Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

etiyoloji ve çevresel patojenlere karşı insan maruziyet etkileri dolayısıyla, pozlama ve enfeksiyonlar kullanarak maliyetli, yüksek hacimli yaklaşımları değerlendirmek yeteneği vazgeçilmez olacağını, dünya çapında önemli bir endişe ve. Bu yazıda, aynı anda birden fazla patojen insan tükürük antikorların varlığı ölçebilen bir tane bazlı çoklu immunoassay geliştirilmesi ve analizini açıklamaktadır. o, invaziv olmayan ucuz ve serum daha toplamak için kolaydır çünkü tükürük bu uygulamada özellikle çekici. Çevresel patojenlerinin antijenlerinin karboksillenmiş mikrosferler (taneleri) birleştirilmiş bir tane bazlı, solüsyon faz tahlili kullanılarak insan tükürük örnekleri çok küçük hacimlerde antikorları ölçmek için kullanılmıştır. Boncuk Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviruses (G I.1 ve G II.4) antijenleri ve hepatit A virüsü ile birleştirildi. antijenler yeterli birleştirildi sağlamakboncuklar, birleştirme biyotinlenmiş anti-tür ikincil bir saptama antikorları ve streptavidin-R-fikoeritrin muhabir (SAPE) ile kuluçkalandı ve ardından, türe-özgü, hayvansal kaynaklı primer yakalama antikorları kullanılarak teyit edildi. herhangi bir antijene bağlı değildi dışında spesifik olmayan ölçmek için bir kontrol olarak, bir boncuk grubu diğerlerine aynı işleme tabi tutuldu. antijen bağlı olan ve kontrol tanesi, daha sonra akış sitometrisi ilkelerine göre yüksek bir verim Analyzer üzerinde ölçülen, ileriye yönelik olarak toplanan, insan tükürük numuneleri ile inkübe edilmiştir, ve her bir antijene karşı antikorlar, ortalama florasan yoğunluğu birimleri (MFI) ölçüldü . Bu multipleks immunoassay daha az numune ile daha fazla veri içeren avantajlar, bir numarası vardır; azaltılmış maliyetler ve işçilik; ve yetenek ilgi birçok hedefleri tahlil özelleştirmek için. Sonuçlar tükrük çoklu bağışıklık especia olabilir, daha önceki maruz ve enfeksiyonları belirleme yeteneğine sahip olabileceğini göstermektedirBüyük insan topluluklarını kapsayan gözetim çalışmalarında Lly faydalıdır.

Introduction

Ishal ilişkili hastalık seksen sekiz yüzde dünya çapında yaklaşık 1.5 milyon ölüme neden, kirli su insan maruz güvensiz gıda ve kötü sanitasyon / hijyen ile ilişkilidir, çoğunluğu çocuk 1 bulunmaktadır. Bu halk sağlığı yetkilileri ve politika yapıcılar için endişe önemli bir nedenidir. Su bazlı ve diğer çevresel patojenler ile ilişkili pozlama ve hastalıkları araştırmak için bir çaba, insan örneklerinde 2-4 antikorları ölçmek için bir multipleks immunoassay geliştirdi. Bu yöntem, bu patojenlere maruz kalma belirlemek ve daha iyi immunoprevalence ve olay enfeksiyonları tanımlamak için epidemiyolojik çalışmalar uygulanabilir.

Tükürük insan biyomarker araştırma için serum alternatif olarak önemli söz sahibidir. Tükürük kullanmanın avantajları arasında non-invaziv ve numune toplama, düşük maliyet kolaylığı vardır, ve numuneler kolayca çocukların 5-7 <alınabilir/ Sup>. Serum ve tükürük örnekleri H. karşı antikorlar için yoğun çalışmalar yapılmıştır pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatit virüsleri A ve C 13-14, Noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dang humması virüsü 16, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), 17 ve Escherichia coli O157: H7 18.

