斑马鱼胚胎的倍性操作与热休克治疗2

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Developmental Biology

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Summary

对于套数操纵修改协议使用热休克诱导胞质一个周期的摊位在早期胚胎。这个协议是表明在斑马鱼,也可以是适用于其它物种。

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Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment. J. Vis. Exp. (118), e54492, doi:10.3791/54492 (2016).

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Abstract

倍体的操纵允许有用的变换,如二倍体对四倍体或单倍体到二倍体。在斑马鱼 ,特别是因为它允许从一个单一的杂合母直接生产纯合子的纯合雌核二倍体的生成是在遗传分析是有用的。本文介绍的第一个细胞周期,热冲击2(HS2)期间,基于热脉冲重复套数修改后的协议。通过抑制中心粒复制的,此方法的第二细胞周期中产生一个精确的细胞分裂失速。精确的单周期划分摊位,耦合到未受影响DNA复制,导致了全基因组倍增。用这种方法相关的协议包括卵子和精子采集,精子的UV处理, 体外受精和热脉冲引起一个细胞周期分裂延迟和重复套数。本协议的修改后的版本可以应用以诱导其它动物物种的倍性的变化。

Introduction

该协议允许倍性在斑马鱼胚胎,诸如在从核发育单倍体( 图1)或生产四倍体纯合雌核二倍体的产生操作。这是通过诱导对应于正好一个细胞周期( 2A,2B)胞质的延迟来实现的。在胞质分裂的关键一个周期的延迟是通过用热休克实现。热休克(HS)最初由Streisinger和同事描述的标准协议的周期13-15 MPF期间所涉及的温度下脉冲,第一细胞周期1期间导致一个周期细胞分裂失速。此协议的效率与热休克治疗的滑动时间窗口扫描早期细胞周期最近的改善。该扫描确定了一个热休克稍后的时间点,仍是第一细胞周期(22-24 MPF)内,即导致较高的速率EMBR的YOS与一个周期的细胞分裂失速,而在这种情况下,会影响第二细胞周期2。该第一细胞周期中的实验操作的第二单元周期期间干扰细胞分裂和导致DNA含量复制观察也有报道在其他鱼类3,4。我们将此改性协议作为热休克2(HS2 - 术语“2”反映了加热脉冲发生在比标准的HS方法稍后的时间点,而第二细胞周期过程中发生引起HS2细胞周期延迟)。这些研究表明,对于细胞分裂停滞热休克后的基础是中心粒复制的热脉冲,从而影响在下面的细胞周期纺锤体形成与沟诱导时的抑制。 HS2导致细胞周期停滞的收率接近100%,倍性复制到高4倍,比标准的HS 2速率。

胚胎机智处理哈卵裂球细胞循环过程中的热休克表现出许多有害的影响,这表明热休克影响细胞分裂2需要多个进程。另一方面,当热冲击前的细胞周期(时间周期0-30 MPF)的开始施加,它似乎有与中心粒复制特定干扰一致的效应并似乎不影响其它基本细胞过程2 。这些研究表明,之前卵裂球分裂的开始时间似乎是一个发展期适合使用热休克作为一种工具来具体操作,通过中心粒抑制倍。对中心粒复制热休克表观选择性的根本原因尚不清楚,但可能与在特定细胞类型中的热应力下观察中心体子结构,例如白细胞5的选择性降解。

胚胎去的时间同步发展最是通过在体外受精(IVF)来实现的。在二倍体胚胎受精结果在HS2诱导的单周期失速胞质四倍体成为精子未经使用。采用UV处理过的精子,它携带灭活其DNA交联,结果雌核发育单倍体胚胎6,其在HSII诱导的单周期胞质失速成为雌核发育二倍体2。因为得到的全基因组倍增的,后者雌核二倍体是在整个基因组中的每一个基因座纯合的。为简明起见,我们指的是雌核单倍体胚为“单倍体”,和纯合雌核发育二倍体胚为“纯合二倍体”。如果可行的肥沃,纯合二倍体可用于发起无菌和无致死线。通过HS2诱导直接纯合性也应容易地并入基因分析或遗传筛选中,由于纯合二倍体从女性是MUT的杂合子携带者在高和固定的(50%)比2纯合子的ations展览率。

