Name: Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer de labelvrije vangst en thermoresponsieve vrijlating van levensvatbare circulerende tumorcellen uit bloed met PIPAAm-gecoate microfilters. Deze methode ondersteunt downstream-kweek en analyses voor kankermetastase-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken alle patiënten die bloedmonsters hebben gedoneerd ter ondersteuning van dit werk. We bedanken Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli en Marc E. Lippman voor hun hulp bij het verkrijgen van klinische monsters, en Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez voor hun inzichten tijdens discussies. Zheng Ao bedankt de gedeeltelijke ondersteuning en assistentie van het Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.

Ethiek Verklaring: Om de rechten van proefpersonen te beschermen, werden bloedmonsters verkregen na een geïnformeerde toestemming in het kader van protocollen door de Universiteit van Miami institutionele review boards onder IRB 20150020 goedgekeurd. LET OP: het bloed worden gefilterd voor CTC capture moet worden verzameld in een EDTA buis om stolling te voorkomen. 1. Coating de Microfilter met Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) <ol><li> Weeg PIPAAm een ​​10% w / v oplossing in butanol bereiden. Mengen met een vortex totdat de oplossing helder is. </li><li> Cut plastic microscoop dia&#39;s in ongeveer 12 mm x 12 mm vierkantjes, ofwel met een schaar of een scherp mes. U kunt ook gebruik maken van een guillotine. LET OP: Deze vakjes zullen dienen als een houder voor de filters tijdens de spin coating proces. </li><li> Met behulp van een scherpe paar van de straight edge schaar, knip de sleuf porie microfilter wafer in 8 mm x 8 mm pleinen. </li><li> Met behulp van een polyimide film tape zet de cut filters op het plastic squares eerder gesneden in stap 1.3. Breng de film alleen de rand en de hoek van het filter zodat ten minste 7 mm x 7 mm filteroppervlak is un-waarop de tape. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> Figuur 2:. Vertegenwoordiger Illustratie van de Microfilter Set-up voor PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm microfilter is gepositioneerd op de 12 mm x 12 mm plastic vierkant gesneden uit een plastic microscoopglaasje. Polyimide tape wordt gebruikt om de microfilter veilig op zijn plaats te draaien vacht van de PIPAAm.Reproduced met toestemming van referentie 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="5"><li> Plaats de microfilter, dat is bevestigd op de plastic plein, op de vacuum klauwplaat van de spin-coater. </li><li> Programmeer de spin-coater het volgende recept: Start, 500 rpm gedurende 10 seconden, 6000 rpm voor 60 sec, 500 rpm gedurende 10 seconden, Stop. </li><li> Verdeel genoeg 10% w / v PIPAAm oplossing (bereid in 1,1) naar het microfilter oppervlak volledig te bedekken met een standaard plastic overdracht pipet en start de spin coater. </li><li> Verwijder de PIPAAm gecoat microfilter van de spin-coater na het coatingproces voltooid. Laat het filter tijdens de opslag aan de plastic plein. OPMERKING: De beklede filter kan worden bewaard bij kamertemperatuur maximaal 3 maanden. </li></ol> 2. Montage van Filtration Cassette met PIPAAm Coated Microfilter <ol><li> Rehydrateren PIPAAm gecoat microfilter bij kamertemperatuur door het plaatsen van het microfilter nog bevestigd aan de plastic vierkant in een petrischaal. Voeg 1x PBS totdat de microfilter volledig onder water en laat gedurende 5 minuten. </li><li> Na de hydrateringsstap, laat het filter uit de plastic plein door het snijden van de polyimide film tape met een paar schaar. LET OP: Let op welke kant van het filterde PIPAAm coating. </li><li> Monteer het microfilter in de filtratie cassette, door daartussen het microfilter tussen de bovenste en onderste acrylstuk samen met de 2 polydimethylsiloxaan (PDMS) stukken als pakking / afdichting. Klem de acryl cassette met clips om de filter veilig te stellen en zorgen voor een goede afdichting. OPMERKING: De PIPAAm coating moet naar boven gericht, zodat het monster wordt door, zullen de cellen worden gevangen op PIPAAm beklede oppervlak van het filter (figuur 1). </li></ol> 3. Filtratie van bloedmonster met Capture and Release van CTC uit de Microfilter <ol><li> Aangezien elke injectiepomp merk heeft zijn eigen user interface, raadpleegt u de handleiding van de pomp en het programma van de injectiepomp te stromen met een snelheid van 75 ml / uur en stel het volume op 20 ml. </li><li> Warme 3 ml McCoy&#39;s (in de handel verkrijgbaar) celkweekmedia (bereid door toevoegen van 10% foetaal runderserum en 1% penicilline en streptomycine) tot 37 ° C. <br /&gt;. OPMERKING: De media keuze zal worden gebaseerd op de patiënt kanker type of anders als dit is een modelsysteem experiment waarbij gekweekte cellen worden verrijkt in een gezonde donor bloed, gebruik maken van de media de cellen zijn normaal gesproken gekweekt in Als je onzeker bent, raadpleeg te kweken gids / methode die door het bedrijf de cellen werden gekocht bij. </li><li> Voeg 7,5 ml van commercieel beschikbare Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) aan de 7,5 ml bloedmonster en aspireren deze verdunde bloed in een 25 ml spuit. Opmerking: Het volume van HBSS zodat het bloedmonster wordt verdund met een gelijk volume van 1: 1 met HBSS Als bijvoorbeeld 10 ml bloed wordt gebruikt, meng met een gelijk volume van 10 ml HBSS tot 1 bereiken. 1 verdunning. </li><li> Schakel de filtratie cassette met de spuit en plaats deze op de injectiepomp. Plaats een 50 ml buis bij onder naar stroom door verzamelen en start de pomp. LET OP: De filtratie moet ongeveer 10- 12 min te nemen. Alle filtratie stappen worden uitgevoerduit bij normale kamertemperatuur (20-25 ° C), met inbegrip van stap 3.8 </li><li> Na filtratie is voltooid, schakel de filtratie cassette nemen nota welke kant is de top dat de cellen gevangen op de PIPAAm-gecoate oppervlak heeft. Aspiraat 1 ml warm kweekmedium in een nieuwe spuit. </li><li> Re Schakel de filtratie cassette met de spuit met de media, maar op dit moment grijpen de onderkant van de cassette, zodat de PIPAAm beklede oppervlak van het filter is afgekeerd van de spuit. LET OP: Deze zal zijn om alle cellen die in de gleuf poriën kunnen worden ingebed door het toepassen van zachte reverse flow vrij te geven. </li><li> Plaats de spuit terug op de spuitpomp en houdt een petrischaaltje of 6-wells plaat direct onder de filtratie cassette. Stel het debiet tot 100 ml / uur en start de pomp. </li><li> Langs alle media door het filter en laat het doorstroomkanaal in de petrischaal. Wacht tot alle media door middel van te passeren en dan stoppen de pomp en verwijder de spuit eennd filtratie cassette van de pomp. </li><li> Maak de filtratie cassette uit de spuit en open aan het filter uit de cassette halen. Plaats het filter met de PIPAAm naar beneden gericht in dezelfde petrischaal gebruikt om de terugstroom verzamelen wanneer het loslaten van de cellen van de poriën. Voeg de rest van het warme medium en zet de petrischaal in een incubator ingesteld op 37 ° C. </li><li> Na 30 min worden alle cellen worden vrijgemaakt uit de filter. Echter, laat filter in de petrischaal gedurende maximaal 24 uur te zorgen dat alle cellen los. Opmerking: Als alternatief kan de afgegeven cellen worden verzameld in een microcentrifugebuis om verder stroomafwaarts analyses uit te voeren zoals PCR, ELISA, Western Blot om enkele voorbeelden te noemen. </li><li> Na 24 uur in de cultuur, verwijder voorzichtig de microfilter behulp van een tang. OPMERKING: De filter kan worden weggegooid op dit moment als de cellen is bekend uit het. </li><li> Voorzichtig pipet het kweekmedium op en neer met behulp van een 1000 &amp; #181; l pipet, om opnieuw te schorten de erytrocyten en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) die worden betrapt op het filter en vrijgelaten in de plaat met de CTC. Voer deze actie zorgvuldig en voorzichtig om te voorkomen dat het losmaken van de losjes verbonden kankercellen. Verwijder voorzichtig het complete medium dat het geresuspendeerde erytrocyten en PBMC terwijl achter de bijgevoegde-kankercellen en vervanging door vers medium voorverwarmd tot 37 ° C. OPMERKING: Deze stap kan één keer worden herhaald als overmatig erytrocyten aanwezig is na een wasbeurt zijn. </li></ol> 4. CTC levensvatbaarheid Evaluatie <ol><li> Evalueer gekweekt CTC levensvatbaarheid met behulp van een Live / Dead Assay 8. OPMERKING: Tal Levend / dood assays zijn in de handel verkrijgbaar. Naar aanleiding van het protocol van de fabrikant wordt aangeraden. Raadpleeg de lijst met materialen / reagentia voor de commerciële testkit gebruikt voor dit experiment. </li></ol>

<ol><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer%3A+SWOG+S0500%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li>
<li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li>
<li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179(2013).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li>
<li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li>
<li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li>
<li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+pathology%22%5BJournal%5D)">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li>
<li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li>
<li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture%2C+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PHT%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li>
<li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+%28CTCs%29+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li>
<li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li>
<li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li>
<li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+polymeric+surfaces%3B+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Makromol.+Chemie%2C+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li>
<li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li>
<li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer%3A+a+retrospective+study+in+107+patients%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403(2015).</li>
</ol>

Een deel van dit werk is beschermd onder U.S. Voorlopige Octrooiaanvraag Nr. 62/219,808. Siddarth Rawal is aandeelhouder van Circulogix Inc. dat commercieel de filters en filtercassettes/cartridges produceert die in dit Artikel worden gebruikt.

Het proces van het vastleggen van levensvatbare CTC uit volbloed en het vrijgeven van hen uit de microfilter is betrekkelijk eenvoudig; Maar een paar kritische punten zijn het vermelden waard. Het is absoluut noodzakelijk, net als bij alle celcultuur die steriele toestand wordt gehandhaafd door het hele proces. De eerste stap van het bekleden van het filter met PIPAAm kritisch, als basis voor de techniek van het vrijgeven van de cellen van het filter is gebaseerd op het gebruikmaken PIPAAm de temperatuurgevoelige grensv...

Metastatische ziekte is verantwoordelijk voor de meeste sterfgevallen door kanker. Het ontwikkelen van prognostische en companion diagnostics biomarker voor metastase is van cruciaal belang bij kanker beheer en de behandeling. Circulerende tumorcellen (CTC) spelen een centrale rol in de tumor verspreiding en metastase. Bovendien bereikt u met gemak als een &#39;vloeibare biopsie&#39; biomarker, CTC bij patiënten met kanker &#39;is het perifere bloed is gestegen als een&#39; broeinest &#39;voor kanker biomarker onderzoek. CTC zijn goed gevalideerd als een prognostische biomarker in diverse kanker instellingen, waaronder borst-, prostaat- en darmkanker 1-3. Echter, recente ontwikkelingen in CTC gebied heeft aangegeven dat de loutere opsomming van deze zeldzame cellen heeft beperkte klinische bruikbaarheid, zie interventionele klinische studies 4. Er is dus een groeiende behoefte aan technologieën voor de moleculaire en functionele karakterisatie van CTC. Op dit moment, slechts enkele technologieën bestaan ​​die het mogelijk maken for niet-antigen bevooroordeeld, levensvatbare vangst en het vrijkomen van CTC, waardoor robuust downstream moleculaire en functionele analyse 5,6. De meerderheid van deze microgefabriceerde inrichtingen zijn gekoppeld microfluïdische platforms en dus een beperkende factor in de hoeveelheid bloed die kunnen worden verwerkt, die varieert 2-4 ml 7-10. CTC zijn zeldzame gebeurtenissen in één buis bloedafname (7,5 ml), zodat de hoeveelheid bloed die kan worden verwerkt teneinde, aanzienlijk belemmert de kans op het vastleggen en het isoleren van deze cellen plaats. We hebben twee soorten Parylene C membraanmicrofilter apparaten ontwikkeld voor de vangst van CTC die de grootte verschillen tussen grotere tumorcellen en de kleinere normale bloedcellen 11,12 exploiteren. We hebben eerder gemeld op de ronde porie opsomming filter en vergeleken met een door de FDA goedgekeurde platform, waar de microfilter bleek superieur in CTC afvangrendement te zijnvoor kanker bloed monsters van patiënten 13,14. Echter, een beperking van de ronde filter is de noodzaak om een ​​fixeermiddel formaldehyde gebaseerde voorgebruik filtratie. Deze werkwijze behoudt de cellen morfologie terwijl ze de schuifspanning en druk te weerstaan ​​tijdens het filtratieproces. Terwijl opsomming en moleculaire studies kunnen worden uitgevoerd on-chip 13, het fixeermiddel verslechtert het vermogen om functionele karakterisatie voeren. Om deze beperking te pakken hebben we een sleuf porie filter dat de noodzaak om cellen vóór filtratie (figuur 1) vast ontkent. De sleuf porievorm (6 um breed x 40 urn lengte sleuf poriën) maakt de tumorcellen achtereen maken door een porie gedeeltelijk occluderen en dus mogelijk blijft vrije doorgang van andere bloedcellen en verlichten de drukstijging die zou leiden tot celbeschadiging en eventuele barsten 15,16 De sleuf poriën patroon bestaat uit 2 delen die acryl sandwichde sleuf porie filter tussen de bovenste en onderste stuk met Polydimethylsiloxane (PDMS) fungeren als een pakking om een lekvrije afdichting 14,15 (figuur 1) te verstrekken. Terwijl de afvangrendement van de sleuf porie filter hoog (Tabel 1), de vastgelegde CTC zijn gebonden aan de Parylene C membraan door sterke niet-specifieke elektrostatische interacties plaats van extracellulaire matrix (ECM) gemedieerde adhesie 15. Werkwijzen zoals tegenstroom of het gebruik van cel schrapers niet aan de cellen daadwerkelijk los van het filter, of kunnen leiden tot celbeschadiging en celdood. We verkend een onconventionele gebruik van PIPAAm een versie strategie 15 te formuleren. PIPAAm is een polymeer dat een reversibele lagere kritische oplostemperatuur (LCST) faseovergang bij een oplossingstemperatuur van 32 ° C 17 ondergaat. Traditioneel is deze eigenschap van PIPAAm is op grote schaal onderzocht voor tissue engineering-toepassingen. Gewoonlijk cellengekweekt op PIPAAm gecoate oppervlakken bij 37 ° C wanneer PIPAAm hydrofoob. De cellen kunnen vervolgens worden losgemaakt als opgenomen wanneer de kweektemperatuur beneden 32 ° C, waarbij de PIPAAm beklede oppervlak wordt gehydrateerd 17,18 verschoven is. We benut deze thermische eigenschappen door het uitvoeren van het filtratieproces bij kamertemperatuur (beneden 32 ° C) en daarna inschakelen cel afgifte door het plaatsen van het filter in kweekmedium bij 37 ° C. Bij deze temperatuur de PIPAAm polymeerlaag wordt hydrofoob, waardoor het elektrostatisch gebonden cellen 15 (Figuur 1) los. Hoewel de temperatuurgevoelige werkwijze evenals andere werkwijzen met succes zijn uitgevoerd om levensvatbare CTC vangen bereiken kort 19-21, een sleutel mogelijk nadeel gedeeld door deze technologieën gemeld is dat ze allemaal een antigeen-afhankelijke beginsel CTC capture gebruiken. Antigeenbasis CTC vast te leggen, zoals previously, kan leiden tot vertekende CTC analyse 11,14. Bijvoorbeeld, veel technologieën affiniteit gebaseerde dienst antilichaam dat EpCAM bindt voor CTC vast te leggen. Echter CTC aangetoond dat verschillende niveaus van EpCAM tot expressie, waardoor weglaten van lage EpCAM en EpCAM negatieve CTC deze technologieën. Ook kunnen beperkingen optreden wanneer CTC van niet-epitheliale oorsprong is van belang, zoals CTC bij melanomen en sarcomen instellingen. Zo, een technologie die het mogelijk maakt voor levensvatbare CTC vast te leggen en het vrijkomen zonder mogelijke vertekening geïntroduceerd door antigen gebaseerde vastlegging is zeer wenselijk. Belangrijker is het microfilter vastlegapparaat zuiver afmeting alsmede het vrijgavestrategie agnostische is de aanwezigheid van bepaalde oppervlaktemerkers. Wij zijn van mening dat de arbeidsovereenkomst van de PIPAAm gecoat microfilter zal bijdragen aan ons begrip van de metastatische proces uit te breiden, door middel van het verstrekken van de mogelijkheid om effectief en efficiënt te vangen en laat CTC voor downstream analyses. Dit kan potenteially bloot nieuwe moleculen waarvoor nieuwe gerichte systemische therapieën kunnen ook van gericht en verstrekt een biomarker die gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd en steun behandeling van kankerpatiënten.

<table><tbody><tr><td>Slot Filter</td><td>Circulogix Inc.</td><td>MSF-01</td><td>Filters van verschillende grootte beschikbaar voor filtratie voor CTC uit bloed of urine (www.circulogixinc.com)</td></tr><tr><td>poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)&nbsp;</td><td>Ploysciences Inc.</td><td>21458</td><td>Niet gevaarlijk. Bewaren op kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7906</td><td>Gebruiken in een goed geventileerde ruimte</td></tr><tr><td>Plastic Microscoopglazen</td><td>Cole-Parmer</td><td>48510-30</td><td>Elke plastic plaatjes of alternatief elke soort vierkant (Metaal, Acryl, enz.) kan worden gebruikt als het de 8mmx8mm filter vierkant kan vasthouden</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>SCS G3 Spin Coater</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Polyimide Tape</td><td>Uline</td><td>S-7595</td><td>Polyimide is de generieke naam voor Kapton Tape die kan worden gekocht bij meerdere leveranciers (Amazon, Kaptontape.com)</td></tr><tr><td>HBSS- Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri schotels 35 x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Microfilter Cassette</td><td>Circulogix Inc.</td><td>FC-01</td><td>Aangepaste cartridges zijn beschikbaar op basis van filtratie voor CTC uit bloed of urine&nbsp;</td></tr><tr><td>Spuit 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>KD scientific&nbsp;</td><td>78-0100V</td><td>Elke spuitpomp die in staat is om een 25 ml spuit vast te houden kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml Centrifuge buis</td><td>VWR</td><td>82050-322</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio One 6 wel plaat</td><td>VWR</td><td>89131-688</td><td>Elk merk kan worden gebruikt, zolang de oppervlakte compatibel is voor celadhesie en niet afstotend is</td></tr><tr><td>SKBR3 Cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>Live Dead Assay</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>Elke test die een redelijke analyse kan bieden om levende cellen te evalueren, zal werken</td></tr><tr><td>Cel Cultuur Incubator</td><td>VWR</td><td>98000-368</td><td>Elke incubator die kan worden gebruikt voor celcultuur is voldoende</td></tr></tbody></table>

capture and release van levensvatbare circulerende tumorcellen van blood

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

We tonen een werkwijze voor de grootte gebaseerde vastlegging van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) van volbloed, samen met de introductie van deze cellen uit chip voor downstream analyse en / of cultuur. De strategie maakt gebruik van het gebruik van een nieuw slot Parylene C membraan porie microfilter CTC en een bekleding van poly (N-propylacrylamide -ISO) (PIPAAm) voor thermoresponsieve levensvatbare afgifte van de gevangen CTC vangen. De vangst van levende cellen wordt mogelijk gemaakt door gebruik te maken van het ontwerp van een sleuf porie geometrie met specifieke afmetingen voor de schuifspanning doorgaans geassocieerd met het filtratieproces verminderen. Terwijl het microfilter vertoont een hoge vangstrendement, het vrijkomen van deze cellen is niet triviaal. Meestal slechts een klein percentage cellen vrijkomen bij technieken zoals reverse flow of cel schrapen gebruikt. De sterke hechting van deze epitheliale kankercellen aan de Parylene C membraan is toe te schrijven aan niet-specifieke elektrostatische interactie. Om th tegen te gaanis effect, gebruikten we het gebruik van PIPAAm coating en benut de thermische responsieve grensvlakeigenschappen om de cellen los te maken van het filter. Bloed wordt eerst gefiltreerd bij kamertemperatuur. Beneden 32 ° C, PIPAAm hydrofiel. Daarna wordt het filter geplaatst in ofwel kweekmedia of een buffer op 37 ° C, waardoor de hydrofobe PIPAAm draaien, en vervolgens de elektrostatisch gebonden cellen los.

Het gebruik van bloed gezonde donoren &#39;(uit hoofde van een protocol door de Universiteit van Miami IRB 20.150.020 goedgekeurd na een informed consent) verrijkt met gekweekte kankercellen, de thermoresponsieve techniek voor het vrijgeven van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC), bereikte capture, vrijgave en retrieval efficiency respectievelijk 94% ± 9%, 82% ± 5% en 77% ± 5% (Tabel 1) 15. Ter vergelijking, de afgifte en ophalen efficiëntie onbekleed...

Een protocol om een poly (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) gecoat microfilter voor een effectieve vangst en thermoresponsieve release van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) wordt gepresenteerd te benutten. Deze methode maakt het vangen van CTC uit het bloed van de patiënt en de daaropvolgende vrijlating van levensvatbare CTC voor downstream off-chip cultuur, analyses en karakterisering.

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Het algemene doel van deze techniek is om levensvatige circulerende tumorcellen, of CTC's, effectief uit volbloed te isoleren. Deze CTC's kunnen in kweek worden geplaatst of worden gebruikt voor downstream-analyses die niet-gefixeerde monsters vereisen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van metastasering.Het kan ook worden gebruikt om de ziekteprogressie en de respons op therapie te volgen en om het risico op recidieven te evalueren. Het voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om labelvrije capture van levensvatbare CTC's uit elke solide tumor uit te voeren, terwijl men onafhankelijk blijft van biomarkerexpressie. We kregen eerst het idee om CTC's van het filter vrij te laten komen, omdat we downstream RNA-analyse en kweek van CTC's wilden uitvoeren, in plaats van ze in situ op het filter te kweken.Om het experiment te starten, weegt u voldoende PIPAAm af om een 10% gewichtsconcentratieoplossing te bereiden in een buis van 15 milliliter die butanol bevat. Vortex de buis totdat de oplossing helder is. Knip vervolgens met een schaar plastic microscoopglaasjes in vierkantjes van ongeveer 12 millimeter bij 12 millimeter.Snijd vervolgens met een scherpe rechthoekige schaar een slot-pore microfilterwafer in vierkantjes van acht millimeter bij acht millimeter en plaats deze stukjes direct op de plastic vierkantjes. Bevestig de gesneden filters met polyimidefilmtape op de plastic vierkantjes, uitsluitend aan de rand en de hoek van het filter, zodat er een filteroppervlak van ten minste zeven millimeter bij zeven millimeter niet door de tape wordt bedekt. Plaats het microfilter dat op het plastic vierkantje is bevestigd op de vacuümspanbek van de spincoater.Programmeer de spincoater volgens het volgende recept. Dispenseer vervolgens met een standaard plastic transferpipet voldoende 10% w/v PIPAAm-oplossing om het oppervlak van het microfilter volledig te bedekken en start de spincoater. Verwijder na voltooiing van de coating het met PIPAAm gecoate microfilter uit de spincoater en laat het filter tijdens de opslag bevestigd blijven aan het plastic vierkant.Ga over naar de assemblage van de filtratiecassette en rehydrateer het PIPAAm-gecoate microfilter bij kamertemperatuur door het microfilter in een petrischaal te plaatsen. Voeg 1X PBS toe totdat het microfilter volledig is ondergedompeld. Verwijder na de hydratatiestap het filter uit het plastic vierkant door de polyimide-filmtape van het filter af te pellen of te snijden.Zet vervolgens het microfilter in de filtratiecassette door het microfilter tussen het bovenste en onderste acrylstuk te plaatsen, langs de PDMS-stukken die als pakking dienen. Klem daarna de acrylcassette met klemmen om het filter te fixeren en een luchtdichte afsluiting te garanderen. Verwarm drie milliliters McCoy's celkweekmedium tot 37 °C.Voeg 7,5 milliliter Hank's gebalanceerde zoutoplossing of HBSS toe aan de 7,5 milliliter bloedmonster en zuig dit verdunde bloed op in een spuit van 25 milliliter. Nadat de bovenkant van de cassette is geïdentificeerd, wordt de filtratiecassette op de spuit bevestigd en op de spuitenpomp geplaatst. Stel de spuitenpomp in op een stroomsnelheid van 75 milliliter per uur.Plaats een buis van 50 milliliter onderaan om het filtraat op te vangen en start de pomp. Koppel na voltooiing van de filtratie de filtratiecassette los, waarbij u noteert welke zijde de bovenkant is waar de cellen in het PIPAAm-gecoate oppervlak zijn vastgehouden. Aspireer één milliliter van het warme kweekmedium in een nieuwe spuit.Bepaal opnieuw de bovenkant van de cassette en bevestig de filtratiecassette vervolgens weer aan de spuit met het medium, waarbij het onderste uiteinde van de cassette zodanig wordt geplaatst dat het PIPAAm-gecoate oppervlak van het filter van de spuit af is gericht. Plaats de spuit vervolgens terug op de spuitenpomp en houd de six-wellplaat direct onder de filtratiecassette. Stel de stroomsnelheid in en start de pomp.Leid al het medium door het filter en vang het filtraat op in de petrischaal. Wacht tot al het medium is doorgefilterd, stop dan de pomp en verwijder de spuit en de filtratiecassette van de pomp. Koppel vervolgens de filtratiecassette los van de spuit en open deze om het filter uit de cassette te halen.Plaats het filter met de PIPAAm-zijde naar beneden in dezelfde petrischaal die is gebruikt om de tegenstroom op te vangen bij het vrijlaten van de cellen uit de poriën. Voeg de rest van het warme medium toe en plaats de petrischaal in een celkweekincubator, ingesteld op 37 degrees celsius. Zodra het filter uit de cassette is gehaald, is het essentieel om het in de plaat te plaatsen met de cellen naar beneden gericht en, indien nodig, voorzichtig in het medium te schudden om te garanderen dat de cellen van het filter zijn losgekomen.Verwijder na 24 uur incubatie in kweek voorzichtig het microfilter met een pincet en gooi het filter weg. Resuspendeer de erytrocyten en perifere bloedmononucleaire cellen of PBMCs voorzichtig met een pipet van 1000 µL. Het is van cruciaal belang om uiterst voorzichtig te zijn bij het resuspenderen van de erytrocyten en PBMCs om te voorkomen dat de CTC's worden weggepipetteerd.Verwijder voorzichtig het volledige medium met de geresuspendeerde erytrocyten en PBMC's, terwijl de gehechte kankercellen behouden blijven, en vervang dit door vers medium dat is voorverwarmd tot 37 °C. Ga verder met de evaluatie van de CTC-levensvatbaarheid. Bij gebruik van bloed van gezonde donoren gespike met gekweekte kankercellen behaalde de thermisch responsieve techniek voor het vrijmaken van levensvatbare circulerende tumorcellen of CTC's een efficiëntie van respectievelijk 94%, 82% en 77% voor capture, release en retrieval.De release- en terugwinningsefficiëntie van ongecoate filters waren significant lager. Een live-dead assay werd uitgevoerd om de celviabiliteit te evalueren vóór de spike in bloed en na de release. De cellen bleven viabel na de release en breidden zich snel uit in kweek.SKBr-3-cellen werden uit het bloed teruggewonnen met het PIPAAm-gecoate slotfilter en uitgeplaat op een 48-wellplaat. Na 16 uur in kweek hechten de tumorcellen zich aan de kweekplaat, samen met hypotone erytrocyten en leukocyten die naar de bodem van de plaat zijn gezakt. Na het wassen werden de niet-hechtende cellen verwijderd, waardoor alleen de hechtende tumorcellen op de plaat achterbleven.Dezelfde filters kunnen worden gebruikt voor de capture van gefixeerde cellen, zowel voor het tellen als voor moleculaire karakteriseringen van CTC's, om de progressie van kanker te volgen en het kankerbeheer te verbeteren. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van CTC's, waardoor functionele karakterisering van deze cellen mogelijk werd om toekomstige drugtargets te verkennen en een stap te zetten richting gepersonaliseerde geneeskunde.

capture-and-release-of-viable-circulating-tumor-cells-from-blood

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn prognostische in verschillende uitgezaaide tumoren. Dit manuscript beschrijft de gouden standaard CellSearch systeem (CSS) CTC opsomming platform en hoogtepunten gemeenschappelijke misclassificatie fouten. Daarnaast worden twee aangepast protocollen beschreven gebruiker gedefinieerde marker karakterisering van CTCs en CTC opsomming in preklinische muismodellen van metastase met deze technologie.

Aanpassing van semiautomated doorgeven Tumor Cell (CTC) Testen voor Klinisch en preklinisch onderzoek naar toepassingen

Circulerende tumorcellen (CTC's) hebben aangetoond een belangrijke rol te spelen bij tumormetastase. Hier wordt een methode beschreven voor het isoleren en vermenigvuldigen van CTC's uit het volledige bloed van een syngene model van muistumoren met leverkanker (HCC) metastase.

Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

We presenteren een nieuwe aanpak karakteriseren van tumorcellen. We immunofluorescentie gecombineerd met DNA TL -in-situ-hybridisatie te evalueren van cellen gevangen genomen door een functionalized medische draad staat in vivo verrijken CTCs rechtstreeks uit bloed van de patiënt.

Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Het kweken van CTC's maakt een diepere functionele karakterisering van kanker mogelijk, door specifieke markerexpressie te testen en resistentie tegen geneesmiddelen en het vermogen om de lever te koloniseren te beoordelen, naast andere mogelijkheden. Over het algemeen zou de CTC-cultuur een veelbelovend klinisch hulpmiddel kunnen zijn voor gepersonaliseerde geneeskunde om de uitkomst van de patiënt te verbeteren.

Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.

Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Leer de labelvrije vangst en thermoresponsieve vrijlating van levensvatbare circulerende tumorcellen uit bloed met PIPAAm-gecoate microfilters. Deze methode ondersteunt downstream-kweek en analyses voor kankermetastase-onderzoek.

Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

Meer video's verkennen