Bir çoklu immünolojik eş zamanlı olarak tek bir örnek hacmi içinde ve bir döngü veya çalışmasında çok analit analizi sağlar. C Çoklanmış antijenler jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatit A virüsü, ve iki Noroviruses bir kullanarak bu patojenler, insan tükürük IgG 2-4 ve IgA 3,4 ve plazma IgG 2,3 antikor tepkilerini ölçmek için kullanılmıştırBoncuk esaslı çoklayıcı immüno. su, toprak ve gıda mikroplara maruz kalma epidemiyolojik çalışmalar ile birlikte kullanıldığında, bu çalışmada açıklanan testin tipi çevre patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların anlayışı geliştirmek için değerli bilgiler verebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalarda elde edilen tükürük antikor veriler risk değerlendirmesi modelleri 19-22 geliştirmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Onay (KİK # 08-1844, Kuzey Karolina, Chapel Hill, NC, USA Üniversitesi) Boquerón Beach, Porto Riko, en beachgoers gelen uyarılmış oluğu tükürük örneklerinin toplanması için Amerika Birleşik Devletleri'nde bir parçası olarak Kurumsal Değerlendirme Kurulu elde edildi çevre Koruma Ajansı (USEPA) Milli Epidemiyolojik ve Dinlenme (NEEAR) Su Çalışması 23 çevresel Değerlendirme yüzme ilişkili risklerini ve hastalıkları değerlendirmek için. Çalışma konuları bilgilendirilmiş onam sağlanan ve eğitimli USEPA yükleniciler tarafından tükürük toplama cihazının kullanımı ile ilgili talimatı verildi. Tükürük numuneleri alınması üzerine, bu santrifüjlenmiş ve 4 anlatıldığı gibi -80 ° C'de saklandı, buz üzerinde taşınmıştır ve bulundu.

1. Boncuk Aktivasyon

  1. Vorteks ve 20 saniye sonicating ve mikrosantrifüj tüplerine stok boncuk (400 ul) transferi yaklaşık 5.0 x 10 6 tarafından süspanse boncuk seti stokları.
    Not: TO 12.5 x 10 6 boncuk / ml'lik bir konsantrasyonda temin edilmektedir boncuk.
  2. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de santrifüj edilerek stok boncuk pelet.
  3. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile damıtılmış su (dH 2 O) Süpernatantı ve 100 ul pelet boncuklar tekrar süspansiyon. Adımı tekrarlayın 1.2.
  4. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 100 mM sodyum fosfat monobazik, pH 6.2, 80 ul yıkandı boncuklar tekrar süspansiyon.
  5. Kullanımdan hemen önce, 10 mg Sülfo-NHS kana 200 ul dH 2 O eklenerek 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sülfo-NHS) çözüm. girdap ile karıştırın.
  6. Boncuklar 50 mg / ml Sülfo-NHS 10 ul ekle. girdap ile karıştırın.
  7. Kullanımdan hemen önce, 10 mg EDC kana 200 uL damıtılmış su (DH 2 O) eklenerek 50 mg / ml 1-etil- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) çözüm. girdap ile karıştırın.
  8. 50 10 ul ekleyintanelere mg / ml EDC çözeltisi. girdap ile karıştırın. 10 dakika aralıklarla girdap karıştırma ile, karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
  9. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile, 50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit (MES), pH 5.0, 250 ul içinde yeniden süspanse boncuklar.
  10. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
  11. Tekrarlayın 1.9 ve 1.10 adımları.
    Not: Bu, 50 mM MES, pH 5.0 ile iki kez yıkamadan toplam sağlar.
  12. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 50 mM MES, pH 5.0, 100 ul boncuk tekrar.

2. Boncuk Kaplin

  1. Çift Tablo 1 'de gösterilen konsantrasyonları kullanılarak kordon kümelerine antijenler.
  2. aktive boncuklar, her antijen ekleyin ve 50 mM MES, pH 5.0 içinde 500 ul toplam hacim getirmek. antijenleri karıştırın birgirdap tarafından d boncuklar.
  3. karanlıkta, oda sıcaklığında dönme (~ 15 dak) karıştırma ile 2 saat süre ile, antijenleri ve boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile bağlanmış boncuk Pelet.
  4. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ul içinde yeniden süspanse boncuklar (PBS) -bovine serum albümini (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) -sodyum azid (PBS-TBN) girdap ve sonikasyon ile pH 7.4 ile yıkanır. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak.
    Dikkat: Sodyum azid bir akut toksik bir kimyasaldır. Yutma veya cilt ile temasında alırsa o ölümcüldür. Toz / duman / gaz / sis / buhar veya sprey teneffüs etmeyin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) 'ın işlerken giyin ve uygun kanunlara uygun olarak bertaraf edin.
  5. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile PBS-TBN 1 ml boncuk tekrar.
  6. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüje edilerek boncuk Pelet.
  7. Tekrarlayın 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
    Not: Bu PBS-TBN ile iki yıkar toplam sağlar.
  8. 1 ml PBS,% 1 BSA,% 0.05 azid, pH 7.4 içinde bağlı ve yıkandı boncuk süspanse. karanlıkta 2-8 ° C buzdolabı bağlanmış boncuklar saklayın.

