El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati
Published 9/12/2016
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Immunology and Infection

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Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., et al. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).

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Abstract

La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.

Introduction

Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes.

La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 </ Sup>. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18.

Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.

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Protocol

Se obtuvo la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB # 08 a 1844, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.) para la recogida de muestras de saliva crevicular con hiperestimulación de los bañistas en la playa de Boquerón, Puerto Rico, como parte de los Estados Unidos Agencia de Protección ambiental (EPA) Epidemiológica Nacional y Evaluación ambiental del recreativas (neear) Estudio del agua 23 para evaluar las exposiciones y enfermedades asociadas natación. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento informado y fueron instruidos en el uso del dispositivo de recogida de saliva por la USEPA contratistas capacitados. Las muestras de saliva fueron enviadas en hielo y, a la recepción, se centrifugaron y se almacenaron a -80 ° C como se describe 4.

1. La activación del grano

  1. Volver a suspender las poblaciones conjunto de microesferas por agitación y sonicación durante 20 segundos y la transferencia de aproximadamente 5,0 x 10 6 de las cuentas de valores (400 l) a tubos de microcentrífuga.
    Nota: TLas cuentas se le suministra a una concentración de 12,5 x 10 6 perlas / ml.
  2. Sedimentar las cuentas de valores por centrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  3. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas sedimentadas en 100 l de agua destilada (dH2O) por vortex y sonicación durante 20 segundos. Repita el paso 1.2.
  4. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las perlas lavadas en 80 l de fosfato monobásico de sodio 100 mM, pH 6.2 por vortex y sonicación durante 20 seg.
  5. Inmediatamente antes de su uso, hacer una solución de 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mediante la adición de 200 l de dH2O de 10 mg de sulfo-NHS alícuota. Mezclar por vórtice.
  6. Añadir 10 l de la 50 mg / ml de Sulfo-NHS a las perlas. Mezclar por vórtice.
  7. Inmediatamente antes de su uso, hacer una 50 mg / ml de 1-etil-[3dimethylaminopropyl] carbodiimida solución (EDC) mediante la adición de 200 l de agua destilada (dH2O) a la alícuota de 10 mg de EDC. Mezclar por vórtice.
  8. Añadir 10 l de 50solución mg / ml EDC a las perlas. Mezclar por vórtice. Se incuban las perlas durante 20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad, con mezcla por vórtice a intervalos de 10 min. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  9. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 250 l de ácido 2- mM 50 [N morfolino] etanosulfónico (MES), pH 5,0 por vortex y sonicación durante 20 seg.
  10. Sedimentar las perlas activadas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  11. Repita los pasos 1.9 y 1.10.
    Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con MES 50 mM, pH 5,0.
  12. Resuspender las perlas en 100 l de MES 50 mM, pH 5.0 por vortex y sonicación durante 20 seg.

2. El acoplamiento del grano

  1. Pareja los antígenos a los conjuntos de microesferas utilizando las concentraciones mostradas en la Tabla 1.
  2. Añadir cada antígeno a las perlas activadas y llevar el volumen total a 500 l en MES 50 mM, pH 5,0. Mezclar los antígenos de unaperlas d por vórtice.
  3. Incubar los antígenos y los granos para las 2 horas con mezcla por rotación (~ 15 rpm) a temperatura ambiente en la oscuridad. Sedimentar las perlas acopladas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) -bovine albúmina de suero (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sodio al azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vortex y sonicación. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min y separar el sobrenadante.
    Precaución: La azida de sodio es un producto químico muy tóxico. Es fatal si se ingiere o entra en contacto con la piel. No respirar el polvo / el humo / el gas / la niebla / los vapores o el aerosol. Use equipo de protección personal adecuado (PPE) al manipular y desechar de acuerdo con las leyes apropiadas.
  5. Resuspender las perlas en 1 ml de PBS-TBN por vortex y sonicación durante 20 seg.
  6. Sedimentar las cuentas por microcentrifugación a 10.000 xg durante 2 min.
  7. Repita los pasos 2.5 y 2.6.
    Nota: Esto proporciona un total de dos lavados con PBS-TBN.
  8. Resuspender las perlas acopladas y se lavaron en 1 ml de PBS, 1% de BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Almacenar las perlas acopladas en un refrigerador C 2-8 ° en la oscuridad.

3. Contador del grano

  1. Preparar una dilución 1:10 de las perlas acopladas en agua o tampón PBS.
  2. Carga de 10 l de la dilución de la gota sobre un hemocitómetro en el punto de introducción de la muestra.
  3. Contar las perlas visto en uno de los 4 x 4 rejillas de esquina. Calcular el número total de perlas acoplaron usando la siguiente fórmula: Count (1 esquina de 4 x 4 grid) x (1 x 10 4) x (factor de dilución) x resuspensión volumen en ml.

4. Confirmación de antígeno de acoplamiento

  1. Resuspender la mezcla social de perlas acopladas a antígenos de interés por vortex y sonicación durante 20 seg.
  2. Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una finalconcentración de 100 cuentas / l de cada perla única establecido en tampón de PBS-1% de BSA (PBS-1% BSA, pH 7,4).
  3. Preparar al menos 7 dos veces diluciones en serie de IgG anti-especie de anticuerpo primario de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en placa de 96 pocillos de fondo redondo con tampón de PBS-1% BSA.
  4. Pre-humedecer una columna de 8 pocillos separada (8 filas) de una placa de fondo de filtro de 96 pocillos para cada antígeno prueba de confirmación de acoplamiento con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Añadir 50 l de mezcla de glóbulos de trabajo (perlas de antígenos acoplados a) a los pocillos pre-mojado.
  5. Añadir 50 l de diluciones de anticuerpos a las filas 1-7 de cada columna de la placa de filtro de 96 pocillos y 50 l de tampón BSA PBS-1% a la fila 8, en lugar de anticuerpo diluido para servir como pozos de fondo. Mezclar con una pipeta multicanal pipeteando arriba y abajo 5 veces. Realice el mismo procedimiento para cada conjunto de microesferas antígeno acoplado a confirmarse.
  6. Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambienteratura durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío.
  7. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repita 1x. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  8. Diluir con biotina anti-especie anticuerpo de detección secundario IgG específica de 16 g / ml en PBS-1% BSA.
  9. Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo pipeteando arriba y abajo 5 veces.
  10. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  11. Resuspender las perlas en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  12. Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
  13. Añadir 50 l de reportero a cada pocillo y mezclar pipeteando arriba y abajo 5 veces.
  14. dosobre la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  15. Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
    Nota: Los resultados del inmunoensayo multiplex basado en perlas se miden en la intensidad de fluorescencia media (MFI). Consulte siempre a la última versión del manual de software, si está disponible para evitar errores.

5. salival Multiplex Inmunoensayo

  1. Retire la saliva del congelador a -80ºC y permitir que se descongele a temperatura ambiente.
  2. Resuspender el antígeno acoplado stocks de talón por vortex y sonicación durante 20 seg.
  3. Preparar una mezcla de glóbulos de trabajo mediante la dilución de las poblaciones de perlas acopladas a una concentración final de 100 granos / l de cada conjunto de microesferas único en PBS-BSA 1% de tampón.
  4. Preparar una dilución 1: 4 de saliva wITH tampón PBS-BSA al 1% en un 96 pocillos, placa de pozo profundo.
  5. placa de filtro pre-mojado con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío.
  6. Añadir 50 l de una mezcla de glóbulos de trabajo y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de las placas de filtro de 96 pocillos para un 1: dilución final 8. Mezclar reacciones con una pipeta multicanal. Para el control del pozo, se añaden 50 perlas de antígenos acoplados a más 50 l l de PBS-1% de BSA (tampón como un sustituto de la saliva).
  7. Tapar y dejar incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  8. perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  9. Diluir anti-humano IgG anticuerpo de detección secundario de cabra biotinilado a 16 g / ml en PBS-1% BSA.
  10. Añadir 50 l de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo y mezclar el contenido conuna pipeta multicanal.
  11. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  12. perlas de resuspender en 50 l de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
  13. Diluir reportero estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 g / ml en PBS-1% BSA.
  14. Añadir reportero 50 l a cada pocillo y mezclar con una pipeta multicanal.
  15. Cubrir la placa de filtro y dejar que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Aspirar el sobrenadante por vacío. Lavar los pocillos con 100 l de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante por vacío. Repetir el lavado 1x.
  16. Volver a suspender las perlas en 100 l de PBS-BSA al 1% y 50 l analizan utilizando el analizador 29.
    Nota: Los resultados del inmunoensayo múltiplex se miden en unidades de mediana intensidad de fluorescencia (IMF). Siempre consultela última versión del manual de software, si está disponible, para evitar errores.

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Representative Results

Un conjunto de microesferas único se utilizó como control para medir la unión no específica y una muestra a la variabilidad. Estas perlas se trataron de forma idéntica a las perlas de antígeno junto con la excepción de que no se incubaron con cualquier antígeno en la etapa de acoplamiento. valores de MFI> 500 obtenidos a partir de las bolas de control incubadas con todas las muestras de saliva fueron retirados de los nuevos análisis debido a la sospecha de una contaminación a partir de suero y las respuestas restantes se distribuyen log. La saliva puede estar contaminada con suero si las encías se frotan demasiado vigorosamente con la esponja unida al dispositivo de recogida o si el participante en el estudio tiene la enfermedad periodontal. El registro de datos de las IFM transformado se utilizaron para calcular un punto de corte de 505 immunopositive MFI basado en la media más 3 desviaciones estándar de los valores de MFI de registro. Además, se añadieron perlas de antígeno acoplado a pozos específicos que fueron tratados como pozos de prueba de todas las maneras, excepto dilsaliva buido se reemplazó con PBS-1% BSA para evaluar la fluorescencia de fondo y reactividad cruzada. Los valores de MFI obtenidos en estos pozos de fondo se restaron de los valores de MFI de cada conjunto de microesferas de antígenos acoplados para cada muestra de saliva.

acoplamiento del grano se confirmó utilizando especies específicas de origen animal anticuerpos de detección primaria específicos para cada antígeno. Para asegurarse de que las perlas de antígeno acoplado eran capaces de acercarse a la gama dinámica del ensayo, se definió de acoplamiento adecuado como una IMF ≥18,000, la observación de respuesta a la dosis y la reactividad cruzada entre los anticuerpos primarios y no objetivo de <10% como se describe 2 . Confirmaciones de acoplamiento representativos de C. jejuni y T. gondii de los antígenos en el ensayo se muestran en la Figura 1.

Basado en el punto de corte establecido (505 IFM), la tasa de immunoprevalences para las muestras (n = 2078) estaba comprendida entre aproximadamente 2% (n = 41) para T. gondii a casi el 50% (n = 1.009) para GI.1 norovirus (Figura 2). Los datos indican que la tasa de immunoprevalence fue más alto de los norovirus seguido por virus de hepatitis A y H. pylori.

Mientras que 32% (n = 672) de las muestras fueron immunonegative para todos los patógenos en el ensayo, 68% (n = 1.406) fueron immunopositive a uno o más patógenos. Figura 3 muestra el desglose de immunopositivity a una o más de las patógenos.

Figura 1
Análisis de acoplamiento de confirmación para dos de los organismos en el inmunoensayo multiplex confirmación de acoplamiento se realizó para todos los antígenos y los gráficos para C.: la Figura 1. jejuni y T. gondii en esta figura se repretante de las confirmaciones de acoplamiento para los antígenos en el inmunoensayo múltiplex. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Immunoprevalence a patógenos específicos Immunoprevalence a patógenos específicos en el inmunoensayo multiplex osciló desde aproximadamente 2% para T. gondii a casi el 50% de GI.1 norovirus. Los anticuerpos contra los antígenos de norovirus fueron más comúnmente observados seguidos por el VHA (virus de hepatitis A) y H. pylori. T. gondii y C. anticuerpos jejuni aparecieron con menor frecuencia en las muestras de saliva analizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de THes figura.

figura 3
Figura 3:. Desglose de immunopositivity a múltiples patógenos simultáneamente El inmunoensayo multiplex permite el análisis de immunopositivity a múltiples patógenos de forma simultánea en un volumen de muestra 50 l. Casi un tercio de las muestras de saliva analizadas fue immunonegative de anticuerpos contra todos los antígenos en el múltiplex. Aproximadamente el 31% de las muestras fue immunopositive para un antígeno, mientras que un cuarto fue positiva para dos antígenos. 9,4% era immunopositive a tres antígenos. 3% fue positivo a cuatro o más antígenos simultáneamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Antígeno Bead Set tampón de acoplamiento Concentración Ag (g) # 1 de los granos en la esquina # De cuentas / l Vol. para 100 B / uL para 4 ml (l)
C. jejuni 8 MES 5.0 50 64 6.400 94
H. pylori 33 MES 5.0 25 71 7.100 85
Hepatitis A 42 MES 5.0 100 91 9,100 66
T. gondii 30 MES 5.0 25 85 8.500 71
norovirus GII.4 55 MES 5.0 5 72 7.200 83
norovirus GI.1 67 MES 5.0 5 63 6.300 95
desacoplado 80 MES 5.0 60 6.000 100
Volumen total de los granos (l) 594
Volumen total de tampón necesario (l) 3,406

Tabla 1:. Trabajando mezcla de microesferas para el inmunoensayo multiplex Después se completaron de acoplamiento y la confirmación, una mezcla maestra que consiste en cada conjunto de microesferas se preparó como se muestra. La mezcla maestra se distribuyó entre unall de los pozos de la placa de 96 pocillos. Todos los pocillos se incubaron con la saliva con la excepción de un pocillo de control de fondo que contenía sólo los granos y PBS-1% de tampón BSA.

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Discussion

Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o múltiples agentes patógenos. Este poder de discriminación puede ser útil en estudios de población para investigar los riesgos para la salud asociados con la exposición a agentes patógenos ambientales y otros.

Hay varios otros métodos que pueden utilizarse para determinar un punto de corte en función de la distribución de la IMF, los controles no acoplados y lo que pregunta el estudio está diseñado para responder. Algunos ejemplos para la determinación de puntos de corte incluyen el modelado mixta finita 24-26, significan más 3desviaciones estándar de las respuestas a los controles, media más 2 desviaciones estándar de las respuestas a los controles, y tres veces la media de las respuestas a los controles 27,28. Para pruebas de detección simples, criterios menos estrictos pueden ser usados, pero para los estudios epidemiológicos, que puede ser más apropiado emplear una definición más rigurosa de reducción de la probabilidad de presentación de informes falsos positivos. Nuestra solicitud inicial es mirar immunoconversion y immunoprevalence entre nadadores y no nadadores. En este estudio, las IMF de control acoplados no se distribuyen normalmente y los resultados fueron transformados log.

Las ventajas de la realización de un inmunoensayo basado en perlas multiplex incluyen el uso de volúmenes de muestra muy bajos, la reducción en el tiempo y la mano de obra y la capacidad para medir las respuestas de hasta 500 analitos simultáneamente mientras que requiere una cantidad mínima de reactivos. Por el contrario, los métodos tradicionales de la evaluación de los niveles de anticuerpos indicativos de la exposición y / o infección (por ejemplo, ELISA requieren al menos 100 l de muestra, mientras que un inmunoensayo multiplex puede requerir 50 l o menos.

Limitaciones de un inmunoensayo múltiplex incluyen la necesidad de optimización rigurosa para determinar las concentraciones óptimas de captura de primaria y secundaria de detección de anticuerpos, antígenos y reportero. La reactividad cruzada es también una preocupación importante en inmunoensayos como anticuerpos contra un antígeno particular, pueden reaccionar de forma cruzada con antígenos de otros organismos y con ello dar lugar a falsos positivos. Optimización, la reactividad cruzada y la unión no específica se trataron previamente 2-4. El éxito de tal ensayo depende en gran medida de la capacidad de obtener antígenos altamente inmunogénicos, así como Antibo específicamuere a estos antígenos para uso en las etapas de acoplamiento del talón y de confirmación de acoplamiento. Otra limitación es la disponibilidad limitada de muestras caracterizado (diagnóstico positivo y negativo) para validar los ensayos.

Hay una serie de pasos críticos en el protocolo. Estos incluyen: asegurar los antígenos que se acoplan a las perlas no contienen proteínas extrañas, azida, glicina, Tris o cualquier aminas primarias. Si cualquiera de estos agentes existen en la preparación de antígeno, que deben eliminarse por diálisis o cromatografía. Se recomienda que se debe comenzar con 5 g de antígeno por cada 5 millones de cuentas y se valora para encontrar la concentración óptima. Elija la concentración de anticuerpo de detección óptima que proporciona la mejor sensibilidad y el rango dinámico. Tenga en cuenta que las señales tienden a disminuir a medida que aumentan las concentraciones de anticuerpos de antígenos y detección (efecto gancho). Por ejemplo, si la señal disminuye a medida antígeno concentración aumenta entonces detectananticuerpo de iones puede ser limitante. Por el contrario, si las señales disminuyen a medida que aumenta la detección de anticuerpos a continuación reportero (SAPE) puede ser limitante. Compruebe el multiplex para la reactividad cruzada mediante la combinación del acoplamiento óptimo para cada proteína (5.000 de cada perla establecido por pocillo). Probar los juegos de microesferas multiplexadas mediante la combinación con la cantidad de anticuerpo de detección óptima. Optimizar el reportero y hacer una curva estándar del antígeno mediante ensayo de cada antígeno individual.

Solución de problemas de inmunoensayo multiplexado para mejorar la sensibilidad y aumentar la señal fluorescente mediana son de importancia crítica. Para mejorar la sensibilidad, o bien disminuir la cantidad de antígeno unido a las perlas o la concentración de anticuerpo de detección. El uso de un anticuerpo de afinidad superior para la captura y / o detección también puede mejorar la sensibilidad. El aumento de la cantidad de antígeno unido a las perlas puede aumentar la señal fluorescente mediana. Un estudio demostró que la pre-incubación de las muestras de suero con polyvinylalcohol más tampón polivinilpirrolidona (PVX) es capaz de suprimir la unión no específica en ensayos serológicos utilizando el ensayo multiplex basado en perlas 30 tal como la que estamos describiendo aquí. Sin embargo, otro estudio realizado por nuestros colaboradores no encontró un efecto significativo entre PBS-BSA y PVX tampones. Llegaron a la conclusión, además, que debido a la mayor viscosidad de la memoria intermedia de PVX, creó problemas con la adquisición del talón en el analizador y la espuma formada en los pocillos de la microplaca 3.

En conclusión, hemos presentado un método que es capaz de medir la presencia de anticuerpos IgG salivales humanas a múltiples patógenos de forma simultánea en un volumen muy pequeño de muestra. En el futuro, este ensayo se puede utilizar para detectar la presencia de anticuerpos salivales asociados con las exposiciones o infecciones relacionadas con la natación y para ayudar a informar modelos de evaluación de riesgo. Además, el ensayo se puede usar para medir los anticuerpos asociados con Exposur aire y transmitidas por los alimentoses, determinar infecciones incidente o immunoconversions y proporcionar información inmunológica fundamental para la realización de estudios epidemiológicos poblacionales de tipo cuestionario.

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Disclosures

La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos a través de su Oficina de Investigación y Desarrollo de financiar y gestionar la investigación descrita aquí. Ha sido sometido a revisión administrativa del Organismo y aprobado para su publicación. La mención de nombres comerciales o productos comerciales no constituye una aprobación o recomendación para su uso.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Software
Microcentrifuge Thermo Electron Corporation 75002446 Used to centrifuge samples
Vortex Mixer VWR G560 Used to mix samples
Sonicator (mini) Fisher Scientific 15-337-22 Used to separate beads
Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. Capp Various
Hemacytometer (Bright Line) Housser Scientific  3200 Used to count coupled beads
Multiscreen Vacuum Manifold Millipore MSVMHTS00 Used in washing steps to remove supernatant
MicroShaker VWR 12620-926 Used to agitate beads during incubations
Tube rack (1.5 ml and 0.5 ml) (assorted) VWR 30128-346
Weighing Scale Mettler or other Used to measure wash reagents for making buffers
Dynabead Sample Mixer Invitrogen 947-01 Used during coupling incubation step
MatLab (R2014b) The MathWorks, Inc. Used to analyze antibody response data
Microsoft Excel 2014 Microsoft Corporation Used to analyze antibody response data
Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software Luminex Corporation LX200-XPON3.1 Instrument and software used to run assay
Antigens
GI.1 Norwalk Virus: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
GII.4 Norovirus VA387: p-particle Xi Jiang (CCHMC)* NA *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg.
Hepatitis A Virus: grade II concentrate from cell culture Meridian Life Sciences 8505 Antigen coupled at 100 µg
Helicobacter pylori: lysate Meridian Life Sciences R14101 Antigen coupled at 25 µg
Toxoplasma gondii: recombinant p30 (SAG1) Meridian Life Sciences R18426 Antigen coupled at 25 µg
Campylobacter jejuni: heat killed whole cells KPL 50-92-93 Antigen coupled at 50 µg
Primary Antibodies
Guinea pig anti-Norovirus (CCHMC)* NA Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
Mouse anti-Hepatitis A IgG Meridian Life Sciences C65885M Used for coupling confirmation
BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori KPL 01-93-94 Used for coupling confirmation
Goat pAb to Toxoplasma gondii Abcam Ab23507 Used for coupling confirmation
BacTrace Goat anti-Campylobacter species KPL 01-92-93 Used for coupling confirmation
Secondary  Antibodies
Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson 705-065-149 Used for coupling confirmation
Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) KPL 16-13-06 Used for coupling confirmation
Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) KPL 16-18-06 Used for coupling confirmation
Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG (H+L) KPL 176-1506 Used for coupling confirmation
Consumables
1.5 ml copolymer microcentrifuge tubes USA Scientific 1415-2500 Used as low binding microcentrifuge tubes
10 µl pipette tip refills BioVentures 5030050C
200 µl pipette tip refills BioVentures 5030080C
1,000 µl pipette tip refills BioVentures 5130140C
Aluminum foil Various Vendors Used keep beads in the dark during incubations
Deep Well plates VWR 40002-009 Used for diluting saliva samples
Multiscreen Filter Plates Millipore MABVN1250 Used to run assays
Oracol saliva collection system Malvern Medical Developments Limited Used for saliva collection
Reagents
Carboxylated microspheres (beads) Luminex Corporation Dependent on bead set Antigens are coupled to the microspheres
EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) Pierce 77149 or 22980 Used in bead activation
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Pierce 24510 Used in bead activation
Steptavidin-R-phycoerythrin (1 mg/ml) Molecular Probes S-866 Used as reporter
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 Used for coupling
Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) Sigma P-9416 Used in wash buffer to remove non-specific binding
Protein Buffers
PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, pH 7.4 Sigma P-3813 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSA Sigma A-7888 0.1% (w/v)
Tween-20 Sigma P-9416 0.2% (v/v)
Sodium Azide (0.05% azide)** Sigma S-8032 **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws.
MES/Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0)
MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Sigma S-3139
5 N NaOH Fisher SS256-500
Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4)  Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 1% BSA, pH 7.4 Sigma P-3688 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA
Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) Filter Sterilize and store at 4 °C
NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) Sigma S-3139 0.1 M NaH2PO4
5 N NaOH Fisher SS256-500
Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) Filter Sterilize and store at 4 °C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 Sigma P-3563 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN

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References

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