Capture and Release van levensvatbare circulerende tumorcellen van Blood

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Een protocol om een poly (N--ISO propylacrylamide) (PIPAAm) gecoat microfilter voor een effectieve vangst en thermoresponsieve release van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) wordt gepresenteerd te benutten. Deze methode maakt het vangen van CTC uit het bloed van de patiënt en de daaropvolgende vrijlating van levensvatbare CTC voor downstream off-chip cultuur, analyses en karakterisering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rawal, S., Ao, Z., Agarwal, A. Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. J. Vis. Exp. (116), e54435, doi:10.3791/54435 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

We tonen een werkwijze voor de grootte gebaseerde vastlegging van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC) van volbloed, samen met de introductie van deze cellen uit chip voor downstream analyse en / of cultuur. De strategie maakt gebruik van het gebruik van een nieuw slot Parylene C membraan porie microfilter CTC en een bekleding van poly (N-propylacrylamide -ISO) (PIPAAm) voor thermoresponsieve levensvatbare afgifte van de gevangen CTC vangen. De vangst van levende cellen wordt mogelijk gemaakt door gebruik te maken van het ontwerp van een sleuf porie geometrie met specifieke afmetingen voor de schuifspanning doorgaans geassocieerd met het filtratieproces verminderen. Terwijl het microfilter vertoont een hoge vangstrendement, het vrijkomen van deze cellen is niet triviaal. Meestal slechts een klein percentage cellen vrijkomen bij technieken zoals reverse flow of cel schrapen gebruikt. De sterke hechting van deze epitheliale kankercellen aan de Parylene C membraan is toe te schrijven aan niet-specifieke elektrostatische interactie. Om th tegen te gaanis effect, gebruikten we het gebruik van PIPAAm coating en benut de thermische responsieve grensvlakeigenschappen om de cellen los te maken van het filter. Bloed wordt eerst gefiltreerd bij kamertemperatuur. Beneden 32 ° C, PIPAAm hydrofiel. Daarna wordt het filter geplaatst in ofwel kweekmedia of een buffer op 37 ° C, waardoor de hydrofobe PIPAAm draaien, en vervolgens de elektrostatisch gebonden cellen los.

Introduction

Metastatische ziekte is verantwoordelijk voor de meeste sterfgevallen door kanker. Het ontwikkelen van prognostische en companion diagnostics biomarker voor metastase is van cruciaal belang bij kanker beheer en de behandeling. Circulerende tumorcellen (CTC) spelen een centrale rol in de tumor verspreiding en metastase. Bovendien bereikt u met gemak als een 'vloeibare biopsie' biomarker, CTC bij patiënten met kanker 'is het perifere bloed is gestegen als een' broeinest 'voor kanker biomarker onderzoek. CTC zijn goed gevalideerd als een prognostische biomarker in diverse kanker instellingen, waaronder borst-, prostaat- en darmkanker 1-3. Echter, recente ontwikkelingen in CTC gebied heeft aangegeven dat de loutere opsomming van deze zeldzame cellen heeft beperkte klinische bruikbaarheid, zie interventionele klinische studies 4. Er is dus een groeiende behoefte aan technologieën voor de moleculaire en functionele karakterisatie van CTC. Op dit moment, slechts enkele technologieën bestaan ​​die het mogelijk maken for niet-antigen bevooroordeeld, levensvatbare vangst en het vrijkomen van CTC, waardoor robuust downstream moleculaire en functionele analyse 5,6. De meerderheid van deze microgefabriceerde inrichtingen zijn gekoppeld microfluïdische platforms en dus een beperkende factor in de hoeveelheid bloed die kunnen worden verwerkt, die varieert 2-4 ml 7-10. CTC zijn zeldzame gebeurtenissen in één buis bloedafname (7,5 ml), zodat de hoeveelheid bloed die kan worden verwerkt teneinde, aanzienlijk belemmert de kans op het vastleggen en het isoleren van deze cellen plaats.

We hebben twee soorten Parylene C membraanmicrofilter apparaten ontwikkeld voor de vangst van CTC die de grootte verschillen tussen grotere tumorcellen en de kleinere normale bloedcellen 11,12 exploiteren. We hebben eerder gemeld op de ronde porie opsomming filter en vergeleken met een door de FDA goedgekeurde platform, waar de microfilter bleek superieur in CTC afvangrendement te zijnvoor kanker bloed monsters van patiënten 13,14. Echter, een beperking van de ronde filter is de noodzaak om een ​​fixeermiddel formaldehyde gebaseerde voorgebruik filtratie. Deze werkwijze behoudt de cellen morfologie terwijl ze de schuifspanning en druk te weerstaan ​​tijdens het filtratieproces. Terwijl opsomming en moleculaire studies kunnen worden uitgevoerd on-chip 13, het fixeermiddel verslechtert het vermogen om functionele karakterisatie voeren. Om deze beperking te pakken hebben we een sleuf porie filter dat de noodzaak om cellen vóór filtratie (figuur 1) vast ontkent. De sleuf porievorm (6 um breed x 40 urn lengte sleuf poriën) maakt de tumorcellen achtereen maken door een porie gedeeltelijk occluderen en dus mogelijk blijft vrije doorgang van andere bloedcellen en verlichten de drukstijging die zou leiden tot celbeschadiging en eventuele barsten 15,16 De sleuf poriën patroon bestaat uit 2 delen die acryl sandwichde sleuf porie filter tussen de bovenste en onderste stuk met Polydimethylsiloxane (PDMS) fungeren als een pakking om een lekvrije afdichting 14,15 (figuur 1) te verstrekken.

Terwijl de afvangrendement van de sleuf porie filter hoog (Tabel 1), de vastgelegde CTC zijn gebonden aan de Parylene C membraan door sterke niet-specifieke elektrostatische interacties plaats van extracellulaire matrix (ECM) gemedieerde adhesie 15. Werkwijzen zoals tegenstroom of het gebruik van cel schrapers niet aan de cellen daadwerkelijk los van het filter, of kunnen leiden tot celbeschadiging en celdood. We verkend een onconventionele gebruik van PIPAAm een versie strategie 15 te formuleren. PIPAAm is een polymeer dat een reversibele lagere kritische oplostemperatuur (LCST) faseovergang bij een oplossingstemperatuur van 32 ° C 17 ondergaat. Traditioneel is deze eigenschap van PIPAAm is op grote schaal onderzocht voor tissue engineering-toepassingen. Gewoonlijk cellengekweekt op PIPAAm gecoate oppervlakken bij 37 ° C wanneer PIPAAm hydrofoob. De cellen kunnen vervolgens worden losgemaakt als opgenomen wanneer de kweektemperatuur beneden 32 ° C, waarbij de PIPAAm beklede oppervlak wordt gehydrateerd 17,18 verschoven is. We benut deze thermische eigenschappen door het uitvoeren van het filtratieproces bij kamertemperatuur (beneden 32 ° C) en daarna inschakelen cel afgifte door het plaatsen van het filter in kweekmedium bij 37 ° C. Bij deze temperatuur de PIPAAm polymeerlaag wordt hydrofoob, waardoor het elektrostatisch gebonden cellen 15 (Figuur 1) los.

Hoewel de temperatuurgevoelige werkwijze evenals andere werkwijzen met succes zijn uitgevoerd om levensvatbare CTC vangen bereiken kort 19-21, een sleutel mogelijk nadeel gedeeld door deze technologieën gemeld is dat ze allemaal een antigeen-afhankelijke beginsel CTC capture gebruiken. Antigeenbasis CTC vast te leggen, zoals previously, kan leiden tot vertekende CTC analyse 11,14. Bijvoorbeeld, veel technologieën affiniteit gebaseerde dienst antilichaam dat EpCAM bindt voor CTC vast te leggen. Echter CTC aangetoond dat verschillende niveaus van EpCAM tot expressie, waardoor weglaten van lage EpCAM en EpCAM negatieve CTC deze technologieën. Ook kunnen beperkingen optreden wanneer CTC van niet-epitheliale oorsprong is van belang, zoals CTC bij melanomen en sarcomen instellingen. Zo, een technologie die het mogelijk maakt voor levensvatbare CTC vast te leggen en het vrijkomen zonder mogelijke vertekening geïntroduceerd door antigen gebaseerde vastlegging is zeer wenselijk.

Belangrijker is het microfilter vastlegapparaat zuiver afmeting alsmede het vrijgavestrategie agnostische is de aanwezigheid van bepaalde oppervlaktemerkers. Wij zijn van mening dat de arbeidsovereenkomst van de PIPAAm gecoat microfilter zal bijdragen aan ons begrip van de metastatische proces uit te breiden, door middel van het verstrekken van de mogelijkheid om effectief en efficiënt te vangen en laat CTC voor downstream analyses. Dit kan potenteially bloot nieuwe moleculen waarvoor nieuwe gerichte systemische therapieën kunnen ook van gericht en verstrekt een biomarker die gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd en steun behandeling van kankerpatiënten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Om de rechten van proefpersonen te beschermen, werden bloedmonsters verkregen na een geïnformeerde toestemming in het kader van protocollen door de Universiteit van Miami institutionele review boards onder IRB 20150020 goedgekeurd.
LET OP: het bloed worden gefilterd voor CTC capture moet worden verzameld in een EDTA buis om stolling te voorkomen.

1. Coating de Microfilter met Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)

  1. Weeg PIPAAm een ​​10% w / v oplossing in butanol bereiden. Mengen met een vortex totdat de oplossing helder is.
  2. Cut plastic microscoop dia's in ongeveer 12 mm x 12 mm vierkantjes, ofwel met een schaar of een scherp mes. U kunt ook gebruik maken van een guillotine.
    LET OP: Deze vakjes zullen dienen als een houder voor de filters tijdens de spin coating proces.
  3. Met behulp van een scherpe paar van de straight edge schaar, knip de sleuf porie microfilter wafer in 8 mm x 8 mm pleinen.
  4. Met behulp van een polyimide film tape zet de cut filters op het plastic squares eerder gesneden in stap 1.3. Breng de film alleen de rand en de hoek van het filter zodat ten minste 7 mm x 7 mm filteroppervlak is un-waarop de tape.

Figuur 2
Figuur 2:. Vertegenwoordiger Illustratie van de Microfilter Set-up voor PIPAAm Coating 8 mm x 8 mm microfilter is gepositioneerd op de 12 mm x 12 mm plastic vierkant gesneden uit een plastic microscoopglaasje. Polyimide tape wordt gebruikt om de microfilter veilig op zijn plaats te draaien vacht van de PIPAAm.Reproduced met toestemming van referentie 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Plaats de microfilter, dat is bevestigd op de plastic plein, op de vacuum klauwplaat van de spin-coater.
  2. Programmeer de spin-coater het volgende recept: Start, 500 rpm gedurende 10 seconden, 6000 rpm voor 60 sec, 500 rpm gedurende 10 seconden, Stop.
  3. Verdeel genoeg 10% w / v PIPAAm oplossing (bereid in 1,1) naar het microfilter oppervlak volledig te bedekken met een standaard plastic overdracht pipet en start de spin coater.
  4. Verwijder de PIPAAm gecoat microfilter van de spin-coater na het coatingproces voltooid. Laat het filter tijdens de opslag aan de plastic plein.
    OPMERKING: De beklede filter kan worden bewaard bij kamertemperatuur maximaal 3 maanden.

2. Montage van Filtration Cassette met PIPAAm Coated Microfilter

  1. Rehydrateren PIPAAm gecoat microfilter bij kamertemperatuur door het plaatsen van het microfilter nog bevestigd aan de plastic vierkant in een petrischaal. Voeg 1x PBS totdat de microfilter volledig onder water en laat gedurende 5 minuten.
  2. Na de hydrateringsstap, laat het filter uit de plastic plein door het snijden van de polyimide film tape met een paar schaar.
    LET OP: Let op welke kant van het filterde PIPAAm coating.
  3. Monteer het microfilter in de filtratie cassette, door daartussen het microfilter tussen de bovenste en onderste acrylstuk samen met de 2 polydimethylsiloxaan (PDMS) stukken als pakking / afdichting. Klem de acryl cassette met clips om de filter veilig te stellen en zorgen voor een goede afdichting.
    OPMERKING: De PIPAAm coating moet naar boven gericht, zodat het monster wordt door, zullen de cellen worden gevangen op PIPAAm beklede oppervlak van het filter (figuur 1).

3. Filtratie van bloedmonster met Capture and Release van CTC uit de Microfilter

  1. Aangezien elke injectiepomp merk heeft zijn eigen user interface, raadpleegt u de handleiding van de pomp en het programma van de injectiepomp te stromen met een snelheid van 75 ml / uur en stel het volume op 20 ml.
  2. Warme 3 ml McCoy's (in de handel verkrijgbaar) celkweekmedia (bereid door toevoegen van 10% foetaal runderserum en 1% penicilline en streptomycine) tot 37 ° C.
  3. Voeg 7,5 ml van commercieel beschikbare Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aan de 7,5 ml bloedmonster en aspireren deze verdunde bloed in een 25 ml spuit.
    Opmerking: Het volume van HBSS zodat het bloedmonster wordt verdund met een gelijk volume van 1: 1 met HBSS Als bijvoorbeeld 10 ml bloed wordt gebruikt, meng met een gelijk volume van 10 ml HBSS tot 1 bereiken. 1 verdunning.
  4. Schakel de filtratie cassette met de spuit en plaats deze op de injectiepomp. Plaats een 50 ml buis bij onder naar stroom door verzamelen en start de pomp.
    LET OP: De filtratie moet ongeveer 10- 12 min te nemen. Alle filtratie stappen worden uitgevoerduit bij normale kamertemperatuur (20-25 ° C), met inbegrip van stap 3.8
  5. Na filtratie is voltooid, schakel de filtratie cassette nemen nota welke kant is de top dat de cellen gevangen op de PIPAAm-gecoate oppervlak heeft. Aspiraat 1 ml warm kweekmedium in een nieuwe spuit.
  6. Re Schakel de filtratie cassette met de spuit met de media, maar op dit moment grijpen de onderkant van de cassette, zodat de PIPAAm beklede oppervlak van het filter is afgekeerd van de spuit.
    LET OP: Deze zal zijn om alle cellen die in de gleuf poriën kunnen worden ingebed door het toepassen van zachte reverse flow vrij te geven.
  7. Plaats de spuit terug op de spuitpomp en houdt een petrischaaltje of 6-wells plaat direct onder de filtratie cassette. Stel het debiet tot 100 ml / uur en start de pomp.
  8. Langs alle media door het filter en laat het doorstroomkanaal in de petrischaal. Wacht tot alle media door middel van te passeren en dan stoppen de pomp en verwijder de spuit eennd filtratie cassette van de pomp.
  9. Maak de filtratie cassette uit de spuit en open aan het filter uit de cassette halen. Plaats het filter met de PIPAAm naar beneden gericht in dezelfde petrischaal gebruikt om de terugstroom verzamelen wanneer het loslaten van de cellen van de poriën. Voeg de rest van het warme medium en zet de petrischaal in een incubator ingesteld op 37 ° C.
  10. Na 30 min worden alle cellen worden vrijgemaakt uit de filter. Echter, laat filter in de petrischaal gedurende maximaal 24 uur te zorgen dat alle cellen los.
    Opmerking: Als alternatief kan de afgegeven cellen worden verzameld in een microcentrifugebuis om verder stroomafwaarts analyses uit te voeren zoals PCR, ELISA, Western Blot om enkele voorbeelden te noemen.
  11. Na 24 uur in de cultuur, verwijder voorzichtig de microfilter behulp van een tang.
    OPMERKING: De filter kan worden weggegooid op dit moment als de cellen is bekend uit het.
  12. Voorzichtig pipet het kweekmedium op en neer met behulp van een 1000 & #181; l pipet, om opnieuw te schorten de erytrocyten en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) die worden betrapt op het filter en vrijgelaten in de plaat met de CTC. Voer deze actie zorgvuldig en voorzichtig om te voorkomen dat het losmaken van de losjes verbonden kankercellen. Verwijder voorzichtig het complete medium dat het geresuspendeerde erytrocyten en PBMC terwijl achter de bijgevoegde-kankercellen en vervanging door vers medium voorverwarmd tot 37 ° C.
    OPMERKING: Deze stap kan één keer worden herhaald als overmatig erytrocyten aanwezig is na een wasbeurt zijn.

4. CTC levensvatbaarheid Evaluatie

  1. Evalueer gekweekt CTC levensvatbaarheid met behulp van een Live / Dead Assay 8.
    OPMERKING: Tal Levend / dood assays zijn in de handel verkrijgbaar. Naar aanleiding van het protocol van de fabrikant wordt aangeraden. Raadpleeg de lijst met materialen / reagentia voor de commerciële testkit gebruikt voor dit experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gebruik van bloed gezonde donoren '(uit hoofde van een protocol door de Universiteit van Miami IRB 20.150.020 goedgekeurd na een informed consent) verrijkt met gekweekte kankercellen, de thermoresponsieve techniek voor het vrijgeven van levensvatbare circulerende tumorcellen (CTC), bereikte capture, vrijgave en retrieval efficiency respectievelijk 94% ± 9%, 82% ± 5% en 77% ± 5% (Tabel 1) 15. Ter vergelijking, de afgifte en ophalen efficiëntie onbekleed filters waren significant lager (7% ± 1% afgifte efficiency en 6% ± 1% retrieval rendement) (tabel 1) 15. Om de levensvatbaarheid van CTCs vrijgemaakt uit filter evalueren ~ 1000 SK-Br-3-cellen werden ingespoten in 7,5 ml bloed gezonde donor, gefilterd door de PIPAAm beklede sleuf filter en losmaken van de hierboven beschreven werkwijze. Een Levend / Dead test werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cellen te evalueren voordat spike in bloeden na de release. De pre-spike levensvatbaarheid was 98% (592 van de 602 cellen geteld) en de levensvatbaarheid van de cellen gevangen genomen en vrijgelaten uit het bloed was 95% (540 uit 567 cellen geteld) 15 (figuur 3A). Tegelijkertijd, de cellen gevangen en vrijgegeven na filtratie van het bloedmonster werden gekweekt in McCoy's 5A kweekmedium. Beelden werden genomen op dag 3 en dag 10. Zoals getoond in figuur 3B, cellen afgegeven uit het filter niet alleen in stand bleef, maar groeide snel in, waardoor er in de vaststelling van hun levensvatbaarheid na filtratie.

Figuur 1
Figuur 1:. PIPAAm Coated Slot Filters op Capture and Release circulerende tumorcellen uit bloed (Top paneel) (A) Helderveld beeld van PIPAAm gecoat slot filter; (B) Filtratie van volbloed voor CTC vast te leggen. (C) Schematische tHij MICROFILTER cassette waar, PIPAAm beklede sleuf filter is ingeklemd tussen de bovenste en onderste cassette. (Bodempaneel) (D) Schematische voorstelling van het proces vrij te geven gevangen CTC uit PIPAAm gecoate slot filters. Overgenomen met toestemming van referentie 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Borstkanker cellen (SKBR-3) spiked in normale donorbloed werden gevangen genomen en bracht met behulp van een PIPAAm gecoat microfilter Capture, Release and Culture of Levensvatbare tumorcellen: Figuur 3.. De cellen in stand bleef na de vrijgave en uitgebreid in cultuur snel. (A) Levende dode assay uitgevoerd op de cellen losgemaakt van de filter. 95% (540 van 567 cellen geteld) van de cellen bleek levensvatbaar(Groen) naar aanleiding van de release. Dode cellen zijn gelabeld in het rood. (B) Dag 3 tot en met dag 10 cultuur van de cellen vrijkomen uit PIPAAm gecoate slot filter. De cellen bleven levensvatbaar en uitgebreid in cultuur. Schaal bar = 100 μm.Reproduced met toestemming van referentie 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Meting van Pore Parameters Pre- en Post- PIPAAm Coating Helderveld afbeeldingen sleuf filter (A) pre- en (B) post- PIPAAm coating.. (C) Pore lengte daalde met 7,3% ± 2,1% na PIPAAm coating en poriewijdte daalde met 15,3% ± 5,6% na PIPAAm coating. Overgenomen met toestemming van referentie 15.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: contaminerende erytrocyten en leukocyten worden verwijderd door voorzichtig wast ongeveer 1000 SKBR-3 cellen uit bloed door PIPAAm beklede sleuf filter gehaald en werden uitgeplaat op een 48-wells plaat.. (A) Bij 16 uur in cultuur, SKBR-3 tumorcellen gehandeld op grond van cultuur plaat (groene pijlen), terwijl apoptotische erytrocyten en leukocyten werden ook de afwikkeling op de bodem van de plaat (rode pijlen). (B) Post-wash, niet-hechtende cellen werden verwijderd, waardoor hechtende tumorcellen op de plaat (groene pijlen). Overgenomen met toestemming van referentie 15. Gelieveklik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1:. Capture, Release and Retrieval Efficiëntie van PIPAAm Coated Slot Filters afvangrendement = cel aantallen gevangen op filter voor de release / cel aantallen spiked in bloed. Laat efficiency = cel aantallen vrijgelaten uit de filter / cel aantallen gevangen op de filter voor de release. Retrieval efficiency = cel aantallen vrijgelaten uit filter / cel aantallen spiked in blood.Reproduced met toestemming van referentie 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het proces van het vastleggen van levensvatbare CTC uit volbloed en het vrijgeven van hen uit de microfilter is betrekkelijk eenvoudig; Maar een paar kritische punten zijn het vermelden waard. Het is absoluut noodzakelijk, net als bij alle celcultuur die steriele toestand wordt gehandhaafd door het hele proces. De eerste stap van het bekleden van het filter met PIPAAm kritisch, als basis voor de techniek van het vrijgeven van de cellen van het filter is gebaseerd op het gebruikmaken PIPAAm de temperatuurgevoelige grensvlakeigenschappen. Ter controle van de filter effectief bekleed, meten van de grootte van een porie (breedte en lengte van een sleuf porie) op het filter onder een microscoop vóór het coaten en weer meten een poriegrootte bericht coating. De poriegrootte moet worden verlaagd met 1 urn zowel de breedte als de lengte (Figuur 4). Zoals gezegd, de sleuf filtreer de efficiënte vastleggen CTC, vangt ook enkele grote PBMC cellen, maar deze cellen zijn niet-hechtende cellen en dus duri3,13 ng stap worden verwijderd uit de kweek achterlating aanhangend kankercellen (figuur 5).

Kleine aanpassingen aan het protocol kan nodig zijn als verschillende hoeveelheden bloed te filtreren of voor gevallen waarin de viscositeit zeer hoog. Zoals in het protocol, is het essentieel om bloed verdund 1: 1 met HBSS. De viscositeit van bloed verschilt van patiënt tot patiënt, maar voor het grootste gedeelte dit beïnvloedt de filtratie. Er zullen sommige gevallen wanneer de viscositeit zeer hoog of grote stolsels aanwezig, waarbij de spuitpomp niet in staat om het bloed te dwingen door het filter zijn. Het is aangeraden in deze gevallen aan de spuit pomp te stoppen, maak de cassette uit de spuit, opent u het bovenste gedeelte van de cassette, maar laat de filter nog aan het onderste deel. Grote bloedstolsels zal goed zichtbaar op het filter zijn. Voorzichtig pipet 1 ml van HBSS op het filter terwijl u de cassette in een lichte angle om het stolsel te wassen. Zodra het stolsel is verwijderd, sluit de cassette, re-vastklikken aan de spuit en ga filtratie.

Terwijl de PIPAAm gecoate filters kunnen in batches en opgeslagen voor later gebruik, hebben wij gevonden dat de houdbaarheid van deze pre-gecoate filters ongeveer 3 maanden. De effectieve vangst en het vrijkomen van de cellen kunnen worden verlaagd voor een deel te wijten aan de PIPAAm vernederende loop van de tijd.

Een van de beperkende factoren een cultuur te creëren van patiënt CTC zal het aantal CTC aanwezig in het bloedmonster zijn liggen. Lage aantallen waarschijnlijk maakt de mogelijkheid om de cellen uit te breiden uiterst moeilijk, zo niet onmogelijk. Echter, sequestering een monster met lage celtelling in kleinere cultuurgebieden kunnen helpen, zoals in een enkel putje van 96 wells plaat in plaats van een plaat met 6 putjes. De identificatie van de cultuur media, of wijziging van de in de handel verkrijgbare media, zal dat de optimale omgeving te bieden for deze cellen groeien is een ander probleem dat moet worden overwonnen.

Moleculaire en cellulaire analyses van CTC leveren waardevolle informatie voor de prognose van kanker en kan helpen rijden precisie geneeskunde 15. De levensvatbaarheid van de cellen afgegeven uit de capture filter is een belangrijke ontwikkeling in de richting van de mogelijkheid om cultuur patiënt CTC voor drug gevoeligheid en screeningtests. Het is al lang bekend dat CTC vaak afwijken van de primaire tumor en daarmee de noodzaak voor de behandeling van beide dienovereenkomstig. Als voorbeeld Schneeweiss et al. gemeld dat in metastatische borstkanker (MBC), antigeen profielen van metastatisch weefsel en primaire tumor verschillen tot 20% van de patiënten. Herbeoordeling van voorspellende markers, met inbegrip van humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) expressie, zou kunnen helpen om MBC behandeling te optimaliseren. Terwijl weefsel bemonstering is invasief en vaak moeilijk te herhalen, CTC analyse vereist slechts een bloedmonster en kan een eenvoudig te herhalen, real-time & # bieden34; vloeibare biopsie "aanpak 22.

Een grote belang van deze techniek ligt in het feit dat terwijl verscheidene platforms vaak gebruikt in CTC vangen en analyses zijn beperkt in moleculaire en cellulaire analyses als fixeermiddel nodig voor het verwerken van het monster of de CTC geïmmobiliseerd op het platform. Verder affiniteit gebaseerde systemen, die het mogelijk maken levensvatbare CTC vangen en vrijgeven, kan mogelijk worden beïnvloed door de keuze van doelantigeen 15. Als alternatief kan de sleuf filter met de PIPAAm coating zorgt voor een label gratis platform dat is effectief en efficiënt in het vangen en het vrijkomen van levensvatbare CTC uit volbloed. Deze methode biedt de mogelijkheid voor verdere karakterisering van levensvatbare CTC, met inbegrip van enkele cel fenotypische en genomische analyse, alsmede ex vivo CTC cultuur.

Er wordt momenteel gewerkt om deze technologie te gebruiken voor klinische toepassingen. Het vermogen om effectief cultuur CTC uit patient monsters zal leiden tot een formulering van effectieve therapie regimenten op een patiënt op basis patiënt, onthullen nieuwe drug targets, en leiden tot de ontwikkeling van effectieve chemotherapeutica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slot Filter Circulogix Inc. MSF-01 Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com)
poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)  Ploysciences Inc. 21458 Non-Hazardous. Store at room temp.
1-Butanol Sigma Aldrich B7906 Use in well ventilated area
Plastic Microscope Slides Cole-Parmer 48510-30 Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square
Spin Coater Specialty Coating Systems SCS G3 Spin Coater Instrument
Polyimide Tape Uline S-7595 Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
1x PBS Gibco 10010-023
Falcon Petri dishes 35 x 10 mm VWR 25373-041
Microfilter Cassette Circulogix Inc. FC-01 Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine 
Syringe 20 ml BD Scientific 302830
Syringe Pump KD scientific  78-0100V Any syringe pump capable of holding a 25 ml syringe may be used
Cellstar 50 ml Centrifuge tube VWR 82050-322
Greiner Bio One 6 well plate VWR 89131-688 Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant
SKBR3 Cells ATCC HTB-30
Live Dead Assay Life Technologies L3224 Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work
Cell Culture Incubator VWR 98000-368 Any incubator that can be used for cell culture will suffice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351, (8), 781-791 (2004).
  2. de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, (19), 6302-6309 (2008).
  3. Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20, (7), 1223-1229 (2009).
  4. Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32, (31), 3483-3490 (2014).
  5. Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11, (17), 2827-2834 (2011).
  6. Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5, (179), 179 (2013).
  7. Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450, (7173), 1235-1239 (2007).
  8. Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8, (6), (2013).
  9. Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11, (11), 1870-1878 (2011).
  10. Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26, (4), 1701-1705 (2010).
  11. Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156, (1), 57-63 (2000).
  12. Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38, (3), 514-519 (2007).
  13. Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16, (20), 5011-5018 (2010).
  14. Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. 220-223 (2013).
  15. Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
  16. Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70, (16), 6420-6426 (2010).
  17. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11, (1-3), 255-265 (1990).
  18. Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11, (11), 571-576 (1990).
  19. Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
  20. Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25, (11), 1547-1551 (2013).
  21. Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6, (23), 20804-20811 (2014).
  22. Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15, (1), 403 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics