95
זוגי 80 MES 5.0 60 6,000 100
נפח כולל של חרוזים (μl) 594
נפח כולל של חיץ צורך (μl) 3406

טבלת 1:. עבודת תערובת חרוז עבור immunoassay זמנית לאחר הצימוד והאישור הושלמו, תערובת אמן המורכבת כל קבוצת חרוז הוכנה כמוצג. מיקס מאסטר הופץ בקרבll של בארות 96 את הצלחת היטב. כל הבארות הודגרו עם רוק למעט היטב מלא רקע אחד שהכיל חרוזים רק חיץ BSA% PBS-1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תוצאות אלו מצביעות כי השיטה immunoassay זמנית שימושי להפלות בין דגימות רוק כי הם immunopositive או immunonegative. כדי לקבוע immunopositivity, נקודה אחת חתוכים פותחה על ידי חישוב הממוצע פלוס שלוש סטיות תקן מן תגובות MFI טרנספורמציה יומן של החרוזים המלאים הזוגיים נבדקו עם כל דגימות הרוק. הנקודה החתוכה ספקה את היכולת להעריך את החשיפה ואת immunoprevalence או א פתוגנים בודדים או מרובים. כוח מפלה זה עשוי להיות שימושי מחקרי אוכלוסייה לחקור סיכונים בריאותיים הקשורים עם חשיפה לפתוגנים סביבתיות ואחרות.

ישנן מספר שיטות אחרות שיכול לשמש כדי לקבוע נקודת חתוכים בהתאם להתפלגות MFIs, השולט זוגית ומה שאלת המחקר נועד לענות. כמה דוגמאות לקביעה-offs לחתוך כוללות מודלים מעורבים סופיים 24-26, אומרות פלוס 3סטיות התקן של תגובות שולטות, אומרות פלוס 2 סטיות תקן של תגובות לביקורות, ושלוש פעמים הממוצעות של תגובות שלט 27,28. עבור הקרנות פשוט, קריטריונים מחמירים פחות ניתן להשתמש אך מחקרים אפידמיולוגיים, זה עשוי להיות מתאים יותר להעסיק הגדרה מחמירה יותר כדי להפחית את ההסתברות של דיווח תוצאות חיוביות שגויות. ליישום לראשונה של התקן שלנו הוא להסתכל immunoconversion ו immunoprevalence בין שחיינים הלא- שחיינים. במחקר זה, MFIs המלא הזוגי לא חולק כלל והתוצאות שהוסבו יומן.

יתרונות ביצוע immunoassay זמנית מבוסס חרוז לכלול את השימוש של כרכי מדגם נמוכים מאוד, צמצום הזמן והעבודה והיכולת למדוד תגובות עבור עד 500 analytes בו זמנית תוך הדורשים מידה מינימאלית של חומרים כימיים. לעומת זאת, שיטות מסורתיות של הערכת רמת הנוגדנים מעידה על חשיפה ו / או זיהום (למשל ELISA של דורשים לפחות 100 μl של מדגם בעוד immunoassay זמנית עשויים לדרוש 50 μl או פחות.

מגבלות של immunoassay זמנית כוללות את הצורך אופטימיזציה הקפדני על מנת לקבוע את הריכוזי האופטימלי של לכידה עיקרית ונוגדני זיהוי משניים, אנטיגנים וכתב. גם חוצה תגובתיות היא דאגה עיקרית ב immunoassays כמו נוגדנים נגד אנטיגן מסוים עלולים לחצות להגיב עם אנטיגנים מאורגניזמים אחרים ובכך להביא קריאות חיוביות כוזבות. אופטימיזציה, תגובתיות צולבת ולא ספציפית מחייב טופלו בעבר 2-4. הצלחתו של כל assay כזה תלויה במידה רבה על היכולת להשיג אנטיגנים immunogenic מאוד, כמו גם antibo הספציפימת לאנטיגנים אלה לשימוש בשלבי אישור צימוד צימוד חרוז. מגבלה נוספת היא הזמינות המוגבלת של מאופיינת (חיובי diagnostically ושליליות) דגימות כדי לאמת את המבחנים.

ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. אלה כוללים: הבטחת אנטיגנים כי יהיה מצמידים את החרוזים אינם מכילים חלבונים זרים, אזיד, גליצין, טריס או כל אמינים ראשוניים. אם כל הסוכנים האלה קיימים בהכנת אנטיגן, הם צריכים להיות הוסרו על ידי דיאליזה או כרומטוגרפיה. מומלץ כי אחד צריך להתחיל עם 5 מיקרוגרם של אנטיגן לכל 5 מיליון חרוזים לכיל כדי למצוא את הריכוז האופטימלי. בחר את ריכוז נוגדן זיהוי האופטימלי שנותן את הרגישות הטובה ביותר וטווח דינמי. יש לזכור כי אותות נוטים להקטין ככל עלייה ריכוז נוגדנים לאנטיגן וזיהוי (אפקט וו). לדוגמה, אם האות יורדת ככל שעולה ריכוז אנטיגן ואז לזהותנוגדן יון ניתן להגביל. לעומת זאת, אם אותות להקטין ככל עליות נוגדן איתור אז הכתב (SAPE) עשוי להיות מגביל. בדוק את זמני עבור תגובתיות צולבת על ידי שילוב של הצימוד האופטימלי עבור כל חלבון (5,000 של כל חרוז להגדיר לכל טוב). בדוק את ערכות חרוז המרובבות על ידי שילוב עם כמות נוגדן זיהוי האופטימלית. מטב את הכתב ולעשות עקומת סטנדרט של אנטיגן על ידי בדיקה של כל אנטיגן בנפרד.

פתרון בעיות של immunoassay זמנית כדי לשפר את הרגישות ואת להגדיל את האות ניאון החציוני חשובים באופן קריטי. כדי לשפר את הרגישות, להקטין גם את כמות האנטיגן מצמידה את החרוזים או ריכוז נוגדן זיהוי. שימוש נוגדן זיקה חזק יותר ללכוד ו / או זיהוי עשוי גם לשפר את הרגישות. הגדלת כמות האנטיגן מצמידה את החרוזים עלולה להגביר את אות הניאון החציוני. מחקר אחד הראה כי מראש דוגרים דגימות סרום עם polyvinylalcohol בתוספת polyvinylpyrrolidone (PVX) חיץ הוא מסוגל לדכא ספציפיים שאינם מחייבים מבחני סרולוגיות באמצעות assay זמנית מבוססי חרוז 30 כמו זו שאנו מתארים כאן. עם זאת, מחקר אחר על ידי משתפי הפעולה שלנו לא מצא השפעה משמעותית בין PBS-BSA ו PVX מאגרים. מסקנתם עוד כי בשל הצמיגות הגבוהה של למאגר PVX, זה יצר בעיות עם רכישת החרוז הזה המנתח וקצף נוצר בארות microplate 3.

לסיכום, הצגנו שיטה כי הוא מסוגל למדוד בנוכחות נוגדני IgG רוק אדם פתוגנים רב בו זמנית נפח דגימה קטן מאוד. בעתיד, assay זה ישמש כדי לזהות נוכחות של נוגדנים הרוק הקשורים חשיפות הקשורות שחייה או זיהומים וכדי לסייע להודיע ​​מודלים להערכת סיכונים. בנוסף, assay ניתן להשתמש כדי למדוד נוגדנים הקשורים exposur מוטס foodbornees, לקבוע זיהומי אירוע או immunoconversions ולספק מידע אימונולוגיים קריטי אפידמיולוגים ניצוח מחקרים אוכלוסייה מסוג השאלון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

הסוכנות להגנת הסביבה בארצות הברית באמצעות אופיס של מחקר ופיתוח במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. זה כבר נתון הביקורת המנהלית של הסוכנות ואושר לפרסום. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364, (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38, (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62, (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182, (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173, (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26, (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5, (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6, (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52, (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1, (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50, (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198, (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26, (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134, (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74, (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309, (1-2), 200-204 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats