열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

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Developmental Biology

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Summary

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

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Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

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Abstract

배수성의 조작은 diploids에 tetraploids에 diploids, 또는 haploids 유용한 변환, 수 있습니다. 그것은 단일 이형 어머니 동질 접합체의 직접 제작이 가능하기 때문에 제브라 다니오 레 리오의에서는 특별히 동형 gynogenetic diploids 생성 유전자 분석에 유용하다. 이 문서에서는 첫 번째 세포주기, 열 쇼크 2 (HS2) 동안 열 펄스에 따라 배수성 복제에 대한 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 중심 소체 복제의 억제를 통해,이 방법은 제 2 셀주기 동안 정확한 세포 분열 스톨 초래한다. 영향을받지 DNA 복제에 결합 정확한 하나의 사이클 부문 스톨은 전체 게놈 중복을 초래한다. 이 방법과 관련된 프로토콜은 하나의 세포주기 분할 지연과 배수성 중복을 일으킬 계란과 정자 수집, 정자의 자외선 치료, 체외 수정 및 열 펄스를 포함한다. 이 프로토콜의 수정 된 버전을 적용 할 수있다다른 동물 종의 배수성 변화를 유도한다.

Introduction

이 프로토콜은 gynogenetic haploids (그림 1) 또는 tetraploids의 생산에서 동형 접합 gynogenetic diploids의 생성에서와 같이 제브라 피쉬 배아의 배수성의 조작을 할 수 있습니다. 이것은 정확히 하나의 세포주기 (도 2A, 2B)에 대응하는 세포질 분열에 지연을 유도함으로써 달성된다. 세포질 분열의 중요한 한주기 지연은 열 충격으로 처리함으로써 달성된다. 같은 원래 Streisinger에 동료에 의해 설명 열 충격 (HS)의 표준 프로토콜은 최초의 세포주기 (1) 동안 한주기 세포 분열 마구간의 결과로, 기간 13 ~ 15 MPF 동안 온도 펄스를 포함했다. 이 프로토콜의 효율은 최근 열 충격 처리 슬라이딩 시간 윈도우 초기 세포주기 스캔에 의해 개선되었다. 이 검사는 여전히 최초의 세포주기 (22 ~ 24 MPF) 내에서, 열 충격에 대한 나중에 포인트를 확인하는 EMBR의 높은 비율의 결과이 경우 제 2 셀이 사이클에 영향을주는 하나의 사이클 세포 분열 실속과 YOS. 제 세포주기 동안 실험 조작은 2 셀 사이클 동안 세포 분열을 방해 DNA를 콘텐츠 복제를 일으킬 관찰은 또한 다른 어류 3,4-보고되었다. 용어 "2"히트 펄스 표준 HS 방법보다 이후 시점에서 발생하고, HS2에 의한 세포주기 지연이 제 2 셀의주기 동안 발생하는 반사 - 우리는 열 충격이 (HS2와 같은 변형 된 프로토콜 참조 ). 이러한 연구는 열 쇼크 후 세포질 분열 구속의 기초는 다음의 세포주기에서 스핀들 형성 및 유도를 밭고랑에 영향 히트 펄스 중에 중심 소체 복제의 억제는 것을 보여 주었다. HS2의 100 %에 가까워 세포주기 정지의 수율 결과, 표준 HS 2보다 4 배 이상으로 배수성 복제까지의 요금.

태아 치료 재치하 할구 세포 사이클링 동안 열 충격이 많은 악영향을 전시, 그 열 충격을 제안하는 것은 세포 분열이 필요한 여러 프로세스에 영향을 미칩니다. 열 쇼크가 세포 사이클 (기간 0-30 MPF)의 개시 이전에인가되는 반면에, 만약 그 중심 소체 복제와 특이 간섭 일관된 효과를 보이며 다른 중요한 세포 과정이 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다 . 이 연구는 할구 분할의 개시 이전에 시간이 특히 중심 소체 억제를 통해 배수성을 조작하는 도구로 열 충격을 사용하는 의무가 발달 기간이 나타납니다 것으로 나타났다. 중심 소체 복제에 열 쇼크를위한 명백한 선택의 근본적인 원인은 알 수 있지만, 이러한 백혈구 세포와 같은 특정 유형의 열 스트레스 하에서 관찰 중심체 하부 구조의 선택적 분해와 관련 될 수있다.

배아 드의 시간 동기화velopment은 체외 수정 (IVF)에 의해 달성된다. 에 배체가 하나의 사이클 세포질 분열의 실속 HS2에 의한 이배체 배아에서 수정 결과 중 처리되지 않은 정자를 사용. 그 DNA를 불 활성화 가교, 하나의 사이클 세포질 분열 스톨이 gynogenetic diploids이 될 HSII 유도에 gynogenetic 반수체 배아 (6) 결과를 전달 UV 처리 된 정자의 사용. 때문에 결과 전체 게놈 중복의, 후자 gynogenetic diploids는 게놈에 걸쳐 하나 하나 현장에서 동형 접합이다. 간결함을 위해, 우리는 "haploids"및 "동형 접합 diploids"로 동형 접합 gynogenetic 이배체 배아로 반수체 배아를 gynogenetic을 참조하십시오. 가능한 비옥 한 경우, 동형 접합 diploids 멸균 및 치명적인없는 라인을 시작하는 데 사용할 수 있습니다. HS2에 의한 직접 동형 접합체는 쉽게 피 시험 메모리의 이형 캐리어 인 여성에서 동형 접합 diploids 때문에, 유전자 분석이나 유전 화면에 통합되어야한다높은 고정 (50 %)의 비율을 2 동형 접합체의 관리 포인트 전시 속도.

