जीन और प्रमोटरों लकड़ी संरचना और माध्यमिक स्टेम विकास में शामिल अध्ययन के लिए प्रेरित दैहिक क्षेत्र के विश्लेषण (आईएसएसए) का प्रयोग करें

Genetics

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Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, E., Van Beveren, K., Tibbits, J., Creux, N., Bossinger, G. The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development. J. Vis. Exp. (116), e54553, doi:10.3791/54553 (2016).

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Abstract

पेड़ों में माध्यमिक स्टेम विकास और संबद्ध लकड़ी गठन के दोनों जैविक और वाणिज्यिक दृष्टिकोण से महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, अपेक्षाकृत कम आणविक नियंत्रण है कि उनके विकास को नियंत्रित करता है के बारे में जाना जाता है। यह शारीरिक, संसाधन और समय सीमाएं अक्सर माध्यमिक विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के साथ जुड़े होने के कारण भाग में है। इन विट्रो तकनीकों का एक नंबर या तो संयंत्र हिस्सा या दोनों वुडी और गैर-वुडी पौधों की प्रजातियों में पूरे संयंत्र प्रणाली को शामिल किया गया है। हालांकि, माध्यमिक स्टेम विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए अपने प्रयोज्यता के बारे में सवाल, कुछ प्रजातियों और श्रम तीव्रता की अवज्ञा अक्सर उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए माध्यम के लिए बैठती है। इसके अलावा, जब माध्यमिक स्टेम विकास और लकड़ी के गठन पर विचार कर रही जांच के तहत विशिष्ट लक्षण केवल औसत दर्जे का एक पेड़ के जीवन चक्र में देर से विकास के कई वर्षों के बाद हो सकता है। विवो पी में इन चुनौतियों विकल्प को संबोधित मेंrotocols विकसित किया गया है, प्रेरित दैहिक सेक्टर विश्लेषण है, जो पौधे की माध्यमिक स्टेम में सीधे ट्रांसजेनिक दैहिक ऊतक क्षेत्रों के सृजन को शामिल नाम दिया है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य जीन और प्रमोटर कार्यात्मक लक्षण वर्णन है कि प्रजातियों के पेड़ की एक श्रृंखला में उपयोग किया जा सकता है के लिए ट्रांसजेनिक माध्यमिक संयंत्र के ऊतकों को बनाने के लिए एक कुशल, आसान और अपेक्षाकृत तेजी से साधन प्रदान करना है। यहाँ प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि ट्रांसजेनिक माध्यमिक स्टेम क्षेत्रों उपजी आसानी से उच्च करने के लिए माध्यम की सुविधा मूल्यांकन किया जा सकता माध्यमिक प्रजातियों के पेड़ और है कि लकड़ी रूपात्मक लक्षण की एक किस्म के तनों में माध्यमिक में प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सभी जीवित ऊतकों और प्रकार की कोशिकाओं में बनाया जा सकता है throughput कार्यात्मक विशेषता।

Introduction

ट्री ग्रहों बायोमास का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल है और विशाल, जैविक, सांस्कृतिक और व्यावसायिक महत्व के हैं उपजा है। माध्यमिक कई अन्य प्रकार के जीवन के लिए संसाधनों और आश्रय प्रदान करके निवास स्थान बनाने उपजा है। वे पारिस्थितिक तंत्र वे निवास और लकड़ी, कागज और लुगदी और अन्य लकड़ी और गैर-लकड़ी के उत्पादों के उत्पादन के लिए एक अक्षय स्रोत के रूप में कार्य करने के लिए कई अन्य सेवाओं उद्धार। माध्यमिक स्टेम विकास और अधिक विशेष रूप से लकड़ी के गठन जटिल आणविक प्रणाली है कि विशेष प्रकार की कोशिकाओं के विकास को विनियमित से नियंत्रित होता है, अपने सेल दीवारों के जैव रासायनिक संरचना और कैसे वे ऊतकों और अंगों के लिए फार्म व्यवस्था कर रहे हैं। माध्यमिक स्टेम विकास और लकड़ी के गठन के आणविक आधार विदारक के भीतर और उपजा के बीच, लंबी पीढ़ी बार, बाहर-पार संभोग प्रणाली, उच्च Heterozygosity, उच्च आनुवंशिक लोड, मौसमी निद्रा, लंबे समय से लकड़ी और स्टेम संपत्तियों की परिवर्तनशीलता सहित कई कारकों से चकित है प्रौढ़विशेषता स्थापना के समय और परिपक्व पेड़ों की सरासर शारीरिक आकार। नतीजतन, संयंत्र विकास की आणविक नियंत्रण के अधिकांश अन्य पहलुओं का विस्तृत ज्ञान के लिए माध्यमिक स्टेम विकास रिश्तेदार की समझ, अपनी प्रारंभिक अवस्था में है।

इन विट्रो तकनीकों का एक नंबर का अध्ययन करने और माध्यमिक स्टेम विकास, विशेष रूप से लकड़ी और माध्यमिक सेल दीवार गठन में समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन प्रोटोकॉल पूरे संयंत्र या संयंत्र हिस्सा प्रणाली, या तो ट्रांसजेनिक पौधों बनाई गई हैं या विशिष्ट माध्यमिक कोशिकाओं या ऊतक लकड़ी और / या माध्यमिक स्टेम विकास 1 के विशिष्ट पहलुओं के अध्ययन के लिए बदल रहे हैं, जहां के इस्तेमाल को शामिल। ट्रांसजेनिक पौधों संयंत्र के ऊतकों और सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता से पद आनुवंशिक परिवर्तन बरामद किया जा सकता है, तथापि, प्रगति धीमी है, खासकर जब लंबे उत्थान के कारण लकड़ी फाइबर लक्षण का विश्लेषण करने और (वर्ष के क्रम में) परिपक्वता बार स्टेम, उच्च तकनीकी और श्रम की मांगडी एस, उम्मीदवार जीन की कम throughput के साथ ही कुछ वुडी पौधों की प्रजातियों के प्रचार में कठिनाइयों। इसी तरह की तकनीक ऐसी Arabidopsis कि सफलतापूर्वक इन सीमाओं से कुछ दूर के रूप में गैर-वुडी मॉडल प्रणाली में विकसित किया गया है, लेकिन सभी माध्यमिक प्रकार स्टेम सेल इन में एक वर्तमान उपजी है और मौसमी या लंबी उम्र से संबंधित लक्षण ऐसी प्रजातियों 2 में अध्ययन नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के Pinu रों radiata घट्टा संस्कृतियों 3 के रूप में संयंत्र पार्ट सिस्टम, एसोसिएटेड समय सीमा को कम। इन विधियों हालांकि एक व्यक्ति के सेल प्रकार के अध्ययन के लिए प्रतिबंधित है और के रूप में इन विट्रो प्रयोगों के लिए विख्यात समान की कमी पीड़ित हैं। इसी तरह, शिखर स्टेम संस्कृतियों 4 पूरे स्टेम explants शामिल वादा दिखाया है लेकिन अभी तक विशिष्ट जीन या ब्याज के प्रमोटरों के अध्ययन के लिए लागू नहीं किया गया है। अभी हाल ही में एक विकल्प के बालों की जड़ संस्कृतियों से जुड़े प्रोटोकॉल नीलगिरी के लिए विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक किया गया हैलागू किया 5, हालांकि, इस पद्धति अभी भी इन विट्रो खेती में की आवश्यकता है, माध्यमिक जड़ों शामिल बजाय उपजी है और तिथि करने के लिए यह एक एकल प्रजातियों के पेड़ तक ही सीमित है।

प्रेरित दैहिक सेक्टर विश्लेषण (आईएसएसए), के रूप में यहाँ वर्णित है, इन समस्याओं को लकड़ी के गठन और माध्यमिक स्टेम ऊतकों के विकास में संदिग्ध भूमिका के साथ जीन और प्रमोटरों के लिए उच्च throughput कार्यात्मक प्रदर्शन उपकरण के लिए एक माध्यम प्रदान करने के कुछ काबू पाने के लिए विकसित किया गया था। आईएसएसए एक Vivo में परिवर्तन और स्क्रीनिंग प्रणाली है जो समय है, जबकि श्रम पर काबू पाने के एक अक्षुण्ण माध्यमिक स्टेम में ट्रांसजेनिक कोशिकाओं और ऊतकों का उत्पादन करने के लिए उठाए कम करने के लिए विकसित किया गया था, नियमित रूप से तकनीकी और throughput सीमाओं इन विट्रो तरीकों में इस्तेमाल किया। माध्यमिक समय की एक छोटी अवधि के भीतर उपजा में प्रजातियों के पेड़ और ब्याज के ऊतकों जी के बिना, प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित स्वतंत्र रूप से बदल ऊतक क्षेत्रों और कोशिकाओं के सैकड़ों के एक साथ निर्माण के लिए अनुमतिअपेक्षाकृत कम समय फ्रेम और कम श्रम लागत के भीतर enetic और / या पर्यावरण परिवर्तन। आईएसएसए इन विवो तकनीकों के बाद पहली बार जीन और / या प्रमोटरों cambial भेदभाव में शामिल है और के अध्ययन के माध्यम से माध्यमिक स्टेम ऊतकों में परिष्कृत किया गया माध्यमिक स्टेम 6 और कली 7 ऊतकों के लिए वर्णित किया गया है और शामिल हैं: tubulin (टब) 8, fasciclin-तरह arabinogalactan ( FLA) 9, सेल्यूलोज synthase (CESA) 10, माध्यमिक सेल दीवार से जुड़े एनएसी डोमेन (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 और वास्तव में दिलचस्प नए जीन (रिंग) एच 2 प्रोटीन 13। इन अध्ययनों से माध्यमिक में आयोजित की गई चिनार और नीलगिरी पौधों और सेल आकृति विज्ञान, कोशिका दीवार रसायन शास्त्र और जीन अभिव्यक्ति में प्रदान की अंतर्दृष्टि की उपजा है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक साथ लाने के लिए अनुभव एक इरादा कर रहे हैंएन डी ज्ञान पिछले एक दशक में प्रकाशित और अप्रकाशित अध्ययन की एक सीमा से विकास और आईएसएसए के आवेदन के माध्यम से प्राप्त की। वे माध्यमिक स्टेम ऊतकों 6 के vivo परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करने और पोपुलस अल्बा 'pyramidalis' क्लोन, नीलगिरी ग्लोबुलस के साथ ही 11 नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camaldulensis क्लोन शामिल अध्ययन पर ध्यान केंद्रित। इस दस्तावेज़ को पौधों और बैक्टीरिया, स्टेम ऊतकों, विकास और ऊतकों की फसल, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं और ऊतकों की पहचान, प्ररूपी आकलन और संग्रह और डेटा के विश्लेषण के लिए तरीकों के लिए तैयार करने के परिवर्तन की खेती से प्रोटोकॉल के माध्यम से शोधकर्ताओं लेता है। तकनीक को सफलतापूर्वक अंतरिक्ष सीमाओं के कारण भी कोशिका दीवार मोनोसैकराइड रचना को मापने के लिए 9,11, लागू किया गया है, वहीं इस दस्तावेज़ माध्यमिक सेंट में सेल और ऊतक आकृति विज्ञान मापने और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को समझने के लिए इस्तेमाल की तकनीक पर ध्यान केंद्रितईएमएस ही। तदनुसार, प्रोटोकॉल के रूप में रेखांकित उच्च throughput विधि करने के लिए एक कम लागत, तकनीकी रूप से आसान है, और माध्यम का उपयोग कर उपजी माध्यमिक से जुड़े भूमिका और / या जीनों की अभिव्यक्ति में आगे अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए देख रहे लोगों के लिए अनुकूल है।

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Protocol

1. संयंत्र सामग्री की तैयारी

  1. प्रयोग करने से पहले, बीज या काटने से वरीय प्रजातियों के पेड़ की नई पौध उठाते हैं और जब तक क्षेत्र प्रयोग के लिए इरादा में स्टेम के व्यास व्यास में लगभग 1 सेमी है बढ़ने पेड़ / एस।
    नोट: समय भिन्न हो सकते हैं के कारण संयंत्र विकास दर इसलिए इस कदम के लिए तीन से नौ महीने के बीच की अनुमति देने की जरूरत है।

2. द्विआधारी वेक्टर निर्माण

  1. इस खंड से कार्य का संचालन एक प्रयोगशाला या ग्रीनहाउस जहां Agrobacterium tumefaciens संभाला जा सकता है और कहा कि उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण प्रयोगशाला के लिए निर्धारित में धारा 7 के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. एक द्विआधारी या तो ब्याज पछाड़ना या overexpression कैसेट और एक β-glucuronidase (गस) पत्रकार जीन कैसेट की एक जीन या अध्ययन के प्रकार पर निर्भर करता है एक गस जीन से जुड़े हुए ब्याज की एक प्रमोटर युक्त वेक्टर तैयार करें।
    नोट: द्विआधारी वेक्टर बीएसी की संख्या में रहे हैंkbones कि व्यावसायिक या sourced किया जा सकता बाइनरी वैक्टर में जीन और ब्याज के प्रमोटरों डालने के लिए उपलब्ध अनुसंधान नेटवर्क के साथ ही कई तकनीकों के माध्यम से। इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में प्रयोगकर्ता कैसे एक द्विआधारी वेक्टर बनाने के लिए पर निर्णय करने के लिए पर निर्भर है।
  3. के एक निरस्त्र तनाव में द्विआधारी वेक्टर रूपांतरण electroporation या गर्मी झटका 14 का उपयोग और उचित रूप से स्टोर तक प्रयोग के लिए आवश्यक tumefaciens।
  4. किसी भी सकारात्मक और / या नकारात्मक नियंत्रण के लिए कदम दोहराएँ 2.2।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण एक द्विआधारी ब्याज अध्ययन के एक जीन और ब्याज अध्ययन के एक प्रमोटर के लिए एक promoterless गस के लिए ब्याज की कोई जीन युक्त वेक्टर शामिल करना चाहिए। ब्याज अध्ययन के एक प्रमोटर के लिए सकारात्मक नियंत्रण एक फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35s प्रमोटर (CaMV35s) एक गस रिपोर्टर से जुड़े हुए शामिल करना चाहिए।

3. की तैयारी टीका के लिए tumefaciens

  1. अनुभव करने के लिए कम से कम एक सप्ताह से पहलेimentation, की एक छोटी राशि (लगभग 1 μl) ले कदम 2.2 और 2.3 के दौरान तैयार किए गए और 14 बैक्टीरियल चयन के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटें अगर साथ अलग लेग माध्यम पर बारीकी से फैल tumefaciens। एक मशीन में 28 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें छोटी कालोनियों के रूप में और फिर 4 पर दुकान सी ° तक की जरूरत है।
  2. 48 घंटे के प्रयोग करने से पहले, के एक कॉलोनी का स्थानांतरण अलग 50 मिलीलीटर में प्रत्येक थाली से tumefaciens पूर्व गर्म (28 डिग्री सेल्सियस) लेग मीडिया 14 बैक्टीरियल चयन के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त और 200 rpm पर जब तक 28 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 48 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर पर आंदोलन की 5 मिलीग्राम से युक्त शीर्ष ट्यूबों के पेंच मिश्रण हल्की है।
  3. बीच 4-6 मानव संसाधन संयंत्र की टीका करने से पहले उपजा है (धारा 4) पौंड / के 1 मिलीलीटर जोड़ें एक ताजा 50 मिलीलीटर में tumefaciens मिश्रण के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ नए सिरे से गर्म (28 डिग्री सेल्सियस) के 19 मिलीलीटर (1:20 कमजोर पड़ने) युक्त शीर्ष ट्यूब लेग मीडिया पेंचबैक्टीरियल चयन। तो 600 एनएम (600 आयुध डिपो, के रूप में स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है) पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 0.1 से ऊपर है, गर्म पौंड के साथ आगे पतला जब तक यह हासिल की है।
  4. जगह पतला पौंड / ए tumefaciens मिश्रण वापस प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर पर और एक ही परिस्थितियों में मिलाने (200 आरपीएम, 28 डिग्री सेल्सियस) 600 आयुध डिपो तक 0.4-0.6 और हटाने के बीच है।
  5. अपकेंद्रित्र पौंड / 1,000 XG पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए tumefaciens मिश्रण।
  6. तरल छानना और तुरंत resuspend tumefaciens गोली के 1 मिलीलीटर ठंडा में एमएस मीडिया 15, 2 मिलीलीटर microtube को हस्तांतरण और बर्फ पर दुकान तक टीका (धारा 4) के लिए जरूरी है। यह समाधान टीका मीडिया के रूप में जाना जाता है।

4. संयंत्र का टीका के साथ स्टेम tumefaciens

  1. देर से वसंत या गर्मियों की शुरुआत खंड 1 में बनाया पौधों एक सक्रिय और तेजी से बढ़ केंबियम है कि उपयोग करने के दौरान प्रयोग शुरू करें। एक के लिए एक अच्छा नैदानिकसक्रिय और तेजी से बढ़ केंबियम कि फ्लोएम आसानी से जाइलम से खुली किया जा सकता है।
  2. संयंत्र के आधार के पास स्टेम का एक स्पष्ट सीधे अनुभाग का पता लगाएं और किसी भी पत्ते और शाखाओं को हटा दें।
  3. एक तेज छुरी (अधिमानतः नंबर 11) या धार का प्रयोग, लंबाई में 20 मिमी और एक 5 मिमी फ्लोएम के माध्यम से दो खड़ी समानांतर चीरा के अलावा उसके बाद एक शुरू करने से स्टेम का एक स्पष्ट अनुभाग में एक 1 सेमी 2 'cambial खिड़की' बनाने क्षैतिज कटौती उनके बेसल अंत में दो खड़ी कटौती जोड़ता है।
  4. पील फ्लोएम चीरा ऊपर की तरफ विकासशील जाइलम ऊतक को प्रकाश में लाने और उजागर विकासशील जाइलम एक पिपेट (आमतौर पर 5-10 μl) का उपयोग करने की सतह गीला करने के लिए कदम 3.6 से पर्याप्त टीका मीडिया को जोड़ने के द्वारा बनाई गई पट्टी। इसके तत्काल बाद फ्लोएम पट्टी डालें।
  5. स्टेम Parafilm के साथ कसकर को फ्लोएम पट्टी बाँध।
  6. दोहराएँ ब्याज एक बनाने के जीन (ओं) या प्रमोटर (एस) के लिए किसी भी अतिरिक्त cambial खिड़कियों के लिए 4.5 करने के लिए 4.2 कदमएनवाई नया cambial खिड़कियां कम से कम ऊपर या अन्य cambial खिड़कियों के नीचे और एक 90 डिग्री ऑफसेट पर 1 सेमी।
  7. पूर्ण कदम सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण वैक्टर (2.4 चरण) सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक वेक्टर प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक संयंत्र की एक ही स्टेम करने के लिए जोड़ा जाता है के लिए 4.5 के लिए 4.2।
  8. स्टेम व्यास विकास समय समय पर और गस परख के लिए फसल (धारा 5) जब कम से कम 5 मिमी के रेडियल विकास तनों में देखा गया है की निगरानी।
    नोट: रेडियल विकास की राशि की जरूरत ऊतक की राशि बहाव के विश्लेषण के लिए आवश्यक पर निर्भर है।

5. गस ऊतकीय परख के लिए कटाई

  1. आबकारी स्टेम से 'cambial खिड़की' किसी भी ऊतक cambial खिड़की के भीतर नए विकास का हिस्सा नहीं हटा।
    1. जाइलम और फ्लोएम सेल / ऊतक आकृति विज्ञान परिपक्व करने के लिए संबंधित अध्ययन के लिए, जाइलम से फ्लोएम छील।
    2. अध्ययनों से जहां cambial जोन बरकरार या प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न रहने के लिए आवश्यक है के लिए आकलन किया जा रहे हैंएड, transversely एक रेजर ब्लेड या मोटाई में 0.5 और 1 के बीच मिमी डिस्क में अन्य तेज ब्लेड का उपयोग cambial खिड़की टुकड़ा।
  2. 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब में संसाधित cambial खिड़की ऊतकों की जगह और 7 से 14 पीएच 0.1 एम फॉस्फेट बफर में दो बार कुल्ला। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से डूबे हुए है, कम से कम पांच मिनट के लिए समाधान में रहता है और सभी अतिरिक्त समाधान के अंत में निकाल दिया जाता है दूसरी कुल्ला।
  3. गस अभिकर्मक (0.5 मिमी एक्स-gluc (5 ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl-β-D-glucuronic एसिड), 10 मिमी EDTA, 0.5% ट्राइटन X-100 वी / वी, 0.5 मिमी पोटेशियम के 5 मिलीलीटर जोड़ें देख हॉकिन्स एट अल 16) प्रत्येक ट्यूब; ferricyanide (तृतीय), 0.05 मिमी पोटेशियम ferrocyanide (द्वितीय), अप करने के लिए अंतिम मात्रा 0.1 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच 7 के साथ बनाया है। अगर ऊतक पूरी तरह से जलमग्न नहीं है, अतिरिक्त गस अभिकर्मक जोड़ें।
  4. अंधेरे में 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों को सेते हैं।
  5. अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर पर एक और 12-16 घंटे के लिए ट्यूबों सेतेकोमल आंदोलन का उपयोग कर (30 आरपीएम के बीच और 60) के मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए।
  6. एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर से हटाने पर बेतरतीब ढंग से एक पीएच रेंज 0-7 से लिटमस पेपर का उपयोग ट्यूबों के एक छोटे सबसेट में गस अभिकर्मक के पीएच की जाँच करें।
    1. ट्यूबों के किसी भी 6 के नीचे एक पीएच है तो उन्हें लेबल। नलियों के शेष की जांच करने के लिए पीएच की पुष्टि करें और यदि पीएच 6 या नीचे है लेबल करने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: 6 के नीचे एक पीएच के साथ नमूने के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। इन नमूनों आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाना है।
  7. गस अभिकर्मक छानना और ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त 70% इथेनॉल के साथ बदलें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर की जरूरत है जब तक।

6. ट्रांसजेनिक ऊतक की पहचान

  1. संदंश का प्रयोग, सूक्ष्म दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए एक ट्यूब और छोटे ट्रे या पेट्री डिश में जगह से सभी cambial खिड़की ऊतक बाहर ले।
  2. 1X और 4X बढ़ाई बीच एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, की पहचान करने और कोशिकाओं या ऊतकों की संख्या मिलानकि एक चमकदार नीली धुंधला है। ब्लू दाग कोशिकाओं या ऊतक इस बिंदु के बाद से एक क्षेत्र के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। उन्हें निम्न तरीकों से मिलान।
    1. नमूने जहां फ्लोएम हटा दिया गया है (कदम 5.1.1) के लिए, विकासशील जाइलम (cambial क्षेत्र, चित्रा 1 ए) की सतह पर पाया cambial ऊतक में क्षेत्रों की संख्या गिनती।
    2. नमूने है कि डिस्क (5.1.2 कदम) में कटौती की गई है के लिए, संख्या क्षेत्रों के लिए अलग सेल या प्रकार के ऊतकों में पाया (चित्रा 1 बी, 1C, 1 डी) गिनती। क्षेत्रों में निम्नलिखित प्रकार के ऊतकों में पाया जा सकता है: periderm (periderm क्षेत्र, चित्रा 1E), फ्लोएम (फ्लोएम क्षेत्र, चित्रा 1F), cambial ऊतक (cambial क्षेत्र, चित्रा 1 जी, 1h, 1 मैं), घाव पैरेन्काइमा (घाव पैरेन्काइमा सेक्टर, चित्रा 1J) और tyloses में (Tylose क्षेत्र, चित्रा 1K)।
      1. सूक्ष्म एक के दौरानसुनिश्चित ssessment कि एक डिस्क के दोनों पक्षों को देखा गया है और क्षेत्रों है कि दो डिस्क के पार होते मिलान कर रहे हैं कि इतने कि संख्या overestimated नहीं कर रहे हैं।
  3. केवल ऊतक युक्त क्षेत्रों में 70% इथेनॉल और दुकान से युक्त जब तक की जरूरत ट्यूब में वापस जगह है।
  4. सकारात्मक और / या नकारात्मक नियंत्रण सहित किसी भी अतिरिक्त cambial खिड़कियों के लिए 6.3 करने के लिए कदम दोहराएँ 6.1।
  5. 1 सेमी 2 cambial खिड़कियों की कुल संख्या से सेक्टरों की कुल संख्या को विभाजित एक औसत केंबियम के 2 सेमी प्रति परिवर्तन की घटनाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए अलग से प्रत्येक जीन या ब्याज के प्रमोटर और नियंत्रण के लिए प्रत्येक क्षेत्र प्रकार के लिए औसत परिवर्तन दक्षता की गणना टीका (ATScm -2)।
  6. प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण के लिए 7.2 और 8 कदम और कदम 7.1, तकनीक cambial ऊतक में सेल और ऊतक आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए 7.2 या 7.3 करने के लिए आगे बढ़ें।

7. का विश्लेषणCambial ऊतक में सेल और ऊतक आकृति विज्ञान

नोट: नीचे है कि आईएसएसए के विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है तकनीकों का एक चयन कर रहे हैं नमूनों निकाली गई।