以下协议描述的步骤来执行HS2和诱导倍体复制具有完全纯合。对于四倍体生产,精子溶液应治疗。为纯合二倍体生产,精子应通过UV处理而失活。此外,如在讨论中所述,可见色素标记也可用于促进纯合二倍体鉴定。主要在他们的光变周期7,和成人和鸡蛋开始的第一个3小时斑马鱼的伴侣是昼夜节律8敏感,所以为了获得最佳效果的试管受精手术应该在这段时间内发生。

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Protocol

麦迪逊和机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导方针(威斯康星大学 - - 麦迪逊担保数量A3368-01)所有的动物实验是根据威斯康辛大学进行的。

1.通过中断杂交选择用于鸡蛋收集女性

注:根据IVF-协议依赖于成熟女性的卵子通过手工压9挤压。先前协议已经直接使用雌性从罐或成对交配而不进行卵释放行为的女性,但只有这些女性(约20%或更少,这取决于斑马鱼线)的一小部分在手动压力产生挤压和主管鸡蛋。在一个改进的过程,女性是预排序用于通过直接目视观察产蛋,随后配合的立即中断。这个过程是非常有效的,因为几乎所有的女性通过这个中断杂交一步产量挤压和主管鸡蛋预选在手动压力。

  1. 实验前的下午,设立在标准斑马鱼交配箱所需的斑马鱼品系交配对。保持男性在相同的腔室作为女性从他们还物理分离,或者通过一配合框除法或放置一个产卵插入下阳和插入内的女性。
  2. 实验的早晨,取出物理分区,将两者的男性和女性相同产蛋插入内,以便配合开始。
  3. 目测含接合对自然交配过程中检测鸡蛋的挤压坦克。在鸡蛋型材,男女分开的最初迹象打断滋生。从雄性分离后,保持预选雌性单独地或在同一水箱合并。取决于所需(通常为50-150个卵/女)胚胎数使用多个女性。

2.准备一个精解

注:体外受精 - [Relies成熟卵暴露于精子溶液。此溶液可以是未经处理的,以产生二倍体合子(其在HS2治疗成为四倍体胚胎)或UV处理过的,以产生单倍体合子(其在HS2治疗成为纯合二倍体胚)。以前精子制备协议建议使用细管,以从活雄性肛门区域收集鱼白,但是这是一个无效的过程,因为只有男性的一小部分,得到鱼白9。下面介绍的协议,而不是依赖于从解剖剪睾丸精子的准备,这将产生更可靠的结果。

  1. 提前作为汉克的预混溶液制备Hank氏溶液,其包含所有组分的(溶液1,2,4和5)除了碳酸氢钠溶液(溶液6)。制备方案6新鲜,并加入到预混物的实验( 表1)的早晨。为了使Hanks溶液(最终解决方案,准备的早晨试管受精手术),结合汉克的预混料990 UL和10微升的新鲜出炉的解决方案6。
  2. 由过度安乐死男性到三卡因在空调水的0.016%的溶液。
    1. 制备三卡因作为在水中的0.2%的储备溶液(缓冲到pH 7.0用1M的Tris pH 9.0)中,并保持在4℃。加入8毫升每100毫升水中三卡因原液在烧杯中,并用一个净给雄性转移到三卡因溶液。
    2. 使用睾丸每需要汉克的解决方案相当于每公100微升体积受精离合器一名男性同等(从1毫升汉克的解决方案采集10名男性睾丸,施肥10离合器用100微升/离合器)。
    3. 确认通过鳃运动停止安乐死15分钟。安乐死后,从用勺子烧杯中取出的男性。与调节的水冲洗短暂的男性,并把它们在短暂的几个位置轻轻擦干纸巾。
  3. 要取出睾丸,用解剖剪刀或刀片第一斩首处死男性,并随着解剖scissors.Under解剖显微镜反射光源腹部纵行剪开,取出内脏解剖用钳。拉出每个睾丸群众钳,把它们含Hank液的离心管内。
    注:睾丸可以被识别为每一个找到沿着体部的壁半透明的外观的两个细长结构和会聚泄殖腔附近。睾丸可以在解剖后一个培养皿表面并将它们放置在Hank溶液之前保持2-3分钟。
  4. 由具有窄抹刀剪切睾丸和/或轻轻吹打起来并与1000微升尖微量溶液向下5-6倍睾丸,同时避免气泡形成释放精子进入溶液中。让睾丸碎片落户。
  5. 存储在冰中,在那里它可保持其效力长达2-3小时精子溶液。如果在进行紫外线处理的精子溶液,将溶液转移到一个干净的微量离心管离开睾丸件后面。

3.防晒修护

注:UV处理是用于交联精子DNA以使其在胚胎无效。生产雌核发育单倍体的或纯合雌核发育二倍体胚胎时,这一步时才使用。紫外线处理精子的解决方案应该从睾丸(步骤2.4)件分开,因为大块可以从紫外线处理保护精子。

  1. 精子溶液转移到一个凹陷玻璃板坐在冰床的洁净,干燥的井( 例如培养皿内冰)。最多可使用1毫升每玻璃板精解好。
  2. 通过在UV灯下将所述凹陷玻璃板上冰床暴露精子溶液紫外线。把90秒的精解与115 V(60赫兹,0.68A)UV灯在19厘米(7.5英寸)的距离。用移液管尖的末端,轻轻的溶液UV处理期间,每30秒(使用干净的移液管尖端,每30秒)混合。
  3. 使用干净的移液管尖端和微量,处理过的精子溶液转移到新的离心管中。直到需要为IVF(不超过从萃取2-3小时)在冰上储存。

4.成熟的卵子的手动挤压

注:由自然交配中断获得很容易产生麻醉及人工压力下的蛋女性。在此过程中,三卡因治疗应仔细控制,以避免过度,可能会阻止雌性的回收。

  1. 麻醉雌性通过曝光到三卡因溶液:转印女性用网,以三卡因在调节水溶液约2-5分钟,直到鱼停止(通过加入8毫升三卡因0.2%原液至100毫升的空调鱼水制成)鳃运动。
  2. <LI>当女性停止运动鳃,用勺子收集,并简要地调节水冲洗。依旧采用汤匙移动的鱼类,通过将其简单地反复在纸巾上的几个位置轻轻擦干,然后将它转移到一个干净,干燥的直径10厘米的培养皿。接近鱼在从前到后的方向勺,以避免潜在的破坏鳃鳃盖。
  3. 使用实验室布或柔软的棉布轻轻进一步干燥臀鳍区域,以防止任何公布鸡蛋过早地被水激活。阻尼手指轻轻用水(避免它们粘到鱼鳞),放置一只手的一个手指上的女性的背面作为支持,并用另一只手的手指施加轻微的压力沿着女性的腹部直到鸡蛋成为挤出。
  4. 使用窄刮刀从女性的身体移动的鸡蛋了。放置阴回到与调节的水进行回收的槽。
  5. 激活(与水接触)和挤压后,同时90秒内受精(带精解加)鸡蛋(见第5节)。

5. 在体外受精

注:天然杂交斑马鱼受精是外部的,依赖于交配期间同步上映,并活化蛋水和精子。体外受精模拟通过在水的存在下的蛋暴露于精子溶液这一过程。水体积以增加有效精子浓度为原来小(1毫升)中。精子结合15-20秒10 <内发生/ SUP>和水体积然后可以增加。绒毛膜通过限制窗口用于精子结合11,12权限解除进一步有助于离合器的紧密同步。因此,产生的胚胎在早期卵裂阶段主要表现同时细胞分裂周期。

  1. 加入100μl的精子溶液(相当于从一个男性睾丸的等效 - 见第2部分)挤出的蛋上的培养皿的离合器。轻轻摇动用于添加蛋之间的精子溶液到精子和卵子混合在一起时,应确保不从培养皿的表面抬起的尖端,以避免蛋损坏枪头。
  2. 通过加入1ml胚胎培养基(E3)溶液的立即激活蛋(空调水也可作为在零件5至7为E3的一个替代可接受),并再次轻轻混匀卵子和精子通过用吸管尖端轻轻旋转。启动计时器启动相对施肥时机。 在1ml的体积1强积金,洪水与E3板。在继续之前,离开不受干扰,直到10-12强积金允许卵子活化,包括完整的绒毛膜扩张。

6.热激处理

注:在胚胎早期应用热休克抑制重复的中心粒,导致中心粒的不完全配套的后续细胞周期2时驱动纺锤体的形成。在缺乏沟形成13回合的结果没有主轴。

  1. 该绒毛膜扩张(10-12 MPF)后,倒在培养皿胚胎成滤茶器。使用的洗涤瓶E3,以便收集在滤茶器的任何剩余的胚胎冲洗培养皿。
  2. 放置在一预加热的浴E3烧杯内的胚胎的滤茶器在28.5℃。预平衡烧杯和E3的水浴温度,并确保有足够的E3,这样在茶胚全部过滤器被暴露于介质。
  3. 在22 MPF,从28.5℃水浴中取出滤茶器,简单地吸干到纸巾去除多余的水分,并将其放置在热浴类似预热E3烧杯内41.4℃。
  4. 在24 MPF,短暂印迹后在28.5℃下转移滤茶器返回到E3中的水浴中。在29强积金,用洗瓶与E3的胚胎从滤茶器转移到10cm的培养皿。

7.选择了胚胎一个周期胞质失速

  1. 期间的时间段35-45 MPF,具有透射光源的解剖显微镜下,选择因此那些正在经历对称裂解成两细胞阶段,其中胚受精。删除未进行细胞分裂的胚胎。
  2. 继续观察受精的胚胎,第一个细胞周期中选择了细胞的正常分裂,而秒内OND细胞周期(50-65 MPF)。
  3. 4细胞(“无失速”,在2:对于一个4芯胚胎2排列标准)根据下列类别( 图2C)分类胚胎; 3细胞(“偏排档”,在异常2更小的单元:1大细胞排列); 2细胞(“停止”,表现出的胚胎在1单细胞周期的延时:1的安排相同,2细胞胚胎的)。排序陷入僵局的胚胎到一个新的培养皿。
    注:在此阶段,胚胎在2:2结构对应于在所述第二细胞周期期间既不卵裂球进行了细胞分裂失速;胚胎中的异常2较小的单元:1大细胞排列对应于那些热休克所述第二细胞周期中在一个卵裂球引起细胞周期失速而不是其他;和胚胎在一个1“停止”:1排列对应于其中第二细胞周期期间都卵裂球经历了期望的细胞分裂摊位。停滞的胚胎应在以下细胞周期(65-80 MPF)恢复细胞分裂。卵裂球的布置可以是可变的,由于从以前的细胞周期的不完整的线索,以稳定该主轴2,14,但大多数胚胎将形成相对正常囊胚能经受正常发育。
  4. 允许胚胎在培养皿培养,以每10cm板80的胚胎的限制。在24高倍视野,观察胚胎,以确定它们是否具有二倍体或纯合二倍体胚6(轴延伸( 3A,3C)的正常范围内)的一个正常的形态特征,在对比降低轴线延伸和单倍体的增大机身厚度特性( 图3B)),和/或使用遗传颜料标记在36 MPF,如白化等这样的测定( 图3和参见下文)2,6,9-评估二倍。 删除似乎有一个单倍体的形态,或已发生裂解或出现其他严重缺陷,异常胚胎的任何。
    注:如果需要的话,允许胚胎发展,直到后5天受精,同时继续以除去每天裂解或严重异常胚胎和加入新鲜E3刷新介质。注:生存胚胎也可以通过转移到孵化系统和标准条件下饲养鳔充气后生长的第5天。

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Representative Results

尽管单细胞周期胞质失速,DNA复制在这样的胚胎通常发生,导致胚胎( 图1)的DNA的内容的复制。该Streisinger热休克协议(标准HS)期间13-15分钟后受精(MPF)中涉及到热脉冲,并在35 MPF 1,2第一胚胎细胞分裂过程中主要诱导细胞分裂逮捕,而这里介绍的方法得出,称为热休克2(HS2),周期22-24 MPF期间使用的热冲击,并在50 MPF( 图2; 2,3,4)第二胚胎细胞分裂期间诱导胞质骤停。在24 HPF,胚胎的观察允许确定它们是否具有二倍体或纯合二倍体胚的一个正常的形态特征,或者更短和更宽体轴单倍体胚的形态学特征( 图3) 50%,2。通过雌核方法由传播线的选择已被证明提高纯合二倍体生产1的产率。从一个细胞周期的抑制预期的准确全基因组倍增的确认可以通过染色体计数2,3,4,15或核直径3,4定量获得。在斑马鱼作为其他动物的正常发展,是染色体数目高度敏感异常16和观察到纯合二倍体成为viable和肥沃的成年人1,2,9提供了成功的二倍更多的证据。倍体在斑马鱼胚胎也可以使用分子的方法,例如在核基因计数和荧光激活细胞分选(FACS)来量化DNA含量16原位杂交(FISH)荧光评估。

图1
图1:施肥类型。 )自然交配。雄性和雌性配子是未经处理的,从而产生自然的二倍体。 (B)中的精子被用紫外线处理,从而在父系DNA和生产单倍体受精卵的破坏。如果不治疗,这种单倍体不会活过一天的发展2-3。 (℃)与热休克2(HS2)单倍体合子的治疗抑制早期胚胎有丝分裂的细胞分裂的一个周期。这种细胞周期的摊位,情侣d可影响DNA复制,生成纯合子二倍体,可以成为可行的和肥沃的成年人。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:HS2由失速第二细胞周期促进全基因组重复。期间的前三个细胞周期的未处理胚胎(A)的细胞裂解图案中,对应于2-,4-,和8-细胞胚胎。 (B)的HS2处理导致细胞分裂的一个周期失速第二细胞周期中。在摆摊,在胚胎正在进行DNA合成的结果进行二倍,无论从单倍体二倍体(N - > 2N)二倍体或四倍体到(2N - > 4N)(见正文)。这个档位之后,胚胎细胞继续分裂,与NEWLY收购套数。 (℃)HS2处理的胚胎可以表现出各种不同的卵裂球是否在第二细胞周期中表现出细胞分裂延迟卵裂球的安排:ⅰ)“无失速”:既不卵裂球表现出延迟,导致2:2结构的特征4细胞期的胚胎,ⅱ)“局部失速”:只有两个卵裂球中的一个表现出延迟,导致异常2:1排列,以及iii)“停止”:既卵裂球表现出延迟,导致1:1的2-细胞期胚胎排列特性。在(A - C)中 ,核被表示为蓝色圆圈,与由核大小的扩大表示的二倍事件。参见图描绘了作为细胞分裂摊位所提出的基础中心粒的行为参考2。 请点击此处查看大VERSI这个数字的。

图3
图3:天然二倍体,单倍体和gynogenotes形态。 )通过自然杂交获得二倍体的正常胚胎的形态。 (B)单倍体胚胎表现出短而宽体轴。 (C)纯合二倍体有正常的体形态。另外胚胎携带色素沉着基因的黄金 ,以方便跟踪亲代DNA遗传隐性突变:母亲在金色的突变纯合携带者和父亲野生型的这种基因。因此,自然二倍体,杂 ,表现出野生型色素沉着,而这两个单倍体(半合子 )和纯合二倍体(纯合子 )表现出突变色素沉着。比例尺= 0.5mm左右。从面板重新修改2会议,转载许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

组件 储存条件
汉克斯解决方案1 8.0克NaCl和
0.4克氯化钾100毫升的DDH 2 O
储存于摄氏 4
汉克斯解决方案2 0.358克无水 Na 2 HPO 4,
0.6克KH 2 PO 4
在100毫升的DDH 2 O
储存于摄氏 4
汉克斯解决方案4 0.72克氯化钙
在50毫升的DDH 2 O
储存于摄氏 4
汉克斯解决方案5 1.23克硫酸镁4∙7H 2 O
在50毫升的DDH 2 O
储存于摄氏 4
汉克的预混料添加,按以下顺序:
10.0毫升解决方案1,
1.0毫升解决方案2,
1.0毫升解决方案4,
86.0毫升ddH 2 O中,1.0 ml溶液5
储存于摄氏 4
汉克斯解决方案6 0.33克碳酸氢钠
在10毫升的DDH 2 O
准备新鲜的试管受精手术的早晨

表1.汉克的溶液的制备。

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Discussion

关键步骤

它是在体外受精的有效条件下工作的关键。为了保证成熟的卵子(步骤1)良好的供应,女性设立交配不应该建立在交配十字架至少5天,应该会出现妊娠。养殖期间中断,观察者能够充分监督15-30坦克天然蛋挤压的首次亮相。交配的中断应​​当第一蛋是通过自然交配释放,以允许最蛋留在女性为体外受精过程内,就会产生可能的。这些女性,目前已准备成熟的卵子人工挤压,可以保持分离长达2小时不会对后续的释放卵子的明显成效。以制备一种有效的精子溶液(步骤2),男性应出现健壮且理想地具有微红色彩,这是繁殖斑马鱼的男性的特征。一个干净的夹层通常包括圣雷莫通过拉向于主体的后部,并且通过向前拉鱼鳔咏肠道轨道。除去中央内脏后,睾丸保持为半透明细长群众沿着内部主体壁的每一侧。避免不必要的包括器官( 肠子)到精子的解决方案;如果需要的话从睾丸通过被放入Hank溶液之前在干燥的培养皿表面的工作分开这些。体外受精(步骤4)中获得高的受精率,至关重要的是,挤出鸡蛋保持主管直至精子加成。鸡蛋胜任施肥表现出略带黄色的色调和是半透明的。避免事先精子除了水什么联系鸡蛋,因为水会触发蛋激活和过早的激活将阻止受精。水活化和施肥应,以避免蛋脱水90秒从阴挤压的内发生,这将导致其降解。如果需要的话,挤出的卵可在100-200微升Hank溶液的补充有保持更长的时间(高达1.5小时以上)0.5%牛血清白蛋白(BSA)17(制备汉克的为这一特定目的的溶液时,制备预混物以校正BSA的补充期间加入水含量)。如果鸡蛋一直保持主管用Hank氏BSA溶液的帮助下,使用微量从卵除去过量汉克的BSA和1分钟内受精。

使用HS2二倍化成功的一个关键步骤是停滞的胚胎(步骤7)的排序。的对称裂解2-细胞胚胎初始排序选择用于胚胎成为受精和开始(在胚胎IVF结果过渡直接从在1至4细胞35-50 MPF偶尔dispermy - 例如胚胎应丢弃)细胞分裂。细胞周期,这些早期胚胎ST中出现的每15分钟年龄(35-50 MPF用于第一细胞周期,50-65 MPF为第二细胞周期,等等),所以排序每个细胞周期的前10分钟内切割胚胎确保周期和准确之间不存在重叠鉴定细胞分裂失速。

修改和故障排除

在步骤3中的紫外线处理的强度( 例如 ,曝光时间,灯功率,在灯的距离)可以在需要通过测试初始受精率以及在没有后续HSII治疗的单倍体的频率进行调整:正确的金额的UV曝光不会对受精率明显的影响导致单倍体胚的100%,而(见代表结果来区分二倍体胚单倍体)。过多的紫外线照射会导致降低受精率可能是由于对精子功能的有害作用,而紫外线照射不足产生二倍体胚胎由于Ť精子DNA邻不完全失活。

如果恢复细胞分裂的(步骤7)后表现出的胚胎发育缺陷或致死,步骤6中的热冲击温度略微降低( 41.0℃),以增加胚胎存活率;这导致异常的3芯大致相等的分数和停滞第二细胞周期中2细胞胚胎(因此接近阈值的中心粒复制的效应)产生最小随后的发育缺陷,并恢复细胞周期后,增加生存的条件。

该方法HS2采用了方便的内在机制,以评估细胞分裂摊位(因此全基因组倍增),因为胚胎的直接观察,因为他们发展使得跟踪各种细胞周期。已经历一细胞周期分裂失速胚胎的手动选择允许产生diploidized胚胎的均匀种群秒。 HS2可以在任何斑马鱼基因品系( AB,Tübingen的,WIK)来进行,如单细胞分裂失速充当内在机制来确认DNA的复制。此外,引入菌株可见的遗传标记可用于促进diploidized胚胎( 图3)的鉴定。例如,从女性是纯合的色素沉着的基因的隐性突变,如白化使用鸡蛋可与来自携带正常的等位基因对于相同的色素沉着的基因的野生型菌株的精子结合。在这种情况下,因为紫外线处理精子不能有助于野生型颜料等位基因,单倍体和纯合二倍体胚表现出隐性颜料突变。此外,纯合二倍体在24 HPF表现出野生型的形态,形成鲜明对比的较少扩展单倍体的形态。产妇隐性性状和整体安莉芳外观的结合Ø形态确认成功套数重复。进一步确认可以通过处理和未处理的胚胎的染色体计数来获得。

上述遗传标记系统,基于隐性可见的遗传标记,也允许在确认的子代缺乏精子来源的DNA的,因为得到的胚显示出野生型的色素沉着仅当精子尚未完全被紫外线处理灭活。在不存在的遗传标记系统的,胚胎的样品可以被允许在没有热休克的发展,以确认所有的胚胎显示出在24高倍视野单倍体形态,因而认为精子DNA灭活完全。在具有完全灭活的精子相结合,这相同的遗传标记系统还可以检测潜在的自发极体失败。这样的事件将导致隐性标记胚胎二倍体形态的外观,而不一个二倍治疗。自发极化波DY故障尚未在斑马鱼中观察到,但在爪蟾热带 18进行报告。如果存在于一个给定的系统中,这种自发事件将必须以最佳地实现倍性操作,以减少或控制了。

该技术的局限性

生产上可行gynogenotes的能力依赖于没有背景的基因变异体,当纯合子是有害的。因此,该过程的成功将取决于所使用的遗传应变而变化。通过雌核发育多代基因的菌株的选择已被证实可以改善存活率1。

的HS2方法,结合使用时,与未处理的精子产生二倍体胚,还允许生产四倍体胚胎在高频率。然而,在这种情况下,由于二倍体对四倍体转化,遗传标记不容易允许全染色体组的确认Ë重复。在这种情况下,在同步胚胎所述一个细胞周期失速的观察和选择停滞的胚胎应保证四倍体选择,以及染色体计数可以用来进一步证实倍性。

相对于现有的/替代的方法意义

尽管40多年前1由Streisinger所描述的,标准的HS方法尚未得到广泛的应用,由于产率低。相反,倍性操作已经几乎完全依赖于替代性和早期的压力,它通过第二次减数分裂的抑制导致倍性重复相对更有效的方法。然而,早期的压力会导致基因纯合9,19,这减轻了其作为遗传工具价值的不同比例。最近的研究表明,HS2,(标准HS协议,即加热脉冲的第一个单元周期期间在不同的时间应用的变形例的22-24强积金期HS2,相比标准HS 12-14 MPF)导致纯合二倍体生产的4倍增产。

热脉冲的作用,可以推断在热休克(22-24 MPF,第一细胞周期期间)的时间,这因此缺乏适当的补充,以产生一个主轴和调解凭借中心粒复制的抑制的发生以下的细胞周期(50-65 MPF,对应于第二细胞周期)期间的细胞分裂。中心粒的复制可以在随后的细胞周期没有热休克的恢复,允许开发精准的细胞周期失速后继续进行。因为中心体复制和DNA复制周期是相互依赖20,DNA复制,即使在在第二细胞周期停滞的分裂正常进行。这导致精确的全基因组的复制和完整纯合。

未来的应用

21多代。

办法类似于HS2可以应用到其他种类与外部受精,即使是那些没有被用作遗传系统。这种方法特别是利用从受精的一段时间,通过卵裂球循环的开始,其中一个热脉冲可能会影响中心粒复制和产生一个精确的细胞分裂失速和全基因组倍增而不产生有害的发育的效果。因此,这种早期的时间段可以被探索热休克灵敏度,开发在其他动物系统的倍性基于操纵遗传方法。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO4-7H2O Sigma 63138
NaHCO3 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4-5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 ml any maker
Ice bucket any maker
Pipetteman P-1000 any maker
Pipette tips 1,000 µl any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
UV lamp UVP Model XX-15 (cat No. UVP18006201) available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)
UV glasses any maker
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
Tea strainer available in kitchen stores
beakers, 250 ml (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
water bath (2) any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)
Hanks’ Solution 1 see above see above 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O. Store at 4°C.
Hanks’ Solution 2 see above see above 0.358 g Anhydrous Na2HPO4, 0.6 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hanks’ Solution 4 see above see above 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O. Store at 4 °C.
Hank's Premix see above see above add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;  1.0 ml Solution 2;  1.0 ml Solution 4;  86.0 ml ddH2O;  1.0 ml Solution 5. Store at 4 °C
Hanks’ Solution 6 see above see above 0.33 g NaHCO3 in 10 ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.
Hank's Solution (final solution) see above see above Combine 990 μl of Hank’s Premix and 10 μl of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)

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References

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