3. Boncuk Sayısı

  1. su veya PBS tamponu içinde bağlanmış boncuk 1:10 seyreltme hazırlayın.
  2. Yük örnek tanıtım noktasında bir hemasitometre üzerine boncuk seyreltme 10 ul.
  3. 4 x 4 köşe ızgaraları birinde görülen boncuk sayın. Kont (4 x 4 ızgara 1 köşesi) x (1 x 10 4) x (seyreltme faktörü) ml x tabanda hacmi: aşağıdaki formül kullanılarak birleştiğinde boncuk toplam sayısını hesaplayın.

Antijen bağlamalar 4. Onay

  1. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile ilgi antijenlere birleştiğinde boncuk stok karışımı tekrar süspansiyon.
  2. nihai bağlanmış boncuk stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayınPBS-% 1 BSA tamponu (PBS% 1 BSA, pH 7.4) içinde belirlenen her bir benzersiz boncuk / ml, 100 boncuk konsantrasyonu.
  3. en az 7 PBS-% 1 BSA tamponu ile 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın üreticinin tavsiyelerine göre IgG primer antikor anti-tür seri seyreltileri iki misli hazırlayın.
  4. Yıkama tamponu, 100 ul her bir antijen birleştirme doğrulama testi için 96 oyuklu filtre taban plakasının ayrı bir 8 oyuklu kolonu (8 sıra) önceden ıslak ve vakum ile süpernatantı. Önceden ıslak oyuklara boncuk karışımı (antijene bağlanan boncuklar) Çalışma 50 ul ekle.
  5. Arka plandaki kuyulara olarak hizmet seyreltilmiş antikor yerine 8 satır 96-çukurlu bir filtre plakasının her bir sütunun satır 1-7 ve PBS% 1 BSA tamponu 50 ul antikor seyreltileri 50 ul ekle. pipetleme ile 5 kez aşağı çok kanallı bir pipet ile karıştırılır. Her antijen birleştiğinde boncuk seti için aynı prosedürü uygulayın teyit edilecek.
  6. Kapak ve oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin500 rpm'de bir mikro çalkalayıcı içinde 1 saat süre ile kısa süreli olarak. vakum ile süpernatantı.
  7. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. 1x tekrarlayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
  8. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile anti-türe özel IgG sekonder antikor saptama seyreltilir.
  9. aşağı 5 kez yukarı pipetleme ve her kuyuya seyreltilmiş ikincil antikor 50 ul ekleyin.
  10. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  11. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
  12. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
  13. her muhabir 50 ul iyi ekleyin ve yukarı pipetleme ve 5 kez aşağı karıştırın.
  14. Cve filtre plakası üzerine bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  15. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı 29 ile 50 ul analiz eder.
    Not: tane bazlı çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. hataları önlemek için varsa, her zaman, yazılım kılavuzunun en son sürümü bakın.