  1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग जाइलम सेल क्षेत्र, लुमेन क्षेत्र, सेल दीवार मोटाई और सेल दीवार क्षेत्र का विश्लेषण।
    नोट: इस प्रोटोकॉल न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता है और उल्लिखित रूपात्मक लक्षण से संबंधित क्षेत्र के विश्लेषण के अपेक्षाकृत उच्च throughput के लिए अनुमति देता है।
    1. इस कदम के बाद से प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा सुनिश्चित करें और दस्ताने इस्तेमाल कर रहे हैं, जब भी वुडी ऊतक संभाला जा रहा है और इलाज किया।
    2. विश्लेषण के लिए एक cambial क्षेत्र को पहचानें और एक चीरा इसके बारे में दोनों ओर से लगभग 0.5 मिमी एक डिस्क (चित्रा 2A) बनाने के लिए एक एकल बढ़त रेजर ब्लेड का उपयोग कर सकते हैं।
    3. (चित्रा 2 बी) के अतिरिक्त जाइलम ऊतक बंद ट्रिम क्षेत्र की स्पर्शरेखा ओर करने के लिए जाइलम ऊतक के लगभग 1 मिमी छोड़ने।
    4. सावधानLy एक ताजा डबल धार धार (चित्रा 2 सी) का उपयोग क्षेत्र के केंद्र के माध्यम transversely कटौती।
    5. ट्रांसजेनिक ऊतक (चित्रा 2 डी) हदबंदी करना अनुप्रस्थ विमान या तो क्षेत्र की तरफ दो अतिरिक्त उथले रेडियल चीरों बनाओ। गस धुंधला ऊतक में गहरी पैठ नहीं होगा जैसा कि cambial सतह पर पाया दाग ऊतक के दोनों ओर से कोशिकाओं के रेडियल फाइलों के साथ पालन करें।
    6. एक SEM पिन ठूंठ के चरण के लिए तैयार cambial क्षेत्र चेहरे संलग्न SEM प्रवाहकीय टेप (चित्रा 2 ई) का उपयोग माउंट और जब तक SEM दृश्य के लिए की जरूरत desiccator में रहते हैं।
    7. दोहराएँ कदम 7.1.2 नकारात्मक नियंत्रण से उन सहित किसी भी अतिरिक्त क्षेत्रों के लिए 7.1.6 करने के लिए।
    8. एक कम निर्वात मोड में एक SEM का उपयोग (ऊर्जा 5 केवी, 3.0 एनएम स्थान), कल्पना और क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं / ऊतक की तस्वीरें के साथ ही कोशिकाओं / ऊतक सीधे सटे क्षेत्र (चित्रा 2 एफ) ले। की राशि बढ़ाईब्याज की सुविधाओं पर निर्भर है। जाइलम फाइबर के लिए, 2,000X उपयुक्त (चित्रा 2 जी) है।
    9. एक बार एक cambial क्षेत्र कल्पना की गई है और तस्वीरों के लिए एक उपयुक्त बढ़ाई लिया, छवि को मापने के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ब्याज की जाइलम सेल / ऊतक रूपात्मक लक्षण उपाय।
    10. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कई जोड़ो में विश्लेषण बनती टी परीक्षण का उपयोग कर ट्रांसजेनिक क्षेत्र और आसन्न गैर ट्रांसजेनिक नियंत्रण कक्षों / ऊतक प्रत्येक क्षेत्र एक पी निर्धारित करने के लिए (सेक्टर किनारे से 0.5 मिमी के भीतर मापा जाता है) में मापा जाता रूपात्मक के बीच अंतर की तुलना करने का वचन -value।
    11. नकारात्मक नियंत्रण के लिए कदम दोहराएँ 7.1.10।
      1. मामलों में जहां सकारात्मक नियंत्रण एक कम पी मूल्य (α <0.05) से पता चलता है, ट्रांसजेनिक और एक रूपात्मक विशेषता के लिए आसन्न गैर ट्रांसजेनिक कोशिकाओं / ऊतक के बीच अंतर की गणना। negat के साथ ब्याज की जीन के प्रभाव की तुलना करना एक unpaired टी परीक्षण में इस 'अंतर मूल्य' का प्रयोग करेंएक पी मूल्य निर्धारित करने के लिए नियंत्रण ive।
  2. स्टेम कोशिकाओं / प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग ऊतकों में cambial सेल / ऊतक आकृति विज्ञान या प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के histochemical विश्लेषण।
    नोट: एक ओर जहां अधिक समय लगता है, इस विधि cambial गतिशीलता, जैसे, cambial चौड़ाई के साथ ही प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के पहलुओं सहित अधिक विश्लेषण के विकल्प के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, अगर एक SEM का उपयोग करने में असमर्थ है, इस प्रोटोकॉल कदम 7.1 के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. धार का उपयोग ब्याज की आबकारी क्षेत्र और कुछ आसपास के 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 दिनों के लिए पेंच टोपी के साथ एक नमूना शीशी में 1-3 100 मिलीलीटर% इथेनॉल में छोटे ब्लॉकों के रूप में ऊतक (कोई 1 मिमी से अधिक 3) और जगह सीधे एक प्रकार के बरतन पर। एक तरीका है कि ब्याज की सतह के लिए अनुमति देगा एक microtome द्वारा पहुँचा जा करने के लिए छोटी सी ब्लॉक तैयार करें।
    2. नकारात्मक नियंत्रण से उन सहित किसी भी अतिरिक्त क्षेत्रों के लिए दोहराएँ।
    3. तरल निकालें और 2 के साथ बदलें5% इथेनॉल: 2 दिनों की स्थिति को बनाए रखने के लिए 75% एलआर सफेद मिश्रण।
    4. 50% इथेनॉल के साथ दोहराएँ कदम 7.2.3: 50% एलआर सफेद, 25% इथेनॉल: 75% एलआर सफेद और फिर 100% एलआर सफेद रंग के साथ अंत में दो बार।
    5. छोटे अंत करने के लिए गठबंधन ब्याज की सतह के साथ मोल्ड एम्बेड में छोटी सी ब्लॉक प्लेस और ध्यान ताजा एलआर सफेद के साथ कवर और निर्माता के निर्देशों के अनुसार भाजन।
    6. एक रोटरी microtome पर ब्याज की सतह से 5 माइक्रोन वर्गों में कटौती और एक गिलास स्लाइड पर माउंट। सेल की दीवार और / या अन्य सुविधाओं कल्पना करने के लिए सैफरैनीन हे (0.01%) धुंधला का प्रयोग करें।
    7. बढ़ते मीडिया जोड़ें एक कवर पर्ची जगह और रात में स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    8. 100X और 600x बढ़ाई और कब्जा छवि के बीच एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखें।
    9. छवि को मापने सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों से रूपात्मक लक्षण कब्जा।
      1. मात्रात्मक रूपात्मक लक्षण के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कदम 7.1.10 से पर का पालन करें।
      2. रूपात्मक लक्षण के गुणात्मक विश्लेषण के लिए,तुलना और जीन या ब्याज के प्रमोटर और नकारात्मक और / या सकारात्मक नियंत्रण के लिए मनाया पैटर्न का वर्णन है।
  3. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग macerated फाइबर में सूक्ष्मतंतु कोण (एमएफए) का विश्लेषण।
    1. आबकारी ट्रांसजेनिक जाइलम एक क्षेत्र के साथ ही गैर ट्रांसजेनिक ऊतक इससे सटे से सीधे ऊतक और अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जगह (0.5 मिमी, चित्रा 2 घंटे के भीतर)। नकारात्मक नियंत्रण से उन सहित किसी भी अतिरिक्त क्षेत्रों के लिए दोहराएँ।
    2. पूर्ण कदम एक धूआं हुड में 7.3.5 के लिए 7.3.3।
    3. हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 250 μl और प्रत्येक ट्यूब हिमनदों एसिटिक एसिड के 250 μl जोड़ें।
    4. धूआं हुड में 2 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ब्लॉक में ट्यूब रखें।
    5. ट्यूब से ऊतक निकालें और ध्यान में कम से कम दो बार आसुत पानी से कुल्ला।
    6. एक पानी में घुलनशील बढ़ते मीडिया का उपयोग करना, एक गिलास स्लाइड पर ऊतक माउंट और एक कवर पर्ची affixing से पहले तेज संदंश के साथ के अलावा तंग।
    7. राय400X से अधिक बढ़ाई व्यक्तिगत फाइबर का एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और छवियों पर कब्जा के तहत।
    8. फाइबर की सूक्ष्मतंतु कोण का निर्धारण करने के लिए, गड्ढे छिद्र और / या सेल दीवार स्त्रिअतिओन्स और फाइबर (चित्रा 2i) छवि को मापने के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की लंबी अक्ष के बीच के कोण को मापने।
    9. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कदम 7.1.10 से पर का पालन करें।

8. प्रमोटर के विश्लेषण अभिव्यक्ति पैटर्न

  1. माध्यमिक स्टेम ऊतकों में प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण।
    1. ब्याज के प्रमोटर के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रत्येक क्षेत्र प्रकार की आवृत्ति टैली के रूप में कदम 6.2.2 में उल्लेख किया।
    2. ची-वर्ग परीक्षण का उपयोग कर पी मूल्यों की स्थापना के लिए सकारात्मक नियंत्रण के साथ ब्याज की प्रमोटर के लिए अलग-अलग सेक्टर प्रकार की आवृत्ति की तुलना करें। सेल / ऊतक विशिष्टता के आगे विश्लेषण कदम 7.2 के रूप में आवश्यक का उपयोग किया जा सकता है।
      1. एक से अधिक प्रमोटर हैंब्याज की तो ब्याज के सभी प्रमोटरों और सकारात्मक नियंत्रण के बीच इस तुलना विश्लेषण कर दोहराने की जांच की जा रही है।
      2. क्षेत्रों या नीले धुंधला नकारात्मक नियंत्रण में मनाया जाता है तो विश्लेषण करने के लिए इस जोड़ने या सीमा पर निर्भर करता है या यदि अंतर्जात धुंधला संदेह है (चर्चा देखने के लिए) का परित्याग।
  2. Cambial व्युत्पन्न विकास और भेदभाव के दौरान प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण।
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सभी cambial क्षेत्रों (चित्रा 1 जी, 1h, 1 मैं) 6.2 कदम में पहचान की कल्पना और उपस्थिति / केंबियम से निकाली गई तीन ऊतकों के प्रकार में नीले रंग धुंधला की अनुपस्थिति का निर्धारण; फ्लोएम (पी), जाइलम (X1) या विकसित जाइलम ऊतक (X2) के विकास (चित्रा 3A देखें)।
    2. कदम 8.1.2 के अनुसार, पूर्णांक के प्रमोटर के पी, X1 और X2 क्षेत्रों में गस धुंधला की उपस्थिति / अनुपस्थिति की आवृत्ति की तुलनाची-वर्ग परीक्षण का उपयोग कर पी मूल्यों की स्थापना के लिए सकारात्मक नियंत्रण के साथ erest। सेल / ऊतक विशिष्टता के आगे विश्लेषण कदम 7.2 के रूप में आवश्यक का उपयोग किया जा सकता है।
      1. कदम 8.1.2.1 और 8.1.2.2 अतिरिक्त विचार के लिए देखें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के सभी लाइव माध्यमिक स्टेम सेल और ऊतक प्रकार दिखाया गया है का उपयोग करते हुए के लिए अतिसंवेदनशील होना परिवर्तनों tumefaciens और शुरू में तब्दील सेल प्रकार के आधार पर क्षेत्र के प्रकार और यह बाद में विकासात्मक विकास पैटर्न में परिभाषित किया गया है। सेक्टर प्रकारों periderm, फ्लोएम, cambial, घाव पैरेन्काइमा और tylose (चित्रा 1 बी, 1C, 1 डी) में शामिल हैं और पाया जा सकता है में लगातार स्थानों इस पैरा के शेष में वर्णन है। एक periderm क्षेत्र periderm में विशेष रूप से और कभी नहीं मिला फ्लोएम (चित्रा 1E) में विस्तार बदल कोशिकाओं के एक समूह के शामिल हैं। एक फ्लोएम सेक्टर की शुरुआत परत और periderm के बीच विभिन्न स्थानों पर पाया जा सकता है, तथापि, कभी इन आसपास के ऊतकों (चित्रा 1F) में विस्तार। एक cambial क्षेत्र तब्दील जाइलम / केंबियम / फ्लोएम Tran से निकाली गई ऊतकों के शामिल हैcambial प्रारंभिक और के sformation तीन अलग पैटर्न में हो सकता है: दोनों रे युक्त i) 'पूर्ण' cambial क्षेत्र, तब्दील जाइलम / cambial / फ्लोएम कोशिकाओं फ्लोएम ऊतकों को जाइलम और cambial क्षेत्र के माध्यम से घाव पैरेन्काइमा ऊतक की सीमा से देने और तकली जैसा कोशिकाओं या रे तत्वों केवल (चित्रा 1G), ii) 'खो प्रारंभिक' cambial क्षेत्र, पूर्ण cambial क्षेत्र का एक संस्करण है, जहां एक प्रारंभिक नजर आता है जाइलम और फ्लोएम क्षेत्रों और एक untransformed की शुरुआत परत छोड़ शुरुआत परत से खो गया है (चित्रा 1 ज), और iii) 'जाइलम केवल' cambial क्षेत्र, तब्दील जाइलम ऊतक नवगठित xylogenic ऊतक में चर लंबाई करने के घाव पैरेन्काइमा ऊतक की सीमा से बढ़ा है लेकिन कभी भी शुरुआत परत (चित्रा 1 मैं) तक पहुंच गया। एक घाव पैरेन्काइमा क्षेत्र तब्दील हो, अक्सर रेडियल fil में या तो एक व्यक्ति या सेल कोशिकाओं के समूह के रूप में पाया घाव पैरेन्काइमा सेल शामिलes, पूर्व मौजूदा लकड़ी और नवगठित जाइलम ऊतक (चित्रा 1J) के बीच स्थित है। एक tylose सेक्टर तब्दील पोत पूर्व मौजूदा लकड़ी के भीतर पाया tyloses के शामिल (चित्रा 1K)।

दोनों जीन और ब्याज के अध्ययन के साथ ही उनके सकारात्मक नियंत्रण के प्रमोटर के लिए प्रतिनिधि परिवर्तन दक्षता डेटा तालिका 1 और 2 टेबल में प्रस्तुत किया है। डेटा दो बड़े ही जीनोटाइप में एक ही समय अवधि (दिसम्बर-अप्रैल) के पार किए गए परीक्षणों से तैयार की गई है नीलगिरी और चिनार लगातार दो साल भर में लकड़ी के गठन के जीन और ब्याज के प्रवर्तकों में से एक नंबर शामिल हैं। ब्याज अध्ययन के प्रमोटर से सकारात्मक नियंत्रण पर ध्यान केंद्रित (तालिका 2), के लिए सबसे अधिक अतिसंवेदनशील ऊतक प्रकार tumefaciens टी डीएनए हस्तांतरण लगभग 60% के साथ cambial ऊतकों और क्षेत्र में क्रमश: नीलगिरी और चिनार में पहचान का 40% हैcambial सेक्टरों जा रहा है। नीलगिरी में, अगले सबसे प्रचुर मात्रा में सेक्टर प्रकार 35% पर पैरेन्काइमा घाव है, जबकि अन्य क्षेत्र प्रकार के सभी 5% से नीचे ATScm -2 मूल्यों था। चिनार में, अगले सबसे प्रचुर मात्रा में सेक्टर प्रकार 15% से कम फ्लोएम के द्वारा पीछा 20% पर पैरेन्काइमा घाव जबकि सेक्टर प्रकारों के शेष 5% नीचे एक आवृत्ति पर पाया गया है। साथ ही एक cambial खिड़की में एक क्षेत्र खोजने cambial क्षेत्रों की पहचान की अधिक से अधिक संख्या के एक उच्च संभावना विशिष्ट हैं जहां फ्लोएम छील प्रोटोकॉल (तालिका 1, चरण 5.2.1) धुंधला करने के लिए क्षमता और संभावना कल्पना करने के कारण किया गया है केंबियम के पूरे क्षेत्र।

इन प्रोटोकॉल के विकास के दौरान चर की संख्या प्रोटोकॉल अनुकूलन परीक्षणों के भाग के रूप में पता लगाया गया। टीका मीडिया, मीडिया प्रकार में ये शामिल बैक्टीरियल एकाग्रता टीका मीडिया, टीका मीडिया, ऊतक उम्र और एक को Acetosyringone के अलावा में इस्तेमाल किया। tumefaciens तनाव के साथ ही टीका और जीनोटाइप का समय है। Cambial सेक्टर -2 ATScm इन परीक्षणों से डेटा टीका में बैक्टीरिया की एकाग्रता में वृद्धि 3 टेबल और तालिका 4 में प्रस्तुत किया है। जांच चर का बहुमत है, जब बदल दिया, cambial ATScm में परिवर्तन -2 दोनों प्रजातियों में नेतृत्व करने के लिए और विशेष रूप से शामिल मीडिया, टीका मीडिया में एमएस के उपयोग और के चुनाव tumefaciens तनाव। इसके अलावा, टीका और पेड़ जीनोटाइप के समय दिखा सभी महीनों संयुक्त भर में दूसरों के लिए उच्च ATScm -2 नीलगिरी क्लोन SG21 और SG44 उच्च cambial से पता चला है, जबकि ATScm -2, 41.6 और 40.4, क्रमशः तुलना में गर्मियों की शुरुआत में inoculations के साथ नीलगिरी में काफी अंतर दिखाया।

औसत cambial सेक्टर आकार बदलता है और एक cambial विंडो में अपने स्पर्शरेखा और रेडियल विकास की राशि पर निर्भर है। एक उप मेंचिनार में 53 क्षेत्रों के लगभग 4 महीने के लिए उगाया का नमूना, केंबियम में सेक्टरों की स्पर्शरेखा चौड़ाई 0.09 और 0.27 मिमी औसत के साथ 0.58 मिमी के बीच विभिन्न जबकि cambial खिड़कियों 1.35 की औसत से 0.7 से 2.2 मिमी तक बताया भर में रेडियल विकास मिमी। जब संयुक्त, इन विश्लेषण के लिए 0.063 मिमी 2 और 1.276 मिमी 2 ट्रांसजेनिक ऊतक के बीच प्रदान की है। एक ही प्रजाति के 188 क्षेत्रों में से एक और subsample, जहां cambial खिड़की के पार रेडियल विकास की 1.5-4 मिमी से अधिक के बीच लगभग 5 महीने में मनाया गया, औसत क्षेत्र में बड़े पैमाने पर 72 माइक्रोग्राम (5 तालिका) था।

बनाया ट्रांसजेनिक ऊतक की राशि पर्याप्त कोशिकाओं और / या के रूप में अच्छी तरह से रूपात्मक मापन का कार्य प्रमोटर गतिविधि के अध्ययन के लिए के लिए ऊतक प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, तीन नीलगिरी के प्रभाव जाइलम फाइबर रूपात्मक लक्षण 9 पूर्व था की एक संख्या पर FLAs grandis नीलगिरी क्लोन में plored और सेल आकार दृढ़ संकल्प (तालिका 6) में एमएफए निर्धारण में EgrFLA2 और EgrFLA1 के लिए संभव भूमिकाओं का पता चला। इसके अलावा, नीलगिरी की अभिव्यक्ति के पैटर्न grandis विकासशील जाइलम (X1) में CESA जीन प्रमोटर, विकसित जाइलम (X2) और फ्लोएम (पी) EgrCESA1, 2, 3, और EgrCESA4, 5, 7 के बीच 10 की पहचान काफी अलग अभिव्यक्ति पैटर्न ऊतकों नीलगिरी में उपजा है। इस विश्लेषण, EgrCESA1, 2, 3 मुख्य रूप से जाइलम ऊतक के विकास, जबकि EgrCESA4, 5, 7 विकासशील जाइलम और फ्लोएम ऊतक (चित्रा 3 बी, टेबल 7) दोनों में व्यक्त किया जा करने के लिए दिखाया गया में व्यक्त किया जा करने के लिए दिखाया गया है। सभी EgrCESA प्रमोटरों सकारात्मक नियंत्रण (CAMV35S प्रमोटर) (तालिका 7) करने के लिए काफी अलग अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चला है।

4553 / 54553fig1.jpg "/>
चित्रा 1:। ट्रांसजेनिक क्षेत्रों प्रकार (क) cambial क्षेत्रों फ्लोएम छील प्रोटोकॉल (कदम 5.2.1) का उपयोग प्रसंस्करण के बाद उजागर जाइलम की सतह पर देखा के रूप में। चिनार (ख) में की अनुप्रस्थ सतह और नीलगिरी (ग) अनुप्रस्थ कटौती प्रोटोकॉल (कदम 5.2.2) का उपयोग प्रसंस्करण के बाद उपजी पर सेक्टर प्रकार की एक सीमा दिखा डिस्क। (घ) संयंत्र तनों में पाया सेक्टर प्रकारों की सीमा के योजनाबद्ध आरेख। Periderm क्षेत्र (ई), फ्लोएम क्षेत्र (च), 'पूर्ण' cambial क्षेत्र (जी), 'खो प्रारंभिक' cambial क्षेत्र (ज), 'जाइलम केवल' cambial क्षेत्र (i), घाव पैरेन्काइमा क्षेत्र (जे) के उदाहरण और tylose क्षेत्र (कश्मीर) चिनार में। काला तीर से संकेत मिलता है जहां छोटे आकार क्षेत्र में स्थित हैं। सभी पैमाने सलाखों = 1 मिमी।Iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। SEM और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग रूपात्मक विश्लेषण के लिए cambial सेक्टरों की तैयारी (एक) डिस्क युक्त क्षेत्र के छांटना। (ख) डिस्क अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए छंटनी की। ट्रांसजेनिक क्षेत्र (ग) की अनुप्रस्थ सतह के माध्यम से काटना। (घ) के दो रेडियल कटौती की सहायता करने के लिए परिचय SEM के तहत ट्रांसजेनिक ऊतक का पता लगाने में। (ई) ऊतक प्रवाहकीय टेप का उपयोग कर एक SEM पिन पर मुहिम शुरू की। (च) ट्रांसजेनिक और गैर ट्रांसजेनिक ऊतकों के क्षेत्र है कि विश्लेषण के लिए imaged किया जाना चाहिए का चित्रण। (G) जाइलम फाइबर और रे कोशिकाओं 2,000X बढ़ाई पर कब्जा कर लिया की विशिष्ट छवि। (ज (I) macerated फाइबर प्रकाश माइक्रोस्कोपी गड्ढों और / या सेल दीवार striations के कोण चित्रण के तहत और सेल की लंबी अक्ष के देखी। काला तीर गड्ढे एपर्चर इंगित करता है। स्केल सलाखों = वायुसेना, ज = 1 मिमी, जी, मैं = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: विश्लेषण और cambial डेरिवेटिव के जीन प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के परिणाम (क) पी (फ्लोएम), X1 (विकासशील जाइलम) और X2 (विकसित जाइलम) क्षेत्रों का चित्रण।। (ख) CESA की एक सीमा से जुड़े एक परीक्षण से cambial क्षेत्रों में पी, X1 और X2 धुंधला के अनुपात का संकेत परिणाम नीलगिरी से प्रमोटरों तब्दील grandis। Creux एट अल। 10 से स्रोत डेटा। एन = मूल्यांकन क्षेत्रों की संख्या। स्केल बार = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रजातियों के पेड़ वेक्टर प्रकार ब्याज की जीन की संख्या बनाया विंडो की कुल संख्या खिड़कियों की कुल संख्या जहां एक क्षेत्र में पहचान की थी (%) Cambial ATScm -2 cambial (Windows में जहां एक क्षेत्र में पहचान की थी)
नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camaldulensis संकर (तीन क्लोन की कुल) सकारात्मक नियंत्रण (ब्याज की जीन) 1 (गस केवल) 96 97% 45.1 (1.5)
ब्याज की जीन 20 630 92% 46.1 (2.2)
पोपुलस अल्बा 'pyramidalis' सकारात्मक नियंत्रण (ब्याज की जीन) 1 (गस केवल) 110 74% 10.8 (1.5)
ब्याज की जीन 20 700 81% 14.6 (0.8)

तालिका 1:। ठेठ cambial ATScm -2 सकारात्मक नियंत्रण और ब्याज की जीन के लिए आंकड़े ही नीलगिरी में लगातार दो वर्षों में किए गए अध्ययन और चिनार क्लोन जीन की एक सीमा है और फ्लोएम छील कटाई प्रोटोकॉल (कदम 5.2 का उपयोग करने से sourced किया गया है। 1)। कोष्ठक में मानक त्रुटि मान। </ P>

<टीडी> 1 (गस केवल)
प्रजातियों के पेड़ वेक्टर प्रकार प्रमोटर / जीनों की संख्या बनाया विंडो की कुल संख्या खिड़कियों की कुल संख्या जहां एक क्षेत्र में पहचान की थी (%) ATScm -2 सभी क्षेत्रों ATScm -2 periderm ATScm -2 फ्लोएम ATScm -2 cambial ATScm -2 घाव पैरेन्काइमा ATScm -2 Tylose
नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camal-
dulensis संकर (तीन क्लोन की कुल)
सकारात्मक नियंत्रण 118 63% 25.74 (2.35) 0.24 (0.07) 0.89 (0.19) 15.7 (1.71) 8.84 (1.4) 0.07 (0.03)
ब्याज के प्रमोटरों 28 1050 31% 14.67 (1.77) 0.02 (0.01) 0.05 (0.01) 13.79 (1.75) 0.78 (0.21) 0.03 (0.01)
पोपुलस अल्बा 'pyramidalis' सकारात्मक नियंत्रण 1 (गस केवल) 110 54% 12.37 (1.77) 0.22 (0.07) 1.85 (0.29) 5.07 (0.6) 2.78 (0.75) 0.29 (0.53)
ब्याज के प्रमोटरों 28 990 26% 8.28 (1.18) 0.16 (0.04) 0.9 (0.09) 6.67 (1.16) 0.27 (0.07) 0.28 (0.11)

तालिका 2:। ठेठ सेक्टर -2 ATScm सकारात्मक नियंत्रण और ब्याज के प्रमोटरों के लिए आंकड़े ही नीलगिरी में लगातार दो वर्षों में किए गए अध्ययन और चिनार क्लोन प्रमोटर दृश्यों की एक सीमा है और डिस्क कटाई प्रोटोकॉल (कदम 5.2 का उपयोग करने से sourced किया गया है। 2)। ATScm -2 मूल्यों खिड़कियों जहां एक क्षेत्र केवल पहचान की थी से प्राप्त किए गए। कोष्ठक में मानक त्रुटि मान। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जाति ट्रायल उपचार विवरण इलाज में खिड़कियों की संख्या -2
नीलगिरी ग्लोबुलस ए की एकाग्रता टीका मीडिया में tumefaciens 25 मिलीलीटर एमएस में resuspended 10 1.4 (0.62)
5 मिलीलीटर एमएस में resuspended 10 1.6 (0.72)
1 मिलीलीटर एमएस (नियंत्रण) में resuspended 10 2.4 (1.16)
टीका मीडिया में मीडिया प्रकार LB 10 0.4 (0.22)
एमएस (नियंत्रण) 10 2.4 (1.16)
टीका मीडिया को Acetosyringone के अलावा Acetosyringone के साथ 1 1 0.9 (0.37)
Acetosyringone (नियंत्रण) 1 1 0.6 (0.64)
स्टेम ऊतकों की उम्र टीका 6 महीने (विवादएल) 1 1 1.1 (0.66)
18 महीने 1 1 1.8 (0.95)
ए तनाव tumefaciens AGL1 (नियंत्रण) 18 0 (0)
C58 18 0.1 (0.1)
LBA4404 18 0.6 (0.4)
पोपुलस अल्बा 'pyramidalis' ए की एकाग्रता मीडिया में tumefaciens 25 मिलीलीटर एमएस में resuspended 10 2.2 (0.55)
5 मिलीलीटर एमएस में resuspended 10 2.7 (0.63)
1 मिलीलीटर एमएस (नियंत्रण) में resuspended 10 5.1 (1.58)
मीडिया प्रकार स्टेम टीका के लिए इस्तेमाल किया LB 10 2.8 (0.71)
एमएस (नियंत्रण) 10 5.1 (1.58)
टीका मीडिया को Acetosyringone के अलावा Acetosyringone के साथ 1 1 0.3 (0.14)
Acetosyringone (नियंत्रण) 1 1 0.5 (0.25)
स्टेम ऊतकों की उम्र टीका 6 महीने (नियंत्रण) 1 1 1.5 (0.33)
18 महीने 1 1 1.5 (0.63)
ए तनाव tumefaciens AGL1 (नियंत्रण) 20 8.1 (2)
C58 20 12.5 (2)
LBA4404 20 11.1 (2)

तालिका 3: cambial ATScm -2 प्रोटोकॉल अनुकूलन ट्रेल्स के हिस्से के रूप में जांच की चर की एक श्रृंखला के लिए मूल्यों। चर एक चिनार क्लोन और cambial ATScm -2 प्रस्तुत डेटा के साथ साल के एक नंबर भर में नीलगिरी ग्लोबुलस व्यक्तियों की एक सीमा में जांच की गई। Cambial Windows डिस्क कटाई प्रोटोकॉल (कदम 5.2.2) का उपयोग कर काटा गया। कोष्ठक में मानक त्रुटि मान।

नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camaldulensis क्लोन आईडी Cambial खिड़कियों की संख्या प्रत्येक माह के लिए Cambial ATScm -2 देर से वसंत (नवंबर) टीका Cambial ATScm -2 गर्मियों की शुरुआत (दिसंबर) टीका Cambial ATScm -2 मिड समर (जनवरी) टीका Cambial ATScm -2 देर ग्रीष्मकालीन (फरवरी) टीका Cambial ATScm -2 जल्दी शरद ऋतु (मार्च)टीका Cambial ATScm -2 सभी महीनों के संयुक्त
SG5 10 15.7 (7.8) 50.7 (13.7) 10.5 (5.1) 30.7 (4.4) 16.8 (6.3) 24.9 (4.3)
SG6 10 6.1 (3.1) 38.5 (15.1) 4.5 (1.7) 14.5 (3.3) 27.6 (8.4) 18.3 (4)
SG13 10 28.4 (6.7) 41.8 (9.1) 16.1 (7) 29.3 (5.2) 19.8 (4.3) 27.1 (3.1)
SG18 10 6.7 (2.9) 18.3 (6.7) 17.4 (3.4) 19.2 (6.1) 18.1 (6.3) 15.5 (2.4)
SG21 10 38.7 (14.3) 77 (17.5) 23.9 (5.7) 27.5 (6.9) 40.7 (13.5) 41.6 (6)
SG35 10 23.5 (10.2) 42.8 (12.2) 7.6 (2.5) 17.6 (4.3) 31.3 (4.6) 24.6 (3.8)
SG37 10 19.7 (8) 55.2 (14.5) 7.4 (1.8) 35 (10.4) 15.9 (4.5) 26.6 (3.8)
SG39 10 12.5 (2.4) 23.6 (6.3) 6.9 (3) 26.3 (8.1) 7.3 (2.3) 15.5 (2.6)
SG40 10 24.8 (11) 24.5 (6.8) 14 (5.6) 35.6 (6.1) 19.9 (4.2) 23.8 (3.2)
SG44 10 22.3 (3.4) 63 (29.3) 9.8 (2.6) 52.5 (10.3) 54.3 (15) 40.4 (7.4)
SG46 10 15.3 (5.2) डी> 63.9 (20.1) 23.6 (4) 22.5 (4.8) 17.4 (4.9) 28.5 (5.1)
मासिक cambial ATScm -2 19.9 (5) 45.3 (9.1) 12.6 (2.8) 27.8 (4.5) 24 (5.1)

सारणी 4:। जीनोटाइप और cambial ATScm -2 नीलगिरी क्लोन में पर टीका के समय के प्रभाव दस विंडोज 10 अलग नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camaldulensis क्लोन जो सभी मई में काटा गया के लिए बढ़ती मौसम पर प्रत्येक महीने के शुरू किए गए थे। मासिक डेटा एक समग्र औसत मासिक और genotypic ATScm -2 भी प्रस्तुत के साथ प्रत्येक जीनोटाइप के लिए प्रस्तुत किया है। Cambial खिड़कियों फ्लोएम छील कटाई प्रोटोकॉल (कदम 5.2.1) का उपयोग कर काटा गया। कोष्ठक में मानक त्रुटि मान।es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संयंत्र संख्या Cambial क्षेत्रों की संख्या excised सभी क्षेत्रों के कुल द्रव्यमान (माइक्रोग्राम) सेक्टरों की औसत द्रव्यमान (माइक्रोग्राम)
1 1 1 750 68
2 19 1,460 77
3 21 160 8
4 26 4460 172
5 15 1,320 88
6 22 2,490 113
7 19 1720 91
8 30 830 28
9 25 360 14
कुल 188 13,550 72

तालिका 5:। एक cambial क्षेत्र के विशिष्ट जन नौ संयंत्रों में 45 खिड़कियां चिनार में जांच की एक क्षेत्र की औसत से बड़े पैमाने पर निर्धारित करने के लिए और डिस्क कटाई प्रोटोकॉल (कदम 5.2.2) का उपयोग कर काटा गया। पौधों 5 महीने के लिए बड़े हो रहे थे और एक cambial खिड़की के पार रेडियल विकास 1-4 मिमी के बीच था।

Morph-
ological विशेषता
गस केवल (सकारात्मक नियंत्रण) गैर ट्रांसजेनिक ऊतक (गस केवल) पी-मूल्य ब्याज 1 जीन (FLA1) गैर ट्रांसजेनिक ऊतक (FLA1) पी-मूल्य ब्याज 2 के जीन (FLA2) गैर ट्रांसजेनिक ऊतक (FLA2) पी-मूल्य ब्याज 3 के जीन (FLA3) गैर ट्रांसजेनिक ऊतक (FLA3) पी-मूल्य
औसत सेल दीवार मोटाई (माइक्रोन) * 1.81 (0.1) 1.65 (0.1) 0.2692 1.47 (0.14) 1.55 (0.12) 0.6403 1.65 (0.13) 1.78 (0.13) 0.4839 1.59 (0.12) 1.63 (0.11) 0.8254
औसत सेल दीवार क्षेत्र (माइक्रोन 2) * 69।1 (4.74) 60.7 (2.03) 0.1229 64.1 (15.68) 59.9 (9.79) 0.5004 61.6 (3.4) 65 (3.96) 0.5182 61.9 (3.56) 61.5 (3.16) 0.9438
औसत सेल क्षेत्र (माइक्रोन 2) * 115.9 (11.01) 99.9 (5.1) 0.2041 124.4 (6.1) 108 (4.36) 0.0445 110.8 (8.45) 111,3 (9,06) 0.9671 108.5 (4.43) 103 (3.07) 0.3204
औसत लुमेन क्षेत्र (माइक्रोन 2) * 46.9 (7.55) 39.2 (4.89) 0.407 60.2 (5.28) 48.1 (4.46) 0.0991 49.2 (7.56) 46.3 (7.5) 0.7882 46.6 (3.31) 41.5 (3.9) 0.3264
औसत सूक्ष्मतंतु कोण (ओ) # 24.3 (0.75) 24.2 (0.45) 0.8648 22.3 (0.82) 22.7 (0.7) 0.5664 23.7 (0.55) 26.6 (0.5) 0.0001 26 (0.88) 27.2 (0.72) 0.0903

टेबल 6:। आईएसएसए फाइबर आकृति विज्ञान माप ब्याज अध्ययन के जीन से निकाली गई फाइबर सेल की दीवार, सेल आकार और नीलगिरी ग्लोबुलस एक्स camaldulensis क्लोन से स्रोत ट्रांसजेनिक फाइबर से लिया एमएफए माप की तुलना नीलगिरी के साथ बदल उपजी FLAs (EgrFLA1, 2, 3) और grandis सकारात्मक नियंत्रण आसन्न गैर ट्रांसजेनिक नियंत्रण फाइबर के साथ (गस केवल)। मैकमिलन एट अल। 9 से स्रोत डेटा। * इंगित करता परीक्षण 10 सेक्टर में 10 फाइबर की माप शामिल (मुन्ना100 फाइबर के अल)। # इंगित करता परीक्षण 20 सेक्टरों (100 फाइबर की कुल) में 5 फाइबर की माप शामिल किया गया। α <0.05 बोल्ड में दिखाया गया है। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

11.05
EgCESA1 EgCESA2 EgCESA3 EgCESA4 EgCESA5 EgCESA7 गस केवल (सकारात्मक नियंत्रण)
EgrCESA1 0.708 2.839 8.856 9.976 9.18 29.165
EgrCESA2 1.11 12.008 11.363 30.234
EgrCESA3 15.151 16.123 15.488 37.791
EgrCESA4 4.852 0.108 46.858
EgrCESA5 3.275 11.278
EgrCESA7 36.082
गस केवल (सकारात्मक नियंत्रण)

टेबल 7: ची 2 मूल्यों cambial डेरिवेटिव में प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना से निकाली गई ची 2 विश्लेषण उपस्थिति / पी, X1 और cambial डेरिवेटिव के X2 क्षेत्र में गस धुंधला की अनुपस्थिति की तुलना। के बीच छह नीलगिरी grandis CESA जीन प्रमोटरों दृश्यों (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) और सकारात्मक नियंत्रण (गस केवल)। Creux एट अल। 10 से स्रोत डेटा। α <0.05 रेखांकन में दिखाया गया है।

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Discussion

आईएसएसए प्रोटोकॉल जीन और लकड़ी में शामिल हित के प्रमोटरों के विश्लेषण के लिए कुछ महीने के अंतरिक्ष में प्रजातियों के पेड़ में ट्रांसजेनिक स्टेम ऊतकों के निर्माण के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और कारगर तरीका है और गठन स्टेम। छोटे से प्रयास से परे जीवित रखने पौधों, ट्रांसजेनिक स्टेम ऊतकों को टीका जो इन विट्रो तरीकों जहां व्यापक संवर्धन ऊतक या पौधों, जहां लकड़ी के उत्पादन साल तक का समय लग सकता है शुरू करने के लिए या जहां एक सच्चे बनाए रखने के लिए आवश्यक है के विपरीत में खड़ा निम्नलिखित विकसित करने के लिए आवश्यक है माध्यमिक स्टेम 1 नहीं बनाई गई है। आईएसएसए भी पोपुलस, नीलगिरी और Pinus 6 की जीनस में प्रजातियों के साथ ही बबूल और कोरिंबिया सहित प्रजातियों के पेड़ की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू (नहीं दिखाया डेटा) होना दिखाया गया है, जहां बहुत कम है, यदि कोई हो, अनुकूलन के लिए आवश्यक है ट्रांसजेनिक ऊतक निकाले जाते हैं। इस विधि का प्रयोग, इसलिए यह संभव है ओ एक नंबर की जांच करने के लिएएफ जीन या ब्याज के अधिकांश प्रजातियों में ब्याज के प्रमोटरों। इसके अलावा, प्रोटोकॉल और अधिक व्यापक रूप से इन विट्रो तकनीक जहां कई जीनों पहले उदाहरण में आईएसएसए का उपयोग कर संभावित उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए इन विट्रो तरीकों में शामिल करने के लिए आगे ले जाने की जांच की जा सकती है, में उपयोग के साथ अपने दम पर या संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्णित उदाहरणों से पता चलता है कि पर्याप्त सेक्टरों केवल ट्रांसजेनिक cambial खिड़कियों की एक छोटी संख्या से नीचे की ओर विश्लेषण करने के लिए बनाया जा सकता है। साथ चिनार केवल एक या दो cambial खिड़कियों में नीलगिरी में 46.1 और 14.6 के ATScm -2 मूल्यों को एक ही विशेषता जांच करने के लिए पर्याप्त होगा के रूप में यह एक ही पौधे स्टेम करने के लिए कई खिड़कियों जोड़ सकते हैं या कई पौधों पर दोहराने के लिए संभव है। व्यवहार में, हालांकि, सभी cambial खिड़कियां एक cambial क्षेत्र है कि उपयोग किया जा सकता है के निर्माण के लिए नेतृत्व (देखें तालिका 1, 2 टेबल) के रूप में क्षेत्रों के आकार भिन्न हो सकते हैं, वे आम तौर पर छोटे हैंऔर मामलों में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उनके उपयोग को सीमित करने के लिए एक दूसरे के करीब निकटता में स्थित हो सकता है। इसके अलावा, ब्याज की जीन सेल व्यवहार्यता 12 या संभावित ब्याज की एक विशेष जीन के लिए ट्रांसजेनिक क्षेत्रों का पूर्ण अभाव है, जिसके परिणामस्वरूप सेल के विकास के अन्य पहलुओं पर प्रभाव पड़ सकता है। इसलिए यह हमेशा से विश्लेषण के लिए आवश्यक हो सकता है खिड़कियों की एक बड़ी संख्या के लिए उद्देश्य के लिए सलाह दी जाती है। इसी सावधानी जब प्रमोटर की पढ़ाई के लिए आईएसएसए का उपयोग कर के रूप में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता कुछ मामलों (तालिका 2) में मनाया थोड़ा / कमजोर या कोई अभिव्यक्ति के साथ उम्मीद की जा सकती लागू किया जाना चाहिए। हालांकि, क्षेत्रों की एक छोटी संख्या, 6 के रूप में छोटे, सफलतापूर्वक विश्लेषण 10 के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए दिखाया गया है। ये परिणाम है कि काफी मामूली खिड़कियों का केवल एक छोटी संख्या में शामिल प्रयोगों जीन समारोह और प्रमोटर गतिविधि में महत्वपूर्ण जानकारी मिल सकती दिखा।

एक विश्लेषण के दृष्टिकोण से, transgen के करीब निकटताआईसी और गैर ट्रांसजेनिक ऊतक ब्याज की जीन के बीच लक्षण में छोटी लेकिन सार्थक मतभेद की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। कोशिकाओं और ऊतकों को एक दूसरे से सीधे आसन्न नमूना ही genotypic पृष्ठभूमि के हैं और एक ही पर्यावरण की स्थिति स्वतंत्र चर की संख्या को कम करने और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक सरल बनाने के द्वारा प्रभावित किया गया है। एक नमूना दृष्टिकोण से, आईएसएसए पर बिजली विश्लेषण निकाली गई कई प्रयोगों से डेटा (जैसे, टेबल 6), पता चला है कि क्षेत्र के प्रति माप की एक छोटी संख्या है, जैसे, सेल दीवार सेक्टर प्रति 3-5 कोशिकाओं की मोटाई, और एक बड़ी संख्या को मापने सेक्टरों की, जैसे, ब्याज की एक जीन के लिए 20-25 क्षेत्रों, एक अधिक कुशल और सांख्यिकीय मजबूत नमूना रणनीति प्रदान करता है। प्रत्येक क्षेत्र के एक स्वतंत्र परिवर्तन घटना या एकाधिक परिवर्तन की घटनाओं की औसत प्रभाव का निर्धारण किए सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ कोशिकाओं के 'लाइन' का प्रतिनिधित्व करता हैब्याज की जीन से जुड़े। समान रूप से, सभी स्टेम ऊतकों को बदलने की क्षमता केंबियम भेदभाव के दौरान पूरे स्टेम और अधिक विशेष रूप से भर में हितों के प्रमोटरों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। आईएसएसए प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित नमूने, संग्रह और ऊतक और सेल आकृति विज्ञान के लिए और प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए डेटा के विश्लेषण की कटाई के माध्यम से ट्रांसजेनिक ऊतक के निर्माण से एक विश्वसनीय और मान्य पाइप लाइन उपलब्ध कराते हैं।

ज्यादातर मामलों में, सेक्टरों एक एकल कोशिका है, जो कोशिका विभाजन के माध्यम से व्युत्पन्न कोशिकाओं और ऊतकों की एक संख्या को जन्म दिया हो सकता है के परिवर्तन के परिणाम हैं। उदाहरण के लिए, एक cambial क्षेत्र एक एकल कोशिका के परिवर्तन घाव पोस्ट है कि वसूली एक cambial प्रारंभिक जो बारी में एक क्षेत्र फ्लोएम में मूल घाव से सभी तरह का विस्तार बनाने के लिए periclinally और anticlinally बिताते हो जाता है से उठता है। इन मामलों में, बदल प्रारंभिक बनाए रखा गया थाफसल और एक 'पूर्ण' संस्करण के समय मनाया जाता है जब तक केंबियम भीतर, तथापि, जहां इस प्रारंभिक रेडियल विकास के दौरान cambial परत से खो दिया है और एक गैर तब्दील हो 'सेल आक्रमण' के माध्यम से पड़ोसी सेल, फिर बदल दिया है एक ' खो प्रारंभिक 'संस्करण परिणाम होंगे। आदेश सेक्टर प्रकारों का सही वर्गीकरण सुनिश्चित करने के लिए और परिणामों की व्याख्या के साथ सहायता करने के लिए यह किया जा माध्यमिक स्टेम विकास और घाव प्रतिक्रियाओं की शारीरिक विशेषताओं आईएसएसए परिणामों के विश्लेषण के लिए किसी और चीज के साथ कि परिचय पुरजोर सिफारिश की है। इसके अलावा, गस अभिकर्मक के पीएच का नियमित परीक्षण की सलाह दी है (कदम 5.6 देखें)। एक कम पीएच (जैसे, 6 नीचे) संयंत्र स्टेम में अंतर्जात β-glucuronidases (गस), जो एक क्षेत्र की हद तक सच नकाब या झूठी सकारात्मक की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की सक्रियता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। कहां से यह शक किया जाता है, यह सिफारिश की है कि इन नमूनों आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। गस अभिकर्मक प्रोटोकॉलमज़बूती से आदेश अंतर्जात गस गतिविधि के साथ संभावित समस्याओं हॉकिन्स एट अल से अनुकूलित किया गया था कम करने के लिए यहाँ उल्लिखित अध्ययन में लागू होता है। (2002) 16 और इस्तेमाल PH7 के लिए नमूने संतुलित करने फॉस्फेट बफर, और 55 में गर्मी उपचार के साथ दो rinses सहित अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम 10 मिनट के लिए सी अंतर्जात गस गतिविधि 17,18 अस्थिर करने के लिए। गस अभिकर्मक पारगम्यता भी सीमित है और कम क्षेत्रों के लिए जिम्मेदार फ्लोएम छील प्रोटोकॉल की तुलना में अनुप्रस्थ डिस्क प्रोटोकॉल का उपयोग पहचान की जा रही है।

trialed से पता चला है सभी प्रजातियों cambial ऊतक के परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होना। हालांकि, ATScm में महत्वपूर्ण मतभेद -2 दोनों के बीच और जीनस और प्रजातियों के भीतर मनाया गया है। इसी तरह के तनाव tumefaciens और समय / टीका के मौसम ATScm प्रभावित कर सकते हैं -2। यह सुझाव दिया है कि विशिष्ट में इन चर के कुछ प्रारंभिक परीक्षण के उपक्रमतों और जांच प्रोटोकॉल के बड़े पैमाने पर गोद लेने से पहले के तहत जीनोटाइप। सैद्धांतिक रूप से उम्र या आकार की कोई सीमा नहीं है जो आईएसएसए के रूप में लंबे समय से एक सक्रिय रूप से बढ़ केंबियम वहाँ के रूप में लागू किया जा सकता है के तनों की है। हालांकि, ट्रांसजेनिक ऊतक क्षेत्रों के बहाव के प्रसंस्करण में आसानी के लिए यह सिफारिश की है inoculating के बारे में 1 सेमी व्यास का उपजा है।

आईएसएसए अपनी सीमाओं के बिना नहीं है। ट्रांसजेनिक ऊतक क्षेत्रों की अपेक्षाकृत छोटे आकार वर्तमान में नीचे की ओर phenotyping तरीकों प्रतिबंधित करता है और फलस्वरूप ही इस तरह के तरीकों की एक सीमित संख्या में नियमित तौर पर तारीख करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन तरीकों में मुख्य रूप से ऊपर के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में माध्यमिक सेल दीवार में monosaccharides रचना की अर्द्ध मात्रात्मक अनुमान उल्लिखित के रूप में परिचय 9,11 में नोट रूपात्मक लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। आगमन और जैविक सामग्री के ठीक पैमाने विश्लेषण के लिए नई प्रौद्योगिकियों के शोधन के साथ आगे अतिरिक्त phenotyping विकसित करने की क्षमता हैआईएसएसए क्षेत्रों के लिए पाइपलाइनों, सेल दीवार compositional विश्लेषण में उदाहरण के लिए। यह मुश्किल बनी हुई है, हालांकि, मात्रात्मक, सेक्टर क्षेत्र द्वारा, ribonucleic एसिड (आरएनए) आधारित जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन अध्ययन करते हैं और / या पहचान करने और प्रचार आईएसएसए गस परख की विनाशकारी प्रकृति की वजह से अतिरिक्त विश्लेषण के लिए इन विट्रो संवर्धन के माध्यम से ट्रांसजेनिक कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए । कुछ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन और ऊतक मुद्रण अलग अलग क्षेत्रों से लेकिन आज इन तरीकों को सफलतापूर्वक दिनचर्या आपरेशन में उच्च throughput प्रदर्शन के लिए माध्यम के लिए नहीं इस्तेमाल किया गया है आरएनए यों तो trialed किया गया है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक तकनीक ऐसी आरएनएआई के रूप में तारीख करने के लिए नहीं आज़माने वाले विश्लेषण जहां गस अभिव्यक्ति और लक्ष्य जीन के नीचे विनियमन सह-स्थानीय बनाना नहीं कर सकते उलझा सकता है।

जबकि वहाँ कुछ वर्तमान सीमाओं, नए के समावेश और उभरती प्रौद्योगिकियों और विश्लेषणात्मक तरीकों इन सीमाओं को पार करने के लिए, आगे आईएसएसए एक की भूमिका को बढ़ाने की संभावना हैcambial भेदभाव, लकड़ी विकास की जटिल प्रकृति आणविक विदारक और गठन के लिए स्टेम उच्च throughput प्रोटोकॉल के लिए SA माध्यम।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plants NA NA Please consult local nursery suppliers for plants as needed
Agrobacterium strain NA NA There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.
Binary vector (gene and promoter) NA NA We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.
LB media Sigma L3022 The same product could be sourced from another company
LB media with agar Sigma L2897 A like product could be sourced from another company
Antibiotics Sigma NA The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a  range of companies
50 ml Screw top tubes Fisher Scientific 14-432-22 The same product could be sourced from another company
2 ml Microtube Watson Bio Lab 132-620C The same product could be sourced from another company
MS Media Sigma M9274 The same product could be sourced from another company
Scalpel blade no. 11 Sigma S2771 The same product could be sourced from another company
Parafilm "M" Bemis PM996 This is the best product to use to bind the cambial window post creation 
14 ml round bottom tubes Thermo Scientific 150268 The same product could be sourced from another company
EDTA Sigma E6758 The same product could be sourced from another company
Triton Sigma X100 The same product could be sourced from another company
X-Gluc X-GLUC direct You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html
Potassium Ferricyanide(III) Sigma 244023 The same product could be sourced from another company
Potassium Ferrocyanide(II) Sigma P9387 The same product could be sourced from another company
Litmus paper Sigma WHA10360300 The same product could be sourced from another company
Single edge razor blade ProSciTech L055 The same product could be sourced from another company
Double edge razor blade ProSciTech L056 The same product could be sourced from another company
SEM Pin Stub ProSciTech GTP16111 The same product could be sourced from another company
Sample vial with screw cap ProSciTech L6204 The same product could be sourced from another company
Ethanol sigma E7023 The same product could be sourced from another company
LR white ProSciTech C025 The same product could be sourced from another company
Embedding Mould ProSciTech RL090 We recommend this variety, however there are plenty of options available
Water Soulable mounting media ProSciTech IA019 One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.
Hydrogen peroxide Sigma 216763 A like product could be sourced from another company
Glacial acetic acid Sigma A9967 A like product could be sourced from another company
Safranin O ProSciTech C138 A like product could be sourced from another company
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope FEI This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised
ImageJ imaging software can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/

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References

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