다음 프로토콜은 HS2을 수행하고 전체 동형 접합체와 배수성 중복을 유도하는 단계를 설명합니다. 배체 생산을 위해, 정자 솔루션은 치료해야한다. 동형 이배체 제조 정자는 UV 처리에 의해 불 활성화되어야한다. 논의에서 설명 된 바와 같이 또한 가시 안료 마커는 동형 diploids의 식별을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 최상의 결과를위한 IVF 절차가이 기간 내에 발생해야하므로 주로 자신의 빛을주기 7, 두 성인과 계란의 시작의 처음 3 시간 동안 Zebrafish의 친구는 활동 일주기 (8)에 민감합니다.

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Protocol

매디슨과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 (위스콘신 대학 - - 매디슨 보증 번호 A3368-01) 모든 동물 실험은 위스콘신 대학에 따라 실시 하였다.

1. 중단 된 결합을 통해 계란 컬렉션 여성을 선택

참고 : IVF 기반 프로토콜 수동 압력 9 여성의 성숙한 계란의 압출에 의존하고 있습니다. 이전 프로토콜 난자 방출 거동을받은 암컷없이 탱크 또는 쌍 교배 직접 암컷을 사용했지만 (제브라 피쉬 라인에 따라 약 20 % 이하)이 여성의 단지 작은 분획은 수동 압력에 압출하고 유능한 계란을 얻었다. 개선 된 절차에서, 여성은 사전 분류 직접 육안으로 달걀 누워 위해, 상대의 즉각적인 중단 다음에 있습니다. 이 절차는 거의 모든 여성이 돌출하고 유능한 계란이 중단 짝짓기 단계 수율을 통해 미리 선택, 매우 효과적이다수동 압력에 따라.

  1. 실험 전에 오후, 표준 제브라 피쉬 상대 상자에서 원하는 제브라 피쉬 변형의 결합 쌍을 설정합니다. 상대 상자 분할을 통해 또는 알을 낳는 삽입에서 남성과 삽입 내부에 여성을 배치하여 하나, 아직 물리적으로 분리 여성과 동일한 챔버 내에서 남성을 유지합니다.
  2. 그 상대가 시작되도록 실험의 아침, 같은 알을 낳는 삽입 내에서 남성과 여성 모두를 배치, 물리적 파티션을 제거합니다.
  3. 시각적으로 자연 교배 동안 계란의 압출을 검출하기 위해 결합 쌍을 포함하는 탱크를 검사합니다. 계란 돌출, 별도의 남성과 여성의 첫 번째 징후에서 번식을 중단합니다. 남성에서 분리 한 후, 미리 선택된 여성 개별적 또는 동일한 탱크에 모으고 유지. (일반적으로 50-150 계란 / 여성) 원하는 배아의 수에 따라 여러 암컷을 사용합니다.

2. 정자 솔루션을 준비

참고 : IVF r에정자 솔루션 성숙 계란의 노출에 elies. 이 솔루션은 (HS2 처리에 동형 접합 이배체 배아가) 반수체 접합체를 생성하기 위해, 또는 (HS2 처리 될 배체 배아에있는) UV 처리 이배체 접합체를 생성하기 위해, 치료가 될 수 있습니다. 이전 정자 제조 프로토콜은 실시간 남성의 항문 영역으로부터 이리를 수집 모세관의 사용을 제안하지만, 남성의 단지 작은 분획이 이리 9 수득 이것은 비효율적 인 방법이었다. 아래에 제시 프로토콜은보다 안정적인 결과를 얻을 수 전단 해부 고환에서 정자의 준비, 대신에 의존합니다.

  1. (해결 1, 2, 4 및 5)의 모든 구성 요소 포함하는 앞서 행크의 프리믹스 용액으로서 시간 행크 용액을 제조 중탄산 나트륨 용액을 제외하고 (용액 6). 실험 (표 1)의 아침을 해결 6 신선한를 준비하고 예비 혼합물에 추가 할 수 있습니다. 행크스 '솔루션 (최종 솔루션을 위해 아침을 준비IVF 절차) 행크의 프리믹스 990 UL 및 갓 만든 용액 (6)의 10 μL를 결합한다.
  2. 에어컨 물에 0.016 % 용액으로 tricaine에 과다 노출로 남성을 안락사.
    1. 물에 0.2 % 원액으로 tricaine을 준비합니다 (1M 트리스 pH를 9.0으로 pH 7.0 버퍼)와 4 ℃에서 보관하십시오. 비커에 물 100ml 당 tricaine 주식 솔루션 8 ML을 추가하고 tricaine 솔루션에 남성을 전송 그물을 사용합니다.
    2. (100 μL / 클러치 (10) 클러치를 비옥하게하기 위해, 1 ml의 행크의 솔루션에서 수집 된 10 명의 남성에서 예를 들어 고환) 남성 당 100 μL에 해당하는 행크의 솔루션의 볼륨에 수정 된 될 필요가 클러치 당 하나의 남성에 대한 고환의 동등한를 사용합니다.
    3. 15 분 동안 아가미 운동의 중단에 의해 안락사를 확인합니다. 안락사 후, 숟가락 비커에서 남성을 제거합니다. 컨디셔닝 물을 간략하게 남성을 씻어과의 여러 위치에 간단히 배치하여 그들을 가볍게 건조종이 타월.
  3. 고환, 해부 가위 또는 면도날을 사용하여 첫 번째 목을 벨 안락사 남성을 제거하고, 반사 된 광원 scissors.Under에게 해부 현미경을 해부와 복부를 따라 길이 절단을, 해부 집게와 내부 장기를 제거하십시오. 집게와 고환의 질량을 각각 잡아 당겨 행크의 솔루션을 포함하는 microcentrifuge 관 내부에 배치합니다.
    주 : 고환 배설강 근처 수렴 개의 기다란 몸체 벽 옆에 발견 반투명 외관 구조 및 각각 식별 할 수있다. 고환은 절개 후 페트리 접시 표면에와 ​​행크의 솔루션에 배치하기 전에 2 ~ 3 분을 머물 수 있습니다.
  4. 좁은 주걱으로 고환 전단 및 / 또는 부드럽게 공기 방울 형성을 피하면서, 최대 피펫 팅과 1000 μL 팁 마이크로 피펫과 솔루션에서 아래로 5 ~ 6 배의 고환에 의해 용액에 정자를 놓습니다. 고환 파편 정착하자.
  5. 이 최대 2 ~ 3 시간 동안 그 효력을 유지할 수 얼음의 정자 솔루션을 저장합니다. 정자 용액의 UV 처리로 진행하는 경우, 뒤에 고환의 조각을 떠나 깨끗한 microcentrifuge 관에 솔루션을 전송합니다.

3. UV 처리

주 : UV 처리는 배아 비활성 렌더링하기 위하여 정자 DNA를 가교하기 위해 사용된다. gynogenetic 반수체 또는 동형 접합 gynogenetic 배체 배아를 생성 할 때이 단계에만 사용됩니다. UV 처리를위한 정자 용액이 고환 (단계 2.4)의 조각에서 분리되어야, 큰 조각은 UV 처리에서 정자를 보호 할 수 있습니다.

  1. 얼음 침대에 앉아 우울증 유리판의 깨끗하고 마른 우물 (페트리 접시 안에 예를 들어 얼음)에 정자 솔루션을 전송합니다. 물론 유리 접시 당 정자 액 1ml까지 사용할 수 있습니다.
  2. 자외선 램프 하에서 얼음 침대에 오목 유리판을 배치하여 UV에 정자 용액을 노출. 115 V (60 Hz에서 90 초 동안 정자 솔루션을 치료, 0.68A)는 19cm (7.5 인치) 거리에서 UV 램프. 피펫 팁의 끝으로 부드럽게 UV 치료 중 매 30 초 (깨끗한 피펫 팁 매 30 초를 사용) 솔루션을 섞는다.
  3. 깨끗한 피펫 팁 및 마이크로 피펫을 사용하여, 새로운 마이크로 원심 튜브에 처리 정자 용액 옮긴다. (추출 2-3 시간보다 더 이상) IVF에 필요한까지 얼음에 보관하지 않는다.

성숙한 계란 4. 수동 압출

참고 : 쉽게 마취 및 수동 압력 계란을 얻을 것입니다 자연 교배의 중단에 의해 얻어진 여성. 이 절차를 수행하는 동안, tricaine 처리는 신중하게 여성의 복구를 방지 할 수있다 과다 노출을 방지하기 위해 제어되어야한다.

  1. tricaine 솔루션에 빛 노출에 의한 여성 마취 : 컨디셔닝 물에 솔루션을 tricaine하는 순으로 전송 암컷 물고기 정지 할 때까지 약 2-5 분 동안 (조건 물고기 물 8 Tricaine 0.2 % 원액의 ml를 100 ml에 첨가하여 만든) 아가미 운동.
  2. <리는> 곧 여성이 아가미의 움직임을 정지 한,를 수집하고 간략하게 조절 된 물에 씻어 숟가락을 사용합니다. 그럼에도 불구하고, 물고기를 이동 종이 타월의 여러 위치에 간단히 반복 배치하여 가볍게 건조하고 깨끗하고 마른 10cm 직경 페트리 접시에 전송하는 숟가락을 사용. 잠재적으로 아가미 아가미 손상을 방지하기 위해, 후방 방향으로 전방에있는 스푼으로 물고기를 접근.
  3. 중간에 물에 의해 활성화되는 모든 발표 계란을 방지하기 위해, 부드럽게 더 뒷 지느러미 영역을 건조 실험실 천이나 부드러운 티슈를 사용합니다. 손가락을 완충하는 것은 물을 살짝 (그들에게 물고기 비늘을 고집 피하기 위해) 지원 등 여성의 뒤쪽에 한 손의 손가락 하나를 배치하고 계란이 돌출 될 때까지 다른 손의 손가락으로 여성의 복부를 따라 약간의 압력을 적용합니다.
  4. 여성의 몸에서 계란을 멀리 이동하는 좁은 주걱을 사용합니다. 복구를위한 조절 된 물 탱크로 다시 여성을 놓습니다.
  5. (물 노출) 활성화 및 압출 후 동시에 90 초 이내에 (정자 솔루션 첨가) 계란을 기름지게 (5 장 참조).

시험관 아기 (5)

참고 : 자연 십자가에서 Zebrafish의 수정은, 외부 결합 동안 달걀 물과 정자에 의해 동시 발매 및 활성화에 따라 달라집니다. 물의 존재에 정자 용액에 계란을 노출하여 체외 수정을 모방에서이 과정. 물의 양이 유효 정자의 농도를 증가시키기 위해 (1 mL)을 원래 작다. 정자에 의해 바인딩 15 ~ 20 초 10 <내에서 발생/ SUP>, 물 체적은 증가 될 수있다. 융모막 정자가 11, 12 바인딩에 대한 능력의 창을 제한하여 클러치의 마지막 동기화에 더 기여를 해제. 생성 된 배아 따라서 초기 절단 단계 동안 거의 동시에, 세포 분열주기를 나타낸다.

  1. (한 남성의 고환에 해당에 해당 - 제 2 부 참조) 정자 용액 100 μl를 추가 페트리 접시에 압출 계란의 클러치를. 조심스럽게 달걀 손상을 방지하기 위해 배양 접시의 표면에서 팁을 들어 올리지해야되고, 함께 정자와 계란을 섞어 계란 중 정자의 솔루션을 추가하는 데 사용 피펫 팁을 소용돌이 친다.
  2. 즉시 배아 매체 (E3) 용액 1 ㎖를 추가하여 계란을 활성화 부드럽게 피펫 팁과 소용돌이로 다시 부드럽게 계란을 섞어 정자 (에어컨 물은 또한 부품 (7)을 통해 5 E3에 대한 대체 가능). 수정에 타이밍 상대를 시작하는 타이머를 시작합니다. 1 ml의 볼륨 1 MPF에, E3와 함께 접시 홍수. 계속하기 전에 전체 융모막 확장을 포함하여 계란 활성화를 허용하기 위해 10 ~ 12 MPF 때까지 그대로 둡니다.

6. 열 충격 치료

주 : 초기 배아 적용 열충격 후속 세포주기 중에 2 스핀들 형성을 구동 중심 소체 불완전한 보수 결과 중심 소체 복제를 억제한다. 고랑 형성 (13)의 부족 턴 결과 스핀들의 부재.

  1. chorions의 확장 (10 ~ 12 MPF) 후, 차 여과기에 페트리 접시에서 배아를 붓는다. 차 여과기에 남아있는 배아를 수집하기 위해 E3와 세척 병을 사용하여 배양 접시를 씻어.
  2. 28.5 ° C에서 E3와 예열 목욕 비커 내부의 배아와 차 여과기를 놓습니다. 수조 온도 비커와 E3 사전 평형, 충분한 E3가 확인되도록 차의 모든 배아스트레이너는 상기 매체에 노출된다.
  3. 22 MPF에서 짧게는 28.5 ° C의 물을 욕조에서 차 여과기를 제거 여분의 수분을 제거하고 종이 타월에 그것을 가릴 및 41.4 ° C에서 열 목욕 유사 예열 E3 비커 내부에 배치합니다.
  4. 24 MPF에서 간단한 블로 팅 후 28.5 ° C의 물을 욕조에 다시 E3에 차 여과기를 전송합니다. 29 MPF에서, 10cm 페트리 접시에 차 여과기에서 배아를 전송하는 E3와 세척 병을 사용합니다.

한 번의 사이클 세포질 분열 스톨와 태아 7. 선택

  1. 기간 35-45 MPF 동안 송신 광원 해부 현미경 하에서 2- 세포 단계로 대칭 분해가 진행하고있는 그 배아 따라서 수정 된 선택된다. 세포 분열을 겪고되지 않은 배아를 제거합니다.
  2. 최초의 세포주기 동안 정상적인 세포 분열에 대해 선택한 수정 된 배아를 관찰 계속하고 초 동안번째 세포주기 (50-65 MPF).
  3. 4 셀 ( "아니오 스톨"를 2 : 4 셀 배아 2 배치 표준) 다음과 같은 범주 (그림 2C)에 따라 정렬 배아; 3 세포 (탈선이 작은 세포에서 "부분 스톨 '1 대 세포 배열); 2 셀 (: 2 세포 배아의 것과 동일한 구성 일 배아 1에서 하나의 세포주기의 지연을 나타내고, "정체"). 신선한 페트리 접시에 멈춘 배아를 정렬합니다.
    주 :이 단계에서, 배아 2 : 두 배열은도 할구는 세포 분열 스톨을받은 제 세포주기 중 어느 형태와 대응한다; 탈선이 작은 세포 배아 1 대 세포 배열 열충격 한 할구의 두번째 세포주기 동안에 세포주기 스톨을 야기하지만, 다른 곳없는 것에 대응한다; 배아 1의 "정체"1 배열은 제 2 셀 사이클 동안 모두 할구 원하는 세포 분열을 시행 여기서 그 대응마구간. 지연된 배아 다음 세포주기의 기간 (65-80 MPF) 동안 세포 분열을 계속한다. 할구의 배열은 스핀들 2,14 안정화에 의한 이전의 세포주기에서 불완전 단서로 가변 될 수 있지만, 대부분의 정상적인 배아 발달을 겪을 수있는 비교적 정상적인 포배를 형성 할 것이다.
  4. 배아가 10cm 접시 당 80 배아의 한계로, 페트리 접시에 개발할 수 있습니다. 24 HPF, 그들은 감소 축 연장 달리 이배체 또는 동형 이배체 배아 6 (축 연장 (도 3A, 3C)의 정상 범위)의 통상의 형태 특성을 갖고 haploids 증가 바디 두께 특성 여부를 확인하기 위해 배아 관찰 (그림 3B)), 및 / 또는 황금 또는 흰둥이 및 기타 분석 등 36 MPF (그림 3, 아래 참조) 2,6,9에서 유전 안료 마커를 사용하여 diploidization을 평가. 반수체 형태를 가지고, 또는이 용해거나 다른 조잡한 이상 결함을 전시 나타나는 배아를 제거합니다.
    참고 : 원하는 경우, 매일 용해 또는 조잡한 이상 배아를 제거하기 위해 계속하고 매체를 새로 신선한 E3를 추가하는 동안 배아가 5 일 포스트 수정 될 때까지 개발을 할 수 있습니다. 참고 : 살아남은 배아는 또한 부화장 시스템에 전송하고 표준 조건 하에서 공급함으로써 5 일에 swimbladder 인플레이션 후 성장시킬 수있다.

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Representative Results

한 셀 사이클 토키네 스톨에도 불구하고, DNA 복제 배아 (도 1)의 DNA 콘텐츠의 중복 결과, 예컨대 배아 정상적으로 발생한다. Streisinger에 열 충격 프로토콜 (표준 HS)는 기간 13~15분 게시물 수정 (MPF) 동안 열 펄스를 포함하고 파생 된 방법은 여기에 설명 된 반면, 35 MPF 1, 2에서 첫 번째 배아 세포 분열 동안 주로 세포질 분열 체포를 유도, 열 쇼크 2 (HS2)가, 기간 22 ~ 24 MPF 동안 열 충격을 사용하고 50 MPF (; 2,3,4 그림 2)에서 두 번째 배아 세포 분열 동안 세포질 분열 체포를 유도라고도합니다. 24 HPF에서 배아의 관찰 그들이 이배체 또는 동형 접합 배체 배아의 정상적인 형태 특성, 또는 반수체 배아의 형태 특성 축 짧고 넓은 몸을 여부를 결정하는 수 (그림 3) %이 다릅니다. gynogenetic 방법을 통해 전파하여 행 선택 동형 이배체 생산 (1)의 수율을 증가 나타났다. 하나의 유사 분열주기를 억제 기대 정확한 전체 게놈 복제의 확인 염색체 카운트 2,3,4,15 핵 직경 3,4- 정량함으로써 얻을 수있다. 다른 동물로 제브라 피쉬의 표준 개발은 염색체 수에 매우 민감하다 (16) 비정상과 관찰은 동형 접합 diploids는 V가 될 것을iable과 비옥 한 성인 1,2,9 성공 diploidization에 대한 추가 증거를 제공합니다. 제브라 피쉬 배아 배수성은 핵 유전자의 수, 형광 - 활성화 된 세포는 DNA 함량 16 정량화 (FACS)을 정렬 제자리 혼성화 (FISH) 형광 분자 방법을 이용하여 평가 될 수있다.

그림 1
그림 1 : 시비 유형. (A) 자연 짝짓기. 남성과 여성의 생식은 자연 배체의 결과로 치료합니다. (B)이 정자 DNA 및 부계 반수체 접합체의 제조의 파괴를 초래 UV로 처리된다. 처리되지 않은 경우, 이러한 haploids 과거의 일을 개발 2-3 생존하지 않습니다. 열 쇼크 2 (HS2)와 반수체 접합체의 (C) 치료는 초기 배아에서 유사 분열의 세포질 분열의 한 사이클을 억제한다. 이 세포주기 매점, 커플영향을받지 DNA 복제에 d를, 가능한 비옥 한 성인이 될 수 동형 접합 diploids를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : HS2 두 번째 세포주기를 실속시켜 전체 게놈 중복을 촉진한다. 2-, 4-, 8 배아에 대응하는 처음 세 세포 사이클 동안 미처리 배아 (A) 세포 분열 패턴. 두번째 세포주기 동안 세포 분화의 한 사이클에서 실속 (B) HS2 치료 결과. 배체하기 - (> 2N N) 또는 이배체 (2n 개의 -> 4N) (텍스트 참조) 반수체 이배체에 하나에서 스톨 동안 배아에서 진행하는 DNA의 합성 결과는 diploidization를 받고. 이 스톨되면 배아는 NE와 세포 분열을 재개wly 배수성을 인수했다. (C) HS2 처리 배아 할구 배열 할구 번째 세포주기 동안 세포 분열 지연을 나타낼 여부에 따라없는 다양한 나타낼 수있다 : ⅰ) "실속"도 할구 나타내는 지연, 2의 결과 : 2 배열 특성 4- 세포 단계 배아, ⅱ) "부분 스톨"1 배열 및 III) "정체"두 할구 중 하나만이 탈선이 결과, 지연을 나타내는 1 : 두 할구는 한 결과, 지연을 나타낸다 이 세포 단계의 배아의 배치 특성. IN (A - C), 핵은 핵 크기의 확대로 나타내는 diploidization 이벤트와 청색 원으로 표현된다. 셀 분할 마구간에 대한 제안 기준으로 centriolar 동작을 도시 한 도면의 참조 2를 참조하십시오. 큰 versi을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의에.

그림 3
그림 3 : 자연 diploids, haploids 및 gynogenotes의 형태학. (A) 자연의 십자가를 통해 얻은 이배체의 정상 배아 형태. (B) 반수체 배아 짧고 넓은 본체 축을 나타낸다. (C) 동형 diploids 정상적인 몸의 형태를 가지고있다. 배아는 또한 부모의 DNA 상속을 추적 용이하게하기 위해 색소 유전자 황금의 열성 돌연변이를 가지고 : 어머니가 동형 접합 황금의 돌연변이에 대한 사업자 조상이 유전자 야생 형이다. 따라서, 이형 자연 diploids는 황금을 위해, 돌연변이 색소 침착을 나타내는 두 haploids 반면 (황금에 대한 hemizygous) 및 (황금에 대한 동형 접합) 동형 접합 diploids을 야생형 색소 침착을 나타낸다. 스케일 바 = 0.5 mm. 패널 재에서 수정ference 2, 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

해결책 구성 요소들 보관 조건
행크스 '해결 방법 1 8.0 g의 NaCl, 및
0.4 g의 KCl 100 ml의 DDH 2 O
4 O C에서 보관
행크스 '해결 방법 2 0.358 g 무수 나 2 HPO 4,
0.6 g의 KH 2 PO 4
ml의 DDH 2 O (100)
4 O C에서 보관
행크스 '해결 방법 4 0.72 g 염화칼슘 (2)
50 ㎖의 DDH 2 O에서
4 O C에서 보관
행크스 '솔루션 (5) 1.23 g 4 ∙ 7H 2 O를 황산
50 ㎖의 DDH 2 O에서
4 O C에서 보관
행크의 프리믹스 다음과 같은 순서로, 추가 :
10.0 ml의 해결 방법 1,
1.0 ml의 해결 방법 2,
1.0 ml의 해결 방법 4,
86.0 ml의 ddH2O, 1.0 ml의 솔루션 5
4 O C에서 보관
행크스 '솔루션 (6) 0.33 g의 NaHCO3
10 ML의 DDH 2 O에서
체외 수정 절차의 아침 신선한 준비

표 행크의 솔루션 1. 준비.

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Discussion

중요한 단계

체외 수정에 효과적 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 성숙한 계란 (1 단계)의 좋은 공급을 보장하기 위해, 암컷이 짝짓기에 대한 설정은 적어도 5 일 동안 짝짓기 십자가에 설정 한 안하고 임신하는 표시해야합니다. 사육 중단하는 동안, 관찰자는 자연 계란 압출의 첫 등장에 대해 적절하게 15 ~ 30 탱크를 모니터링 할 수 있습니다. 제 달걀 가장 계란은 IVF 절차에 대한 암컷 내부에 남아 있도록하기 위하여, 자연 교배를 통해 방출 될 때 정합 중단 최대한 빨리 발생한다. 이제 성숙 계란을 수동으로 압출 준비가이 여성은, 이후 계란 릴리스에 명백한 효과없이 최대 2 시간 동안 분리 상태로 유지 될 수있다. 효과적인 정자 용액 (2 단계)를 준비하기 위해, 남성은 강력하고 이상적으로 제브라 피쉬 남성 번식의 특징 인 붉은 색조로 표시됩니다. 깨끗한 절개는 일반적으로 레모을 포함한다신체의 후방 및 전방으로 당겨 수영 방광쪽으로 잡아 당겨 장 트랙을 ving. 중앙 내장 제거한 후, 고환 내부 원통 벽의 양쪽 옆에 반투명 긴 질량 남아있다. 원치 않는 장기 정자 용액에 (예를 들면 장)을 포함하지 마십시오; 필요한 경우 행크의 솔루션에 배치되기 전에 건조 페트리 접시 표면에 협력하여 고환에서 이러한 구분합니다. IVF (4 단계) 동안 높은 수정률을 달성하기 위해, 압출 계란 정자 추가 될 때까지 자격 유지하는 것이 중요합니다. 약간 노란색 톤 시비 전시를 위해 유능한 계란과 반투명입니다. 물이 수정을 배제 할 계란 활성화 및 조기 활성화를 유발하기 때문에, 정자 또한 이전에 물과 접촉을 갖는 난을 피하십시오. 물 활성화와 시비는 것, 계란의 탈수를 방지하기 위해 여성에서 압출의 90 초 이내에 발생한다자신의 저하로 이어집니다. 필요한 경우, 압출 계란 보충 행크의 솔루션의 100 ~ 200 μL에 (1.5 시간 이상까지) 오랜 기간 동안 유지 될 수 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) (17) (이 특정 목적을 위해 행크의 솔루션을 준비 할 때, 준비 프리믹스는 BSA 보충 동안 추가 수분 함량)에 대한 수정합니다. 계란 행크의 BSA 용액의 도움으로 관할 유지 된 경우, 마이크로 피펫 계란에서 과량 행크의 BSA를 제거하고 1 분 이내에 비료.

HS2를 사용 diploidization의 성공을위한 중요한 단계는 정체 배아 (7 단계)의 정렬입니다. 대칭이 세포 배아를 절단의 초기 정렬이 수정 된되고 (- 이러한 배아는 폐기해야합니다 직접 1- 4 세포에서 35-50 MPF에서 전환 배아에서 IVF 결과 중 가끔 dispermy) 세포 분열을 시작 배아에 대한 선택합니다. 셀 자전거는 이러한 초기 배아 일 동안 15 분마다 발생각각의 세포주기의 처음 10 분 동안 배아를 절단, 정렬 나이 (그래서 35-50 첫번째 셀 사이클 MPF 상기 제 2 셀 사이클 50-65 MPF 및)는 사이클 정확한 대한 중복 없음을 보장 셀 분할 스톨의 식별.

수정 및 문제 해결

초기 수정률뿐만 아니라 후속 HSII 치료의 부재 haploids의 주파수를 테스트하여 필요한 경우 3 단계에서 UV 처리의 강도는 (예를 들어 노광 시간, 램프 전력 램프까지의 거리)가 조정될 수있다 : 올바른 양 반수체 배아의 100 %의 결과로 동안 자외선 노출이 수정률에 눈에 띄는 효과가 없습니다 (이배체 배아에서 반수체를 구분하는 대표 결과를 참조). 부족 자외선 노출로 인해 t 이배체 배아를 생성하는 동안 너무 많은 자외선 노출, 정자 기능에 해로운 영향에 아마도 인해 감소 시비 요금 발생정자 DNA의 오 완전 불 활성화.

배아 세포 분열 재개한다 (단계 7) 이후 발달 결함이나 치사율을 나타내는 경우에는, 단계 6에서 열 쇼크 온도는 배아의 생존을 증가시키는 (예를 들면 41.0 ° C)에서 약간 감소 될 수있다; 비정상적 3 셀의 거의 동일한 분수 결과 두 번째 세포주기 동안 2 셀 배아를 실속 (그리고 centriolar 복제에 영향을위한 임계 값 근처에 따라서 있습니다) 최소한의 후속 발달 결함 발생과 세포 사이클의 재개 후 생존을 증가 조건 .

들이 개발 같이 HS2 방법은 다양한 세포주기를 추적 수 배아 직접 관찰하기 때문에, 세포 분열 스톨 (따라서 전체 게놈 복제)를 평가하기위한 편리하고 극한 메커니즘을 포함한다. 한 세포주기 분할 실속받은 배아 수동 선택 diploidized 배아의 균일 한 집단을 생성 허용에스. HS2는 DNA 복제를 확인하기 위해 극한기구로서 하나의 셀 분할 스톨 동작과 같은 임의의 유전 적 변형 제브라 피쉬 (예를 들면 AB, 튜빙 겐, WIK)에서 수행 될 수있다. 또한 상기 균주에 도입 보이는 유전자 마커 diploidized 배아 (도 3)의 식별을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 황금 또는 등의 색소 유전자의 열성 돌연변이에 대한 동형 접합체 암컷에서 계란의 사용은, 동일한 색소 유전자 정상 대립 유전자를 운반하는 야생형 균주 유래의 정자와 결합 될 수있다. UV 처리 된 정자는 야생형 대립 안료를 기여할 수 없기 때문에이 상황에서는 반수체와 동형 이배체 배아 열성 색소 돌연변이를 나타낸다. 또한 동형 diploids 덜 확장 반수체 형태 대조적 24 HPF에서 야생형 형태를 나타낸다. 임산부 열성 특성 및 전반적인 엠브리의 모양의 조합오 형태에 성공 배수성 중복을 확인합니다. 또한, 확인이 처리 및 비 처리 된 배아의 염색체 카운트를 통해 얻을 수있다.

열성 보이는 유전자 마커에 기초하여, 상술 한 유전자 마킹 시스템은 또한 생성 된 배아 정자 완전히 UV 처리에 의해 불 활성화되지 않은 경우에만 야생형 착색을 나타내고 있기 때문에, 자손 정자 유래 DNA의 유무를 확인 허용 . 유전자 마킹 시스템이없는 경우, 배아의 샘플 모든 배아 24 HPF의 반수체 형태를 나타내는 확인하는 열충격이없는 발전시키고, 따라서 그 정자 DNA 불 활성화가 완료되었을 수있다. 완전히 비활성화 정자와 함께, 이와 같은 유전자 마킹 시스템은 자연 전위 극체 고장 검출 허용한다. 이러한 이벤트는 diploidization 처리없이 이배체 형태로 표시 열성 배아의 외관을 초래할 것이다. 자발적 극성 보DY 실패는 제브라 피쉬에서 관찰되지 않았습니다하지만 Xenopus의의 tropicalis (18)에보고됩니다. 주어진 시스템에 존재하는 경우,이 이벤트는 자연 최적 배수성 조작을 구현하기 위해 감소되거나 통제되어야한다.

기술의 한계

가능한 gynogenotes을 생산하는 능력은 동형 접합체는 해로운 배경 유전자 변이의 유무에 의존한다. 따라서, 절차의 성공은 사용 된 유전자 변형에 따라 달라질 것이다. gynogenesis 여러 세대를 통해 유전 균주의 선택은 하나 생존을 개선시킨다.

이배체 배아를 생산하는 정자 치료와 함께 사용하면 HS2에있어서, 또한 고주파 배체 배아의 생산을 허용한다. 그러나,이 경우 배체 변화의 이배체로 인한 유전 적 마커는 용이하게 전체 genom의 확인을 허용하지 않는다전자 중복. 이 경우, 정체 배아 동기화 배아 한 세포주기 스톨의 관찰 및 선택 배체 선택을 보장해야하며, 염색체 수가 더 배수성을 확인하는데 사용될 수있다.

기존 / 다른 방법에 대한 의미

전에 40 년 이상 1 Streisinger에 의해 설명되었지만, 표준 HS 방법이 널리 열악한 수율로 사용되지 않았다. 대신, 배수성 조작은 거의 독점적으로 대체하고 두 번째 감수 분열의 억제를 통해 배수성 중복 결과 초기 압력, 상대적으로 더 효율적인 방법에 의존하고있다. 그러나, 유전 적 도구로 그 값을 줄인다 유전자 동형 접합체 9,19-의 가변 비율로 초기 압력의 결과. 최근 연구에 표시하는 HS2 표준 HS 프로토콜, 제 세포주기 동안 다른 시간에 히트 펄스, 즉 응용 프로그램의 변형합니다 (22-24표준 HS에서 12 ~ 14 MPF에 비해 HS2에 MPF 기간은) 동형 접합 배체 생산의 최대 4 배까지 증가 수율을 초래한다.

히트 펄스의 작용 따라서 스핀들 생성 중재 적절한 보수 결여 (제 세포주기 동안 22-24 MPF) 열충격 시간 동안 중심 소체 복제의 억제 인하여 발생하는 추론 될 수있다 (제 세포주기에 대응하는 50-65 MPF) 다음 세포주기 동안 세포 분열. 중심 소체 중복 정확한 한 세포주기 스톨 후 계속 개발을 허용 후속 셀 사이클 동안 열 쇼크의 부재에서 재개 할 수있다. 중심 소체 복제 및 DNA 복제주기는 상호 의존적이기 때문에 (20)는 DNA 복제 심지어 2 셀 사이클의 정체 분할 중에 정상적으로 진행한다. 이것은 정확한 전체 게놈 복제 및 전체 homozygosis 발생합니다.

미래의 응용 프로그램

(21)의 여러 대립 유전자를 포함하는 그와 관련된 여러 세대를 필요로하는 사람들, 특히 유전 적 스크린과 같은 유전 방식을 용이하게 할 수있다.

HS2 유사한은 체외 수정을 가진 다른 종에도 적용 할 수 접근법 심지어 현재 유전 시스템으로 사용되고 있지. 이 방법특히 히트 펄스 해로운 발달 효과를 생산하지 않고 정확한 세포 분열 스톨 및 전체 게놈 복제를 중심 소체 복제에 영향을 생성 할 수 할구 사이클의 시작을 수정으로부터 일정 기간을 이용한다. 따라서, 초기 기간 동안 다른 동물 시스템 배수성 조작 계 유전 적 방법을 개발하는 열 충격 감도 탐색 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1,000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

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References

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