5. Tükürük Multiplex İmmunoassay

  1. -80 ° C dondurucu tükürük alınır ve oda sıcaklığında erimeye sağlar.
  2. Süspanse antijen 20 saniye vorteks ve sonikasyon ile boncuk stokları birleştiğinde.
  3. PBS-% 1 BSA tampon içinde benzersiz her boncuk grubunun / ml, 100 boncuk nihai konsantrasyona bağlı kordon stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayın.
  4. tükürük 4 seyreltme w: 1 hazırlayınPBS-% 1 BSA, 96 tampon de, derin oyuklu plakaya i.
  5. Ön ıslak filtre yıkama tamponu 100 ul ile plaka ve vakum ile süpernatant kaldırmak.
  6. 8 nihai seyreltme: çalışan bir boncuk karışımı ve 1 96 oyuklu filtre plakası 95 oyuklarına seyreltildi tükürük, eşit hacimde 50 ul ekle. Çok kanallı bir pipet ile reaksiyonları karıştırın. de birinin kontrol edilmesi için, 50 ul antijen bağlanan boncuklar artı (tükürük için bir yedek olarak) PBS-% 1 BSA tampon 50 ul ekle.
  7. Kapak 500 rpm'de bir mikro-plaka çalkalayıcıda 1 saat süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe sağlar. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  8. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
  9. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile edilmiş keçi anti-insan IgG ikincil antikoru saptama seyreltilir.
  10. her çukuruna ikincil antikor seyreltilmiş 50 ul ekle ile karıştırınÇok kanallı bir pipet.
  11. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  12. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
  13. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
  14. her 50 ul muhabiri de ekleyin ve çok kanallı pipet ile karıştırın.
  15. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  16. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı 29 ile 50 ul analiz eder.
    Not: çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) birimleri cinsinden ölçülür. Her zaman ifadeYazılım kılavuzun en son sürümü, varsa hataları önlemek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir benzersiz Boncuk değişkenlik örnek için spesifik olmayan bağlanma ölçmek ve kontrol numunesi olarak kullanılmıştır. Bu boncuklar da birleştirme aşamasında herhangi bir antijen ile inkübe değil haricinde antijene bağlanmış boncuklara benzer şekilde muamele edilmiştir. ayrıca serumdan şüpheli kirlenme nedeniyle analizleri ve kalan yanıtlar dağıtılan log edildi tüm tükürük örnekleri ile inkübe kontrol boncuk elde edilen MFI değerleri> 500 çıkarıldı. dişeti toplama cihazına veya çalışma katılımcı periodontal hastalık varsa ekli sünger ile çok güçlü bir şekilde ovuşturdu eğer tükürük serum ile kontamine olabilir. Günlük MFI veri ortalama artı günlük MFI değerlerinin 3 standart sapma dayalı 505 MFI bir immünopozitif kesme noktasını hesaplamak için kullanıldı dönüştürdü. Buna ek olarak, antijene bağlı boncuklar inceltilmiş dışında her şekilde test kuyuları tedavi edildi belirli çukurlara eklendiuted tükürük arka floresan ve çapraz reaktivite değerlendirmek için PBS-% 1 BSA ile değiştirildi. Bu Arka plandaki kuyulara elde edilen MFI değerleri her tükürük örnek için her bir antijen-bağlı kordon kümesinden MFI değerleri çıkarılmıştır.

Boncuk bağlama her bir antijen için spesifik hayvan kaynaklı türe özgü primer saptama antikorları kullanılarak teyit edildi. 2 tarif edildiği gibi, antijen bağlanan boncuklar tahlilinin dinamik aralığını yaklaşan sahip olmasını sağlamak için, bir MFI ≥18,000 doz tepkisi ve primer antikorlar ile <% 10 hedef olmayan arasında çapraz reaktivite gözlem gibi uygun kuplaj tanımlanan . C. Örnek birleştirme teyit jejuni ve T. tahlilinde antijenlerin gondii, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

(505 MFI) kuruldu kesme noktasına göre, immunoprevalence oranınumuneler için S (n = 2.078) yaklaşık% 2 (n = 41) ile ilgili T için değişmektedir gondii norovirus GI.1 (Şekil 2) için yaklaşık% 50 (n = 1009) için. Veri immunoprevalence hızı Noroviruses için en yüksek hepatit A virüsü ve H. izledi belirtmek pylori.

Örneklerin% 32 (n = 672), deneyde patojenlerin tüm immunonegative iken,% 68 (s = 1,406) Şekil 3., Bir ya da daha fazla patojenlere immunopozitif bir ya da daha çoğuna immünreaksiyon dağılımını göstermektedir patojenler.

Şekil 1
Şekil 1: bağlanması onay çoklu bağışıklık organizma için iki analiz birleştirilmesi onayı antijenleri için gerçekleştirilmiştir ve grafikler C için edildi. jejuni ve T. Bu şekilde gondii repre edilirSorumlunuzu multipleks immunoassay içinde antijenler için bağlantı teyidinde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Çoklu bağışıklık belirli patojenlerin özgü patojenlere Immunoprevalence Immunoprevalence yaklaşık% 2 ila T. değişmektedir gondii norovirus GI.1 için yaklaşık% 50 arasındadır. Norovirus antijenlerine karşı antikorlar, daha yaygın olarak HAV (hepatit A virüsü) ve ardından H gözlenmiştir pylori. T. gondii ve C jejuni antikorlar analiz tükürük örneklerinde daha az sıklıkla ortaya çıktı. inci büyük halini görmek için tıklayınızrakamdır.

Şekil 3,
Şekil 3:. Birden patojenlere immünreaksiyon dağılımı aynı zamanda çoklu immüno aynı anda 50 ul örnek hacmi birden fazla patojenlere immünreaksiyon analizi sağlar. Hemen hemen tahlil tükürük örnekleri üçüncü bir multipleks antijenlerin her karşı antikorlar için immunonegative oldu. çeyrek iki antijenlere pozitif iken yaklaşık örneklerin% 31'i bir antijen için immünopozitif oldu. % 9.4, üç antijenlere immünopozitif oldu. % 3 aynı anda dört ya da daha fazla antijenlere karşı olumlu oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Antijen Boncuk Seti birleştirme tamponu Ag Konsantrasyon (ug) 1 köşede boncuk # Boncuk içinde / ml Vol. 4 ml 100 B / uL (ul) için
C. jejuni 8 MES 5.0 50 64 6400 94
H. pylori 33 MES 5.0 25 71 7100 85
Hepatit a 42 MES 5.0 100 91 9100 66
T. gondii 30 MES 5.0 25 85 8500 71
Norovirüs GII.4 55 MES 5.0 5 72 7.200 83
Norovirüs GI.1 67 MES 5.0 5 63 6300 95
uncoupled 80 MES 5.0 60 6.000 100
tanelerin toplam hacmi (ul) 594
ihtiyaç duyulan tampon toplam hacmi (ul) 3406

Tablo 1:. Birleştirme ve onay tamamlandıktan sonra gösterildiği gibi çoklu immunoassay için tanecik karışımı çalışan her kordon kümesi oluşan bir ana karışımı elde edilmiştir. master miks bir arasında dağıtıldı96 gözlü plaka içindeki deliklerin LL. Wells tümü sadece boncuk ve PBS-% 1 BSA tampon ihtiva edilen bir plan kontrol oyuğu dışında tükürük ile inkübe edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu sonuçlar, çok katlı bir bağışıklık deneyi, immünopozitif ya immunonegative olan tükürük örnekleri arasında ayrım için yararlı olduğunu göstermektedir. immunopozitivitesi belirlemek için, tek bir kesim noktası ortalama artı tükürük örneklerinin her test kontrol Kuplajsız boncuk log dönüştürülmüş MFI yanıtları üç standart sapma hesaplanırken tarafından geliştirilmiştir. kesim noktası, ya bir tek ya da çok patojenlere maruz kalma ve immunoprevalence değerlendirme yeteneği elde edildi. Bu ayrımcı güç, çevresel ve diğer patojenlere maruz kalma ile ilgili sağlık riskleri araştırmak için nüfus çalışmalarında yararlı olabilir.

MFI dağıtımı, Kuplajsız kontrolleri ve hangi çalışma cevaplamak için tasarlanmıştır soru bağlı bir cut-off noktası belirlemek için kullanılabilecek birkaç başka yöntemler vardır. Cut-off belirlemek için bazı örnekler, sonlu karışık modelleme 24-26 dahil ortalama artı 3kontrollere cevapların standart sapmaları, denetimlere cevapların 2 standart sapma ve kontroller 27,28 verilen yanıtların üç kez ortalama artı anlamına gelir. Basit gösterimleri için, daha az sıkı kriterler kullanılabilir fakat epidemiyolojik çalışmalar için, yanlış pozitif raporlama olasılığını azaltmak için daha sıkı bir tanım istihdam etmek daha uygun olabilir. Bizim ilk uygulama yüzücüler ve bilmeyenlerin arasında immunoconversion ve immunoprevalence bakmaktır. Bu çalışmada, Kuplajsız kontrol MFI normal dağılım ve sonuçları günlük dönüştürülmüştür.

Bir boncuk tabanlı multipleks immunoassay yapmadan avantajları zaman ve emek ve reaktiflerin az miktarda gerektiren süre aynı anda en fazla 500 analitler için tepkilerini ölçmek yeteneği çok düşük örnek hacimlerinin kullanımı, azaltılması sayılabilir. Buna karşılık, maruz kalma ve / veya enfeksiyon durumunu işaret antikor düzeylerinin değerlendirilmesi geleneksel yöntemleri (örneğin ELISA testi) emek yoğun, tamamlamak için birkaç saat sürebilir ve bir seferde sadece tek bir analit ölçmek için kullanılabilir. Bu geleneksel yöntemler aynı zamanda hasta / katılımcı örneklerinin büyük hacimli gerektirir. çoklu bir bağışıklık 50 ul ya da daha az gerekebilir Örneğin, çoğu Elisa örneğin en az 100 ul gerektirir.

çoklu bir bağışıklık sınırlamaları primer yakalama ve ikinci algılama antikorlar, antijenler ve raportör optimal konsantrasyonlarını belirlemek için sıkı optimizasyon ihtiyacı bulunmaktadır. Belirli bir antijene karşı oluşan antikorlar, diğer organizmalardan antijenleri ile çapraz reaksiyona girecektir ve böylece yanlış pozitif okuma neden olabilir çapraz reaktivite bağışıklık önemli bir husustur. Optimizasyon, çapraz reaktivite ve spesifik olmayan bağlanma, daha önce 2-4 ele alınmıştır. Böyle bir deneyde başarısı belirgin Antibo yanı sıra yüksek oranda immünojenik antijenler elde yeteneği büyük ölçüde bağlıdırBoncuk bağlama ve birleştirme onayı adımda kullanmak için bu antijenlere karşı ölür. Başka bir sınırlama deneyleri doğrulamak için karakterize (tanısal pozitif ve negatif) örneklerinin sınırlı bulunmasıdır.

protokolü içinde kritik adımlar vardır. Bunlar: yabancı proteinlerin, azid, glisin, Tris ya da herhangi bir primer amin ihtiva etmeyen boncuklara bağlanmış olan antijenler sağlamaktır. bu maddelerin herhangi bir antijen hazırlanmasında varsa, diyaliz veya kromatografi ile çıkarılmalıdır. Biri 5 milyon boncuk başına antijen 5 ug ile başlar ve optimal konsantrasyonunu bulmak için titre tavsiye edilmektedir. En iyi hassasiyet ve dinamik aralık verir optimum algılama antikor konsantrasyonunu seçin. sinyaller antijen ve tespit antikor konsantrasyonları artış (kanca etkisi) olarak azalma eğilimindedir unutmayın. antijen konsantrasyonu artar sonra tespit Örneğin, sinyal düşmesi durumundaİyon antikoru sınırlayıcı olabilir. Bunun tersine, sinyaller raportör (SAPE) daha sonra algılama antikoru arttıkça azalırsa sınırlayıcı olabilir. Her proteinin (kuyu başına belirlenen her bir tanenin 5.000) için en uygun kaplin birleştirerek çapraz reaktivite için multipleks edin. Optimal algılama antikoru miktarı ile birleştirerek multipleks boncuk setleri test edin. muhabir optimize etmek ve tek tek her antijen test ederek antijenin bir standart eğri yapmak.

duyarlılığı geliştirmek ve medyan floresan sinyal artırmak için multipleks immunoassay Giderme önem taşımaktadır. hassasiyetini artırmak için, ya da boncuk veya algılama antikoru konsantrasyonuna bağlı antijen miktarını azaltır. yakalama ve / veya tespit edilmesi için daha yüksek bir afinite antikorun kullanımı da duyarlılığı iyileştirebilir. boncuklara bağlanmış antijen miktarının artırılması ortalama flüoresan sinyal arttırabilir. Bir çalışmada polyvinylal serum örnekleri ön kuluçka gösterdicohol artı polivinilpirolidon (PVX) tamponu gibi burada tarif edilmektedir olarak tane bazlı çoklu tahlil 30 kullanılarak serolojik deneylerde spesifik olmayan bağlanmayı önlemek edebilmektedir. Ancak, bizim işbirlikçileri tarafından başka bir çalışmada PBS-BSA ve PVX tamponlar arasında anlamlı bir etkisi bulunamadı. Onlar daha nedeniyle PVX tampon yüksek viskozite, bu mikroplak kuyuları 3 cihazında boncuk edinimi ve oluşan köpük ile ilgili sorunlar yarattığı sonucuna varmıştır.

Sonuç olarak, aynı zamanda, bir çok küçük bir numune hacmi çok sayıda patojenin insan tükürük antikorların varlığı ölçme yeteneğine sahip bir yöntem sunulmuştur. Gelecekte, bu testte yüzme ilgili maruziyet veya enfeksiyonlarla ilişkili tükürük antikorlarının varlığını tespit etmek ve risk değerlendirme modellerini bilgilendirmek yardımcı olmak için kullanılacaktır. Buna ek olarak, deney hava ve gıda kaynaklı exposur ile bağlantılı antikorlar ölçmek için kullanılabilires, olay enfeksiyonlar veya immunoconversions belirlemek ve anket tipi nüfus çalışmalar yürüten epidemiyologler kritik immünolojik bilgiler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Araştırma ve Geliştirme onun Ofisi aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilen ve burada açıklanan araştırma başardı. Bu Kurumun idari inceleme tabi ve yayın için onaylanmıştır. ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon kullanımı için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364, (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38, (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62, (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182, (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173, (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26, (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5, (5), e1046 (2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6, (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52, (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1, (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50, (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198, (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26, (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134, (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74, (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309, (1-2), 200-204 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats