L'utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l'étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

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Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, E., Van Beveren, K., Tibbits, J., Creux, N., Bossinger, G. The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development. J. Vis. Exp. (116), e54553, doi:10.3791/54553 (2016).

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Abstract

croissance de la tige secondaire dans les arbres et la formation du bois associé sont importantes à la fois du point de vue biologique et commercial. Cependant, on sait relativement peu sur le contrôle moléculaire qui régit leur développement. Cela est dû en partie à l'intégrité physique, les ressources et les limites de temps souvent associée à l'étude des processus de croissance secondaires. Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées impliquant soit une partie de plante ou d'un système de la plante entière dans les deux espèces ligneuses et de plantes non ligneuses. Cependant, des questions sur leur applicabilité pour l'étude des processus de croissance de la tige secondaire, la récalcitrante de certaines espèces et l'intensité du travail sont souvent prohibitifs pour les moyennes et les applications à haut débit. Aussi, quand on regarde le développement de souches et de bois formation secondaire, les traits spécifiques visés par l'enquête pourraient ne devenir mesurable fin du cycle de vie d'un arbre après plusieurs années de croissance. Pour relever ces défis de remplacement in vivo protocoles ont été développés, nommé Induced analyse sectorielle somatique, ce qui implique la création de secteurs de tissus somatiques transgéniques directement dans la tige secondaire de la plante. L'objectif de ce protocole est de fournir un moyen efficace, facile et relativement rapide pour créer un tissu végétal secondaire transgénique pour le gène et la caractérisation fonctionnelle du promoteur qui peut être utilisé dans une gamme d'espèces d'arbres. Les résultats présentés ici montrent que les secteurs de souches secondaires transgéniques peuvent être créés dans tous les tissus vivants et les types de cellules dans les tiges secondaires d'une variété d'espèces d'arbres et que les traits morphologiques de bois ainsi que les modes d'expression de promoteur dans le secondaire tiges peut être facilement évaluée en facilitant moyenne à élevée la caractérisation fonctionnelle de débit.

Introduction

tiges Arbre comprennent une quantité importante de la biomasse et les planètes sont d'une immense importance biologique, culturelle et commerciale. tiges secondaires créent un habitat en fournissant des ressources et un abri pour de nombreuses autres formes de vie. Ils offrent de nombreux services pour les écosystèmes où ils vivent et agissent comme une ressource renouvelable pour la production de bois, de pâte et de papier et d'autres produits ligneux et non ligneux. développement de la tige secondaire, et plus particulièrement la formation du bois est régie par un système complexe moléculaire qui régulent le développement des types de cellules spécifiques, la composition biochimique de leurs parois cellulaires et la façon dont ils sont agencés pour former des tissus et des organes. Disséquer la base moléculaire du développement de la tige secondaire et la formation du bois est confondu par de nombreux facteurs, y compris la variabilité des propriétés du bois et de souches à l'intérieur et entre les tiges, les longs délais de production, hors passage des systèmes d'accouplement, haute hétérozygotie, charge génétique élevée, dormance saisonnière, longue maturepériodes d'établissement trait et la taille physique pure d'arbres matures. En conséquence, la compréhension du développement de la tige secondaire par rapport à la connaissance détaillée de la plupart des autres aspects du contrôle moléculaire du développement des plantes, est encore à ses balbutiements.

Un certain nombre de techniques in vitro ont été utilisées pour étudier et comprendre le développement de la tige secondaire, notamment le bois et la formation secondaire de la paroi cellulaire. Ces protocoles impliquent l'utilisation de la plante entière ou systèmes partiels de plantes, où soit les plantes transgéniques sont créés ou des cellules ou des tissus secondaires spécifiques sont transformés pour l'étude des aspects spécifiques du bois et / ou le développement de tige secondaire 1. Les plantes transgéniques peuvent être récupérés transformation post génétique à partir d'une grande variété de tissus végétaux et types de cellules, cependant, les progrès sont lents, en particulier lors de l'analyse des traits de fibre de bois en raison de la longue régénération et endiguer les temps de maturation (dans l'ordre des années), haute technique et deman du travailds, faible débit de gènes candidats, ainsi que des difficultés à propager certaines espèces de plantes ligneuses. Des techniques similaires ont été développés dans le système de modèle non ligneuses telles que Arabidopsis qui surmontent avec succès certaines de ces limitations, mais tous les types de cellules souches non secondaire présent dans ces tiges et traits liés à la saisonnalité ou la longévité ne peuvent pas être étudiés dans ces espèces 2. Alternativement, les systèmes de partie de plantes, telles que radiata cals les cultures Pinu 3 réduisent les délais associés. Ces méthodes sont toutefois limitées à l'étude d'un type de cellule individuelle et souffrent des contraintes similaires comme indiqué pour les expériences in vitro. De même, les cultures de souches apicale 4 impliquant explants souches entières se sont révélés prometteurs , mais encore ont pas été appliquées pour l'étude des gènes ou promoteurs d'intérêt spécifiques. Plus récemment, un protocole alternatif impliquant des cultures de racines velues a été développé pour les eucalyptus et a été avec succèsappliquée 5, cependant, cette méthode nécessite encore la culture in vitro, implique des racines secondaires plutôt que des tiges et à ce jour , il est limité à une seule espèce d'arbres.

Induite analyse sectorielle somatique (AISS), comme décrit ici, a été développé pour surmonter certains de ces problèmes pour fournir un support à haut débit outil de criblage fonctionnel pour des gènes et des promoteurs avec des rôles présumés dans la formation du bois et le développement secondaire de tissu de la tige. AISS est une transformation in vivo et le dépistage du système qui a été développé pour réduire le temps nécessaire pour produire des cellules transgéniques et des tissus dans une tige secondaire intacte tout en surmontant la main - d'œuvre, les limitations techniques et de débit de couramment utilisés dans les méthodes in vitro. Les protocoles décrits ici permettent la création simultanée de centaines de secteurs et les cellules des tissus transformés de façon indépendante dans les tiges secondaires dans un court laps de temps, dans les espèces d'arbres et de tissus d'intérêt sans gvariation Enetic et / ou environnemental dans des délais relativement courts temps et le coût du travail faible. AISS techniques in vivo ont d' abord été décrit pour la tige secondaire 6 et le bourgeon 7 tissus et ont depuis été affiné dans le tissu de tige secondaire grâce à des études de gènes et / ou des promoteurs impliqués dans la différenciation cambium et comprennent: la tubuline (TUB) 8, fascicline comme arabinogalactane ( FLA) 9, la cellulose synthase (CESA) 10, domaine nac mur associé secondaire cellule (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 et vraiment protéine intéressante nouveau gène (RING) H2 13. Ces études ont été menées dans le secondaire tiges des plantes de peupliers et d'eucalyptus et fourni un aperçu de la morphologie cellulaire, la chimie de la paroi cellulaire et l'expression des gènes.

Les protocoles décrits ici sont destinés à réunir l'expérience d'unnd connaissances acquises à travers le développement et l'application de l'AISS à partir d'une série d'études publiées et non publiées au cours de la dernière décennie. Ils se concentrent sur la transformation in vivo des tissus souches secondaires 6 et se concentrent sur des études portant sur le clone 'pyramidal de Populus alba, Eucalyptus globulus, ainsi que 11 Eucalyptus globulus x clones camaldulensis. Ce document prend les chercheurs à travers le protocole de la culture des plantes et des bactéries, la transformation des tissus de la tige, la croissance et la récolte des tissus, l'identification des cellules et des tissus transgéniques, la préparation des évaluations phénotypiques et méthodes pour la collecte et l'analyse des données. Bien que les techniques ont été appliquées avec succès pour mesurer la composition de monosaccharide de la paroi cellulaire aussi 9,11, en raison du manque d'espace, ce document se concentre sur les techniques utilisées pour la cellule de mesure et la morphologie des tissus et la compréhension des profils d'expression des gènes dans st secondaireems seulement. En conséquence, le protocole tel que décrit est adapté à ceux qui cherchent à acquérir de nouvelles informations sur le rôle et / ou l'expression de gènes liés à l'utilisation secondaire des tiges un faible coût, techniquement facile, et moyen à la méthode à haut débit.

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Protocol

1. Préparation du matériel végétal

  1. Avant l'expérimentation, soulever de nouvelles plantules de l'espèce à partir de graines ou de coupe d'arbres préférés et faire croître l'arbre / s jusqu'à ce que le diamètre de la tige dans la zone destinée à l'expérimentation est d'environ 1 cm de diamètre.
    Remarque: Le temps nécessaire peut varier en raison des taux de croissance des plantes permettent donc de trois à neuf mois pour cette étape.

2. vecteur binaire Création

  1. Effectuer le travail de cette section de l' article 7 dans un laboratoire ou d'une serre où Agrobacterium tumefaciens peuvent être manipulés et que l' équipement de protection individuelle approprié prescrit pour le laboratoire est utilisé.
  2. Préparer un vecteur binaire contenant soit un gène d'intérêt effet de choc ou d'une cassette de surexpression et une β-glucuronidase (GUS), la cassette de gène rapporteur ou un promoteur d'intérêt fusionné à un gène GUS en fonction du type d'étude.
    Note: Il y a un certain nombre de vecteur binaire backbones qui peuvent provenir du commerce ou par l'intermédiaire des réseaux de recherche ainsi que de nombreuses techniques disponibles pour insérer des gènes et des promoteurs d'intérêt dans des vecteurs binaires. Dans le cadre de ce protocole est à l'expérimentateur de prendre la décision sur la façon de créer un vecteur binaire.
  3. Transformer vecteur binaire en une souche désarmée de A. tumefaciens par électroporation ou choc thermique 14 et de stocker de manière appropriée jusqu'à ce que nécessaire pour l' expérimentation.
  4. Répétez l'étape 2.2 pour tous positifs et / ou des contrôles négatifs.
    Remarque: Les contrôles négatifs doivent inclure un vecteur binaire contenant aucun gène d'intérêt pour un gène d'étude d'intérêt et un GUS sans promoteur pour un promoteur d'étude d'intérêt. Contrôle positif pour un promoteur d'étude d'intérêt devrait inclure une mosaïque du chou-35s Virus promoteur (CaMV35S) fusionné à un rapporteur GUS.

3. Préparation de A. tumefaciens pour Inoculation

  1. Au moins une semaine avant expérimentation, prendre une petite quantité (environ 1 pi) de A. tumefaciens préparé lors de l' étape 2.2 et 2.3 et la propagation finement sur du milieu LB agar séparé avec 14 plaques contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne. Cultivez à 28 ° C dans un incubateur pour former de petites colonies puis stocker à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
  2. 48 heures avant l'expérimentation, transférer une colonie de A. tumefaciens de chaque plaque dans séparés 50 ml vis supérieure des tubes contenant 5 ml de (28 ° C) du milieu LB préchauffées 14 contenant des antibiotiques appropriés pour la sélection bactérienne et agiter à 200 rpm sur un incubateur agitateur pendant environ 48 heures à 28 ° C jusqu'à ce que mélange est très nuageux.
  3. Entre 4-6 h avant l'inoculation des tiges de plantes (section 4) ajouter 1 ml de LB / A. mélange tumefaciens dans un 50 ml frais vis tube supérieur contenant 19 ml (dilution 1:20) de frais chaud (28 ° C) du milieu LB avec des antibiotiques appropriés pourla sélection bactérienne. Si la densité optique (DO) à 600 nm (DO 600, telle que mesurée par spectroscopie) est supérieur à 0,1, diluer avec LB chaud jusqu'à ce que soit atteint.
  4. Placez diluée LB / A. tumefaciens mélange de retour sur l'incubateur shaker et secouer dans les mêmes conditions (200 tours par minute, 28 ° C) jusqu'à ce que la DO 600 est comprise entre 0,4-0,6 et retirer.
  5. Centrifugeuse LB / A. mélange tumefaciens pendant 15 min à 1000 xg et 4 ° C.
  6. Décanter liquide et remettre immédiatement A. tumefaciens culot dans 1 ml de milieu MS refroidi 15, transfert à 2 ml microtube et de stocker sur la glace jusqu'au moment de l'inoculation (section 4). Cette solution est appelée Ensemencement Media.

4. Inoculation de Tige avec A. tumefaciens

  1. Lancer l'expérimentation pendant la fin du printemps ou début de l'été en utilisant des plantes créées à l'article 1 qui ont un cambium actif et en croissance rapide. Un bon diagnostic pour uncambium actif et en croissance rapide est que le phloème peut être facilement détaché du xylème.
  2. Trouver une section droite claire de la tige près de la base de la plante et retirez les feuilles et les branches.
  3. L' utilisation d' un scalpel ( de préférence de n ° 11) ou une lame de rasoir, créer un 1 cm 'fenêtre cambium' 2 dans une section précise de la tige en introduisant deux incision verticale parallèle à travers le phloème de 20 mm de longueur et 5 mm de distance puis un coupe horizontale qui relie les deux coupes verticales à leur extrémité de base.
  4. Retirez la bande phloème créée par l'incision vers le haut exposant le tissu xylème développer et ajouter suffisamment Ensemencement des médias de l'étape 3.6 pour mouiller la surface du xylème en développement exposés à l'aide d'une pipette (typiquement 5-10 pi). réinsérez immédiatement la bande phloème.
  5. Rabattre la bande phloème à la tige étroitement avec Parafilm.
  6. Répéter les étapes 04.02 à 04.05 pour toutes les fenêtres cambiales supplémentaires pour le gène (s) ou promoteur (s) d'intérêt à créer unny fenêtres nouvelle cambiales moins 1 cm au-dessus ou au-dessous d'autres fenêtres du cambium et à un décalage de 90 °.
  7. Suivez les étapes 4.2 à 4.5 pour les vecteurs de contrôle positif et négatif (étape 2.4) veillant à ce que chaque vecteur est ajouté à la même tige de chaque plante utilisée dans l'expérience.
  8. Surveiller la croissance de la tige de diamètre périodiquement et la récolte pour le dosage GUS (section 5), lorsque la croissance radiale d'au moins 5 mm a été observé dans les tiges.
    Note: La quantité de croissance radiale nécessaire dépend de la quantité de tissu utilisé pour l'analyse en aval.

5. récolte pour GUS histologiques Assay

  1. Accise la «fenêtre cambium 'de la tige enlever tout tissu ne fait pas partie de la nouvelle croissance dans la fenêtre de cambium.
    1. Pour les études relatives à la maturité xylème et le phloème morphologie cellulaire / tissu, peler le phloème du xylème.
    2. Pour les études où la zone de cambium est tenu de rester profils d'expression intactes ou promoteurs doivent être évaluered, tranche la fenêtre cambium transversalement en utilisant une lame de rasoir ou d'une autre lame tranchante en disques de entre 0,5 et 1 mm d'épaisseur.
  2. Placer les tissus de la fenêtre cambiales traitées dans 14 ml tubes ronds de fond et rincer deux fois dans 0,1 M de tampon phosphate à pH 7 14. Assurez -vous que le tissu est complètement immergée, reste en solution pendant au moins cinq minutes , et tout excès de solution est éliminé à la fin de le deuxième rinçage.
  3. Ajouter 5 ml de réactif GUS (mM X-gluc 0,5 (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique), 10 mM d'EDTA, 0,5% de Triton X-100 v / v, 0,5 mM de potassium ferricyanure (III), de 0,05 mM de ferrocyanure de potassium (II), complétée au volume final avec 0,1 mM de tampon phosphate pH 7; voir. Hawkins et al 16) à chaque tube. Si le tissu est pas complètement immergé, ajouter plus réactif de GUS.
  4. Incuber les tubes pendant 10 minutes à 55 ° C dans l'obscurité.
  5. Incuber les tubes pour un autre 12-16 h sur un incubateur agitateur à 37 ° C dans l'obscuritéen utilisant une agitation modérée (entre 30 et 60 tours par minute) pour permettre le mélange.
  6. Lors du retrait de secoueur incubateur vérifier de manière aléatoire le pH du réactif GUS dans un petit sous-ensemble de tubes en utilisant du papier de tournesol avec une gamme de pH 0-7.
    1. Si l'un des tubes ont un pH inférieur à 6, puis les étiqueter. Continuez à vérifier le reste des tubes pour confirmer le pH et l'étiquette si le pH est de 6 ou ci-dessous.
      Remarque: Les échantillons ayant un pH inférieur à 6 peut ne pas être adapté à l'analyse. Ces échantillons doivent être exclues de l'analyse.
  7. Décanter réactif GUS et le remplacer avec suffisamment de 70% d'éthanol pour couvrir les tissus.
  8. Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

6. Identification de Transgenic Tissue

  1. En utilisant des pinces, prendre toutes les fenêtres cambium d'un tube et placer dans un petit plateau ou boîte de Pétri pour permettre la visualisation microscopique.
  2. En utilisant un microscope de dissection entre 1X et 4X grossissement, identifier et compter le nombre de cellules ou de tissusqui ont une coloration bleu vif. des cellules ou des tissus colorés bleus sont appelés un secteur à partir de ce moment-là. Tally dans les voies suivantes.
    1. Pour les échantillons où le phloème a été éliminé (étape 5.1.1), compter le nombre de secteurs dans le tissu cambial trouvé sur la surface du xylème en développement (secteur cambium, figure 1a).
    2. Pour les échantillons qui ont été coupés en disques (étape 5.1.2), compter les secteurs de nombres trouvés dans les différents types de cellules ou de tissus (figure 1b, 1c, 1d). Les secteurs peuvent être trouvés dans les types de tissus suivants: le périderme (périderme secteur, Figure 1e), le phloème (phloème secteur, figure 1f), cambium Secteur parenchyme (secteur cambial, Figure 1g, 1h, 1I), parenchyme des plaies (plaies, Figure 1j) et thylles (secteur Tylose, figure 1k).
      1. Au cours d'un microscopeVALUATION veiller à ce que les deux côtés d'un disque ont été consultés et que les secteurs qui se produisent à travers deux disques sont appariés de sorte que les chiffres ne sont pas surestimées.
  3. Placez les secteurs seulement le tissu contenant dans le tube contenant 70% d'éthanol et de stocker jusqu'à ce que nécessaire.
  4. Répétez l'étape 6.1 à 6.3 pour toutes les fenêtres supplémentaires cambiales y compris le contrôle positif et / ou négatif.
  5. Calculer l'efficacité de transformation moyenne pour chaque type de secteur pour chaque gène ou promoteur d'intérêt et les commandes séparément en divisant le nombre total de secteurs par le nombre total de 1 cm 2 fenêtres cambiales pour obtenir un nombre moyen de événements de transformation par cm 2 de Cambium inoculée (ATScm -2).
  6. Passez à l'étape 7.2 et 8 pour l'analyse des profils d'expression de promoteur et de l'étape 7.1, 7.2 ou 7.3 pour des techniques pour évaluer la cellule et la morphologie des tissus dans les tissus du cambium.

7. AnalyseCellulaire et tissulaire Morphologie dans cambium

Remarque: Voici une sélection de techniques qui ont été utilisées avec succès pour l'analyse de l'AISS dérivée des échantillons.

  1. Analyse de la zone de xylème cellulaire surface de la lumière, l'épaisseur de la paroi cellulaire et la zone de la paroi cellulaire en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB).
    Remarque: Ce protocole nécessite une préparation minimale de l'échantillon et permet de relativement haut débit d'analyse sectorielle concernant les caractères morphologiques décrits.
    1. A partir de cette étape en avant s'il vous plaît assurer une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et des gants sont utilisés chaque fois que le tissu ligneux est traitée et traitée.
    2. Identifier un secteur cambium pour l' analyse et faire une incision d' environ 0,5 mm de chaque côté de celui - ci en utilisant une seule lame de rasoir bord pour créer un disque (Figure 2a).
    3. Coupez le tissu xylème excès laissant environ 1 mm de tissu xylème sur le côté tangentielle du secteur (Figure 2b).
    4. Prudently coupée transversalement à travers le centre du secteur au moyen d' un double tranchant lame de rasoir fraîche (figure 2c).
    5. Faire deux incisions supplémentaires radiales peu profondes sur le plan transversal de chaque côté du secteur pour délimiter le tissu transgénique (figure 2d). Comme coloration GUS ne pénètre pas profondément dans le tissu suivre les fichiers radiales des cellules de chaque côté du tissu teinté trouvé à la surface du cambium.
    6. Attachez préparé le visage du secteur de cambium jusqu'au stade d'une broche MEB de montage en utilisant du ruban conducteur SEM (figure 2e) et de garder à dessiccateur jusqu'à ce que nécessaire pour la visualisation SEM.
    7. Répétez les étapes 7.1.2 à 7.1.6 pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
    8. L' utilisation d' un SEM dans un mode de faible vide (énergie 5 kV, spot 3,0 nm), de visualiser et de prendre des photos de cellules / tissus dans le secteur ainsi que les cellules / tissus directement à côté du secteur (figure 2f). La quantité de grossissementest fonction des caractéristiques d'intérêt. Pour les fibres de xylème, 2,000X convient (Figure 2g).
    9. Une fois qu'un secteur de cambium a été visualisé et des photographies prises à un grossissement approprié, mesurer xylème cellules / tissus traits morphologiques d'intérêt en utilisant un logiciel de mesure d'image.
    10. Pour l'analyse statistique, entreprendre pairwise multiples analyses à l'aide des tests t appariés pour comparer la différence entre morphologique mesurée dans le secteur transgénique et non transgénique cellules de contrôle / tissus adjacents (mesurée à moins de 0,5 mm du bord du secteur) pour chaque secteur afin de déterminer un p -valeur.
    11. Répétez l'étape 7.1.10 pour le contrôle négatif.
      1. Dans les cas où le contrôle positif montre une valeur p faible (α <0,05), calculer la différence entre les transgéniques et les cellules non-transgéniques / tissu adjacent pour un trait morphologique. Utilisez cette «valeur de différence» dans un test t apparié pour comparer l'effet du gène d'intérêt avec le negative commande pour déterminer une valeur de p.
  2. analyse histochimique des modèles cellulaires cambium / morphologie de tissu ou d'expression de promoteur dans souches cellules / tissus en utilisant la microscopie optique.
    Remarque: Bien que plus de temps, cette méthode permet de plus d' options d'analyse , y compris les aspects de la dynamique du cambium, par exemple, la largeur du cambium ainsi que les modes d'expression de promoteur. En outre, en cas d'impossibilité d'accéder à un SEM, ce protocole peut être utilisé comme une alternative à l'étape 7.1.
    1. Secteur d'accise d'intérêt en utilisant une lame de rasoir et certains tissus environnants sous forme de petits blocs (pas plus de 1 mm 3) et placer directement dans 1-3 ml d'éthanol 100% dans un flacon d' échantillon avec bouchon à vis pendant au moins 2 jours à 4 ° C sur un agitateur. Préparer le petit bloc d'une manière qui permettra la surface d'intérêt à être accessible par un microtome.
    2. Répétez l'opération pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
    3. Retirer le liquide et le remplacer par 25% d'éthanol: 75% LR mélange blanc pendant 2 jours le maintien de conditions.
    4. Répétez l'étape 7.2.3 avec 50% d'éthanol: 50% de blancs LR, 25% d'éthanol: 75% LR blanc et finalement deux fois avec 100% LR blanc.
    5. Placez petit bloc dans Incorporation Mold avec la surface d'intérêt aligné à la fin à court et à couvrir soigneusement avec LR blanc frais et polymériser selon les instructions du fabricant.
    6. Couper 5 um sections de la surface d'intérêt sur un microtome rotatif et monter sur une lame de verre. Utiliser la safranine O (0,01%) pour visualiser la coloration de la paroi cellulaire et / ou d'autres caractéristiques.
    7. Ajouter un milieu de montage, placer une lamelle et laisser reposer pendant une nuit.
    8. Vue sous un microscope optique entre 100X et 600X grossissement et de capture d'image.
    9. Capturez traits morphologiques à partir d'images en utilisant le logiciel d'image de mesure.
      1. Pour une analyse statistique des caractères quantitatifs morphologiques, suivre sur l'étape 7.1.10.
      2. Pour l'analyse qualitative des traits morphologiques,comparer et décrire les tendances observées pour le gène ou promoteur d'intérêt et le négatif et / ou contrôle positif.
  3. Analyse des microfibrilles Angle (MFA) en fibres macérés en utilisant la lumière Microscopy.
    1. Transgénique d'accise xylème tissus directement à partir d' un secteur, ainsi que du tissu non-transgénique adjacente ( à moins de 0,5 mm, la figure 2h) et dans 1,5 ml tubes séparés. Répétez l'opération pour tous les autres secteurs, y compris ceux du contrôle négatif.
    2. Suivez les étapes 7.3.3 à 7.3.5 dans une hotte.
    3. Ajouter 250 ul de peroxyde d'hydrogène et de 250 ul d'acide acétique glacial à chaque tube.
    4. Placer le tube dans le bloc thermique à 90 ° C pendant 2 heures dans une hotte.
    5. Retirer le tissu de tubes et rincer soigneusement avec de l'eau distillée au moins deux fois.
    6. L'utilisation d'un milieu de montage soluble dans l'eau, monter le tissu sur une lame de verre et démêler avec des pinces pointues avant l'apposition d'une lamelle.
    7. Vuesous une lumière des images de microscope et de capture de fibres individuelles à un grossissement supérieur à 400X.
    8. Pour déterminer l' angle de microfibrilles de fibres, mesurer l'angle entre les ouvertures de puits et / ou des stries de la paroi cellulaire et l'axe long de la fibre (figure 2i) en utilisant le logiciel de mesure de l' image.
    9. Pour l'analyse statistique, suivre sur l'étape 7.1.10.

8. Analyse de promoteur Patterns d'expression

  1. Analyse des promoteurs Patterns d'expression dans les tissus de la tige secondaire.
    1. Tally la fréquence de chaque type de secteur pour le promoteur d'intérêt ainsi que les contrôles positifs et négatifs comme indiqué à l'étape 6.2.2.
    2. Comparer la fréquence des différents types de secteur pour le promoteur d'intérêt avec le contrôle positif à l'aide des tests du chi carré pour établir les valeurs p. Une analyse plus poussée de la spécificité cellulaire / tissulaire peut être entreprise en utilisant l'étape 7.2 selon les besoins.
      1. Si plus d'un promoteurd'intérêt est étudié puis répétez cette comparaison analyse de décision entre tous les promoteurs d'intérêt et le contrôle positif.
      2. Si les secteurs ou la coloration au bleu sont observées dans le contrôle négatif , puis l' ajouter à l'analyse ou abandonner en fonction de l' étendue ou si la coloration endogène est suspectée (voir Discussion).
  2. Analyse des promoteurs profils d'expression Pendant cambial Développement Derivative and Differentiation.
    1. En utilisant un microscope de dissection, de visualiser tous les secteurs du cambium (Figure 1g, 1h, 1i) identifiés à l' étape 6.2 et déterminer la présence / absence de coloration au bleu en trois types dérivés du cambium de tissus; le phloème (P), le développement de xylème (X1) ou le xylème mis au point (X2) (voir figure 3a).
    2. Comme à l'étape 8.1.2, comparer la fréquence de la présence / absence de coloration GUS dans les régions P, X1 et X2 de promoteur d'intEREST avec le contrôle positif à l'aide des tests du chi carré pour établir les valeurs p. Une analyse plus poussée de la spécificité cellulaire / tissulaire peut être entreprise en utilisant l'étape 7.2 selon les besoins.
      1. Voir les étapes 8.1.2.1 et 8.1.2.2 pour des considérations supplémentaires.

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Representative Results

En utilisant ce protocole tous les types de cellules souches et de tissus vivants secondaires se sont avérés être sensibles à A. tumefaciens et les transformations ont été définies dans les types de secteur en fonction du type de cellule initialement transformée et ce modèle de croissance du développement ultérieur. Types sectoriels comprennent périderme, phloème, cambium, parenchyme plaie et tylose (figure 1b, 1c, 1d) et peuvent être trouvés dans des endroits cohérents décrivent dans le reste du présent paragraphe. Un secteur de périderme se compose d'un groupe de cellules transformées trouve exclusivement dans le périderme et ne se prolongeant dans le phloème (figure 1E). Un secteur phloème peut être trouvé à divers endroits entre la couche d'amorçage et le périderme, cependant, ne se prolongeant dans ces tissus environnants (Figure 1f). Un secteur de cambium est composé de tissus xylème / cambium / phloème transformés dérivés de transformation de première cambium et peut se produire dans trois modèles distincts: i) secteur 'full' cambiale, cellules transformées xylème / cambium / phloème étendant à partir de la limite du tissu enroulé parenchyme à travers la zone de xylème et cambium au tissu phloème contenant à la fois des rayons et cellules fusiformes ou des éléments de rayons seulement (Figure 1g), ii) «perdu initiale» secteur cambium, une variante du secteur de cambium complète où une première a été perdue de la couche d'amorçage laissant xylème miroir et secteurs phloème et une couche d'amorçage non transformé (Figure 1h), iii) «xylème seulement« secteur de cambium, xylème transformé allant de la limite du tissu enroulé parenchymes à des longueurs variables dans le tissu nouvellement formé xylogenic mais sans jamais atteindre la couche d'amorçage (figure 1i). Un secteur enroulé parenchyme contient transformé cellules du parenchyme enroulées trouvés comme étant soit une cellule ou un groupe de cellules individuelles, souvent en fil radiales, situé entre le bois pré-existant et xylème nouvellement formé (figure 1j). Un secteur de tylose composé de thylles de navires transformés trouvés dans le bois pré-existante (Figure 1k).

Données sur l' efficacité de transformation représentatifs pour les deux gènes et promoteur des études d'intérêt ainsi que leurs contrôles positifs sont présentés dans le tableau 1 et le tableau 2. Les données ont été tirées de deux grands essais réalisés sur la même période de temps (Dec-avril) dans les mêmes génotypes d'eucalyptus et de peupliers sur deux années successives impliquant un certain nombre de gènes et promoteurs d'intérêt formation du bois. En se concentrant sur les contrôles positifs à partir du promoteur des études d'intérêt (tableau 2), le type de tissus les plus sensibles à A. transfert tumefaciens T-ADN est tissus cambium avec environ 60% et 40% des secteurs identifiés dans les eucalyptus et les peupliers , respectivementétant les secteurs du cambium. Dans eucalyptus, le prochain type de secteur le plus abondant est enroulé parenchyme à 35% , tandis que les autres types du secteur tous avaient des valeurs de ATScm en dessous de 5%. Dans les peupliers, le prochain type de secteur le plus abondant est enroulé parenchyme à 20%, suivi par le phloème à 15%, tandis que le reste des types du secteur ont été trouvés à une fréquence inférieure à 5%. Une plus grande probabilité de trouver un secteur dans une fenêtre cambium, ainsi que plus grand nombre de secteurs cambiales identifiés sont typiques où le protocole de pelage phloème est utilisé ( voir le tableau 1, l' étape 5.2.1) en raison de la possibilité pour la coloration et la possibilité de visualiser le toute la zone du cambium.

Lors de l'élaboration de ces protocoles un certain nombre de variables ont été étudiées dans le cadre des essais d'optimisation de protocole. Ces concentration bactérienne inclus dans Inoculation Media, le type de support utilisé dans Inoculation Media, ajout de Acétosyringone à Ensemencement des médias, l' âge des tissus et A. souche Agrobacterium ainsi que le temps de l' inoculation et le génotype. Secteur cambiale ATScm -2 données de ces essais sont présentés dans le tableau 3 et le tableau 4. La majorité des variables étudiées, lorsqu'il est modifié, conduire à des changements dans cambium ATScm -2 chez les deux espèces et comprenait notamment l' augmentation de la concentration de bactéries dans le Inoculation médias, l' utilisation de MS dans le Inoculation médias et choix de A. souche Agrobacterium. En outre, le temps de l' inoculation et l' arbre génotype a montré des différences significatives dans les eucalyptus avec inoculations en début d' été montrant plus ATScm -2 tandis que les clones d'eucalyptus SG21 et SG44 ont montré cambium plus ATScm -2, 41,6 et 40,4, par rapport respectivement aux autres à travers tous les mois combinés.

La taille moyenne du secteur de cambium est variable et dépend de la quantité de la croissance radiale et tangentielle dans une fenêtre de cambium. Dans une sous-échantillon de 53 secteurs dans le peuplier, cultivés pendant environ 4 mois, la largeur tangentielle des secteurs au cambium a varié entre 0,09 et 0,58 mm avec une moyenne de 0,27 mm tandis que la croissance radiale à travers les fenêtres du cambium distance de 0,7 à 2,2 mm avec une moyenne de 1,35 mm. Lorsqu'ils sont combinés, ces prévus entre 0,063 mm 2 et 1.276 mm 2 de tissu transgénique pour l' analyse. Dans un autre sous - échantillon de 188 secteurs dans les mêmes espèces, où entre 1,5-4 mm de croissance radiale à travers la fenêtre du cambium a été observée sur environ 5 mois, la masse moyenne du secteur était de 72 pg (tableau 5).

La quantité de tissu transgénique créé a été montré pour fournir des cellules et / ou tissus pour effectuer des mesures morphologiques, ainsi que pour l'étude de l'activité de promoteur suffisante. Par exemple, l'influence de trois Eucalyptus grandis FLAs sur un certain nombre de fibres de xylème traits morphologiques 9 était ex explorés dans les clones d'eucalyptus et a révélé des rôles possibles pour EgrFLA2 dans la détermination AMF et EgrFLA1 dans la détermination de la taille des cellules (tableau 6). De plus, les modèles d'expression d'Eucalyptus grandis promoteur du gène de la CESA dans le xylème de développement (X1), xylème développée (X2) et le phloème (P) des tissus 10 identifiés significativement différents motifs d'expression entre EgrCESA1, 2, 3 et EgrCESA4, 5, 7 dans eucalypt tiges. Dans cette analyse, EgrCESA1, 2, 3 se sont révélés être principalement exprimé dans le développement du tissu xylème tandis EgrCESA4, 5, 7 ont été montrés à exprimer dans le xylème et le développement des tissus du phloème (Figure 3b, tableau 7). Tous les promoteurs EgrCESA ont montré significativement différents profils d'expression au contrôle positif (CaMV35S promoteur) (tableau 7).

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Figure 1:. Types de secteurs Transgenic (a) des secteurs cambiales comme vu sur la surface du xylème exposée après le traitement en utilisant le protocole de pelage phloème (étape 5.2.1). Disques montrant une gamme de types de secteur sur la surface transversale du peuplier (b) et eucalypt (c) tiges après le traitement en utilisant le protocole de coupe transversale (étape 5.2.2). (D) Schéma de la gamme de types de secteurs trouvés dans les tiges des plantes. Des exemples de secteur périderme (e), le secteur du phloème (f), le secteur «plein» de cambium (g), «perdu initiale» secteur de cambium (h), 'xylème seulement' secteur de cambium (i), le secteur du parenchyme des plaies (j) et secteur tylose (k) en peuplier. Les flèches noires indiquent où sont situés plus petite taille du secteur. Toutes les barres d'échelle = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Préparation des secteurs cambiales pour l' analyse morphologique en utilisant SEM et microscopie optique (a) Excision du secteur du disque contenant. (B) Disque garni pour éliminer l' excès de tissu. Coupe à travers la surface transversale du secteur transgénique (c). (D) L' introduction de deux coupes radiales pour aider à localiser le tissu transgénique sous SEM. (E) Tissue monté sur une broche SEM en utilisant du ruban conducteur. (F) la représentation de la zone de tissus transgéniques et non transgéniques qui doit être imagée pour l' analyse. (G) d'image typique de fibres de xylème et ray cellules capturées au 2,000X grossissement. (h (I) des fibres macérée vues en microscopie optique montrant l'angle des creux et / ou des stries de la paroi cellulaire et à l'axe long de la cellule. flèche noire indique l'ouverture de la fosse. Les barres d'échelle = af, h = 1 mm, g, i = 20 pm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Analyse et résultats des gènes modèles d'expression de promoteur de dérivés de cambium (a) Représentation de la P (phloème), X1 (xylème développement) et X2 (xylème développé) des régions.. (B) Les résultats indiquant la proportion de P, X1 et X2 coloration dans les secteurs du cambium d'un essai portant sur une gamme de CESA Eucalyptus grandis transformé en tiges d'hybrides d'eucalyptus. Les données provenant de Creux et al. 10. n = nombre de secteurs évalués. Barre d' échelle = 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les espèces d'arbres Type de vecteur Nombre de gènes d'intérêt utilisés Nombre total de fenêtres créé Nombre total de fenêtres où un secteur a été identifié (en%) Cambium ATScm -2 cambium (dans les fenêtres où un secteur a été identifié)
Hybrides Eucalyptus globulus x camaldulensis (total de trois clones) Contrôle positif (Les gènes d'intérêt) 1 (GUS uniquement) 96 97% 45.1 (1.5)
Les gènes d'intérêt 20 630 92% 46.1 (2.2)
Populus alba 'pyramidal' Contrôle positif (gènes d'intérêt) 1 (GUS uniquement) 110 74% 10.8 (1.5)
Les gènes d'intérêt 20 700 81% 14,6 (0,8)

Tableau 1:. Cambium ATScm typique -2 pour le contrôle positif et les gènes d'intérêt Les chiffres ont été provenant des études menées sur deux années consécutives dans le même eucalypt et clones de peupliers en utilisant une gamme de gènes et le protocole peel de récolte phloème (étape 5.2. 1). valeurs d'erreur standard entre parenthèses. </ P>

<td> 1 (GUS uniquement)
Les espèces d'arbres Type de vecteur Nombre de promoteurs / gènes Nombre total de fenêtres créé Nombre total de fenêtres où un secteur a été identifié (en%) ATScm -2 tous les secteurs ATScm -2 périderme ATScm de phloème ATScm de la cambium ATScm -2 Wound Parenchyme ATScm -2 Tylose
Eucalyptus globulus x camal-
hybrides dulensis (total de trois clones)
contrôle positif 118 63% 25,74 (2,35) 0,24 (0,07) 0,89 (0,19) 15,7 (1,71) 8,84 (1,4) 0,07 (0,03)
Promoteurs d'intérêt 28 1050 31% 14,67 (1,77) 0,02 (0,01) 0,05 (0,01) 13,79 (1,75) 0,78 (0,21) 0,03 (0,01)
Populus alba 'pyramidal' contrôle positif 1 (GUS uniquement) 110 54% 12,37 (1,77) 0,22 (0,07) 1,85 (0,29) 5,07 (0,6) 2,78 (0,75) 0,29 (0,53)
Promoteurs d'intérêt 28 990 26% 8,28 (1,18) 0,16 (0,04) 0,9 (0,09) 6,67 (1,16) 0,27 (0,07) 0,28 (0,11)

Tableau 2:. ATScm du secteur typique -2 pour le contrôle positif et les promoteurs d'intérêt Les chiffres ont été provenant des études menées sur deux années consécutives dans le même eucalypt et clones de peupliers en utilisant une gamme de séquences de promoteur et le protocole disque de récolte (étape 5.2. 2). Les valeurs ATScm de provenaient de fenêtres où un secteur a été identifié seulement. Valeurs d'erreur standard entre parenthèses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Espèce Procès Traitement description de Le nombre de fenêtres de traitement -2
Eucalyptus globulus Concentration de A. tumefaciens dans Inoculation médias Resuspendues dans 25 ml MS dix 1,4 (0,62)
Remises en suspension dans 5 ml MS dix 1,6 (0,72)
Remises en suspension dans 1 ml MS (contrôle) dix 2,4 (1,16)
Type de support dans Inoculation médias KG dix 0,4 (0,22)
MS (contrôle) dix 2,4 (1,16)
Addition d'Acétosyringone à l'inoculation des médias Avec acétosyringone 11 0,9 (0,37)
Sans Acétosyringone (contrôle) 11 0,6 (0,64)
Âge du tissu de la tige inoculée 6 mois (control) 11 1,1 (0,66)
18 mois 11 1,8 (0,95)
A. tumefaciens AGL1 (contrôle) 18 0 (0)
C58 18 0,1 (0,1)
LBA4404 18 0,6 (0,4)
Populus alba 'pyramidal' Concentration de A. tumefaciens dans les médias Resuspendues dans 25 ml MS dix 2,2 (0,55)
Remises en suspension dans 5 ml MS dix 2,7 (0,63)
Remises en suspension dans 1 ml MS (contrôle) dix 5,1 (1,58)
Type de support utilisé pour la tige inoculation KG dix 2,8 (0,71)
MS (contrôle) dix 5,1 (1,58)
Addition d'Acétosyringone à l' inoculation des médias Avec acétosyringone 11 0,3 (0,14)
Sans Acétosyringone (contrôle) 11 0,5 (0,25)
Âge du tissu de la tige inoculée 6 mois (contrôle) 11 1,5 (0,33)
18 mois 11 1,5 (0,63)
A. tumefaciens AGL1 (contrôle) 20 8.1 (2)
C58 20 12.5 (2)
LBA4404 20 11.1 (2)

Tableau 3: ATScm -2 valeurs cambium pour une gamme de variables étudiées dans le cadre de pistes d'optimisation de protocole. Les variables ont été étudiées dans un clone de peuplier et une gamme d'Eucalyptus globulus individus à travers un certain nombre d'années avec cambiales ATScm -2 données présentées. fenêtres cambium ont été récoltées en utilisant le protocole disque de récolte (étape 5.2.2). valeurs d'erreur standard entre parenthèses.

Eucalyptus globulus x camaldulensis clone ID Nombre de fenêtres pour chaque mois cambiales Printemps tardif (Novembre) l'inoculation de cambium ATScm Été (Décembre) Inoculation Early cambium ATScm Cambium ATScm Mid Summer (Janvier) Inoculation Fin de l' été (Février) le Ensemencement de cambium ATScm Cambium ATScm Early Autumn (Mars)Inoculation Cambium ATScm -2 tous les mois combinés
SG5 dix 15,7 (7,8) 50,7 (13,7) 10.5 (5.1) 30.7 (4.4) 16.8 (6.3) 24.9 (4.3)
SG6 dix 6.1 (3.1) 38,5 (15,1) 4,5 (1,7) 14,5 (3,3) 27.6 (8.4) 18.3 (4)
SG13 dix 28.4 (6.7) 41,8 (9.1) 16,1 (7) 29.3 (5.2) 19.8 (4.3) 27,1 (3.1)
SG18 dix 6,7 (2,9) 18.3 (6.7) 17.4 (3.4) 19.2 (6.1) 18.1 (6.3) 15,5 (2,4)
SG21 dix 38,7 (14,3) 77 (17,5) 23,9 (5,7) 27,5 (6,9) 40,7 (13,5) 41,6 (6)
SG35 dix 23,5 (10.2) 42,8 (12.2) 7,6 (2,5) 17.6 (4.3) 31,3 (4,6) 24,6 (3,8)
SG37 dix 19.7 (8) 55,2 (14,5) 7,4 (1,8) 35 (10.4) 15,9 (4,5) 26.6 (3.8)
SG39 dix 12.5 (2.4) 23.6 (6.3) 6,9 (3) 26.3 (8.1) 7.3 (2.3) 15,5 (2,6)
SG40 dix 24.8 (11) 24,5 (6,8) 14 (5.6) 35,6 (6.1) 19.9 (4.2) 23,8 (3.2)
SG44 dix 22.3 (3.4) 63 (29,3) 9,8 (2,6) 52,5 (10.3) 54,3 (15) 40,4 (7,4)
SG46 dix 15.3 (5.2) d> 63,9 (20,1) 23,6 (4) 22,5 (4,8) 17.4 (4.9) 28.5 (5.1)
Cambial mensuel ATScm -2 19,9 (5) 45,3 (9.1) 12,6 (2,8) 27,8 (4,5) 24 (5.1)

Tableau 4:. Influence du génotype et l' heure de l' inoculation sur ATScm cambium -2 dans les clones d'eucalyptus Dix fenêtres ont été introduits chaque mois au cours de la saison de croissance pour 10 différents clones Eucalyptus globulus x camaldulensis qui ont tous été récoltés en mai. Les données mensuelles sont présentées pour chaque génotype avec un ATScm mensuel et génotypique moyenne globale -2 présenté également. fenêtres cambium ont été récoltées en utilisant le protocole peel de récolte phloème (étape 5.2.1). valeurs d'erreur standard entre parenthèses.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Nombre des plantes Nombre de secteurs cambiales excisé La masse totale de tous les secteurs (pg) Masse moyenne des secteurs (pg)
1 11 750 68
2 19 1460 77
3 21 160 8
4 26 4460 172
5 15 1320 88
6 22 2490 113
7 19 1720 91
8 30 830 28
9 25 360 14
Total 188 13.550 72

Tableau 5:. Masse typique d'un secteur cambium 45 fenêtres dans neuf plantes ont été étudiées dans le peuplier pour déterminer la masse moyenne d'un secteur et récolté en utilisant le protocole disque de récolte (étape 5.2.2). Les plantes ont été cultivées pendant 5 mois et la croissance radiale à travers une fenêtre du cambium était entre 1-4 mm.

Morph-
trait ologique
GUS seulement (témoin positif) Tissus non transgéniques (GUS uniquement) P-valeur Gene d'intérêt 1 (FLA1) Tissus non-transgénique (FLA1) P-valeur Gene d'intérêt 2 (FLA2) Tissus non-transgénique (FLA2) P-valeur Gene d'intérêt 3 (FLA3) Tissus non-transgénique (FLA3) P-valeur
Cellule moyenne Épaisseur de paroi (um) * 1,81 (0,1) 1,65 (0,1) 0,2692 1,47 (0,14) 1,55 (0,12) 0,6403 1,65 (0,13) 1,78 (0,13) 0,4839 1,59 (0,12) 1,63 (0,11) 0,8254
Zone mur Cell moyenne (de um 2) * 69.1 (4,74) 60,7 (2,03) 0,1229 64,1 (15,68) 59,9 (9,79) 0,5004 61,6 (3,4) 65 (3.96) 0,5182 61,9 (3,56) 61.5 (3.16) 0,9438
Zone cellulaire moyenne (pm 2) * 115,9 (11.01) 99,9 (5,1) 0,2041 124,4 (6,1) 108 (4.36) 0,0445 110,8 (8,45) 111,3 (9,06) 0,9671 108,5 (4,43) 103 (3,07) 0,3204
Zone Lumen moyenne (de um 2) * 46,9 (7,55) 39,2 (4,89) 0,407 60,2 (5,28) 48.1 (4.46) 0,0991 49,2 (7,56) 46,3 (7,5) 0,7882 46,6 (3,31) 41,5 (3,9) 0,3264
Moyenne microfibrilles Angle (O) # 24,3 (0,75) 24,2 (0,45) 0.8648 22,3 (0,82) 22,7 (0,7) 0,5664 23,7 (0,55) 26.6 (0,5) 0,0001 26 (0,88) 27,2 (0,72) 0,0903

Tableau 6:. Les mesures de la morphologie de l' AISS fibre dérivée de gène d'étude d'intérêt Comparaison de la paroi cellulaire de la fibre, la taille des cellules et des mesures macrofinancière prises à partir de fibres transgéniques provenant de Eucalyptus clones globulus x camaldulensis tiges transformé avec Eucalyptus grandis SADF (EgrFLA1, 2, 3) et contrôle positif (GUS uniquement) avec les fibres adjacentes de contrôle transgéniques non. Les données provenant de MacMillan et al. 9. * Indique essai portait sur la mesure des 10 fibres dans 10 secteurs (total 100 fibres). # Indique essai portait sur la mesure de 5 fibres dans 20 secteurs (total de 100 fibres). α <0,05 en gras. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

11.05
EgCESA1 EgCESA2 EgCESA3 EgCESA4 EgCESA5 EgCESA7 GUS seulement (témoin positif)
EgrCESA1 0,708 2.839 8,856 9,976 9.18 29,165
EgrCESA2 1.11 12,008 11,363 30,234
EgrCESA3 15,151 16.123 15,488 37,791
EgrCESA4 4,852 0,108 46,858
EgrCESA5 3.275 11,278
EgrCESA7 36,082
GUS seulement (témoin positif)

Tableau 7: Chi 2 valeurs dérivées de la comparaison des profils d'expression de promoteur dans les dérivés de cambium Chi 2 Analyse comparant la présence / absence de coloration GUS dans P, X1 et la région X2 de dérivés de cambium. entre six Eucalyptus grandis CESA promoteurs de gènes séquences (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) et le contrôle positif (GUS uniquement). Les données provenant de Creux et al. 10. α <0,05 montre soulignement.

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Discussion

Le protocole de l'AISS est une méthode relativement simple et efficace pour la création de tissus souches transgéniques dans les espèces d'arbres en l'espace de quelques mois pour l'analyse des gènes et des promoteurs d'intérêt impliqués dans le bois et la tige formation. Peu d' efforts, au - delà de plantes garder en vie, est nécessaire pour cultiver des tissus souches transgéniques après l' inoculation , qui contraste avec les méthodes in vitro , où une vaste culture est nécessaire pour maintenir le tissu ou les plantes, où la production de bois peut prendre jusqu'à ans pour commencer ou où un véritable tige secondaire est pas créé 1. AISS a également été montré pour être applicable à un large éventail d'espèces d'arbres, y compris les espèces du genre Populus, Eucalyptus et Pinus 6 ainsi que Acacia et Corymbia (données non présentées) , où très peu, le cas échéant, l' optimisation est nécessaire pour tirer le tissu transgénique. En utilisant cette méthode, il est donc possible d'enquêter sur un certain nombre ogènes f ou promoteurs d'intérêt dans la plupart des espèces d'intérêt. En outre, le protocole peut être utilisé seul ou en association avec plus largement utilisé dans les techniques in vitro où plusieurs gènes peuvent être étudiés à l' aide de l' AISS en premier lieu d'identifier les candidats potentiels de faire avancer à impliquer davantage les méthodes in vitro.

Les exemples décrits montrent que les secteurs suffisants peuvent être créés pour entreprendre une analyse en aval de seulement un petit nombre de fenêtres cambiales transgéniques. Avec les valeurs ATScm de de 46,1 en eucalypt et 14,6 en peuplier seulement une ou deux fenêtres cambiales seraient suffisantes pour enquêter sur un seul trait comme il est possible d'ajouter de nombreuses fenêtres à une tige de plante unique ou de reproduire sur de nombreuses plantes. En pratique, cependant, pas toutes les fenêtres cambiales conduisent à la création d'un secteur cambiale qui peut être utilisé (voir le tableau 1, tableau 2) que la taille des secteurs peut varier, ils sont généralement petitset dans les cas peuvent être situés à proximité les uns des autres ce qui limite leur utilisation aux fins d'analyse en aval. En outre, le gène d'intérêt peut avoir un impact sur la viabilité cellulaire 12 ou d' autres aspects du développement des cellules pouvant résulter en l'absence totale de secteurs transgéniques pour un gène d'intérêt spécifique. Il est donc conseillé de toujours viser un plus grand nombre de fenêtres que pourrait être nécessaire pour l'analyse. La même prudence doit être appliquée lors de l' utilisation de l' AISS pour les études du promoteur que la variabilité significative peut être attendue avec peu / faible ou pas d' expression observée dans certains cas (tableau 2). Toutefois, un plus petit nombre de secteurs, aussi peu que 6, se sont révélés être utilisées avec succès pour l' analyse 10. Ces résultats montrent que des expériences tout à fait modestes impliquant seulement un petit nombre de fenêtres peuvent conduire à des idées importantes dans la fonction des gènes et de l'activité du promoteur.

Du point de vue de l'analyse, la proximité de transgentissus ic et non transgénique fournit un outil puissant pour identifier les petites mais significatives différences de traits entre les gènes d'intérêt. Les cellules et les tissus prélevés directement adjacents les uns aux autres sont du même arrière-plan génotypique et ont été influencés par les mêmes conditions environnementales en réduisant le nombre de variables indépendantes et de simplifier l'analyse statistique requis. Du point de vue de l' échantillonnage, l' analyse de puissance sur l' AISS dérivée des données de plusieurs expériences (par exemple, le tableau 6), a montré qu'un petit nombre de mesures par secteur, par exemple, l' épaisseur de la paroi cellulaire de 3-5 cellules par secteur, et en mesurant un plus grand nombre de secteurs, par exemple, 20-25 secteurs pour un gène d'intérêt, fournit une stratégie d'échantillonnage plus efficace et statistiquement robuste. Chaque secteur représente un événement de transformation indépendant ou «ligne» de cellules avec l'analyse statistique entrepris de déterminer l'effet moyen de multiples événements de transformationimpliquant le gène d'intérêt. De même, la capacité de transformer tous les tissus de la tige offre l'occasion d'étudier l'expression des promoteurs d'intérêt sur l'ensemble tige et plus particulièrement lors de la différenciation de cambium. protocoles AISS décrits ici fournissent un pipeline fiable et validée à partir de la création du tissu transgénique jusqu'à la récolte des échantillons, la collecte et l'analyse des données pour les tissus et la morphologie des cellules et des modèles d'expression de promoteur.

Dans la plupart des cas, les secteurs sont le résultat de la transformation d'une cellule unique, qui, par division cellulaire peut avoir donné lieu à un certain nombre de cellules et de tissus dérivés. Par exemple, un secteur du cambium découle de la transformation d'une cellule unique qui post enroulé récupération devient une première cambium qui à son tour se divise periclinally et anticlinally pour créer un secteur étendant tout le chemin de la plaie d'origine dans le phloème. Dans ces cas, la transformée initiale a été maintenuedans le cambium jusqu'à ce que le moment de la récolte et une variante «complet» est observé, cependant, où cette première est perdue à partir de la couche de cambium pendant la croissance radiale et remplacée par une puis non transformée cellule voisine par «cellule-invasion», un « variante initiale perdue »sera le résultat. Afin d'assurer une classification correcte des types de secteurs et d'aider à l'interprétation des résultats, il est fortement recommandé que la familiarisation avec les caractéristiques anatomiques des réponses secondaires de développement de la tige et la plaie des conditions préalables à l'analyse des résultats de l'AISS. En outre, des tests réguliers du pH du réactif de GUS est recommandée (voir étape 5.6). Un faible pH (par exemple, en dessous de 6) peut conduire à l' activation de ß-glucuronidases endogènes (GUS) dans la tige de la plante qui peut masquer l'ampleur réelle d'un secteur ou conduire à l'identification de faux positifs. Lorsque cela est suspectée, il est recommandé que ces échantillons soient exclus de l'analyse. Le protocole de réactif GUSappliquées de manière fiable dans les études décrites ici afin d'atténuer les problèmes potentiels avec l' activité de GUS endogène a été adapté de Hawkins et al. (2002) 16 et utilise les étapes clés supplémentaires , y compris deux rinçages avec un tampon phosphate pour équilibrer les échantillons à pH7, et traitement thermique à 55 o C pendant 10 minutes pour déstabiliser l' activité GUS endogène 17,18. GUS réactif perméabilité est également limitée et est responsable de moins de secteurs étant identifié en utilisant le protocole du disque transversal par rapport au protocole de pelage phloème.

Toutes les espèces ont montré mis à l'essai pour être sensibles à la transformation du tissu cambial. Toutefois, des différences significatives dans la ATScm -2 entre et au sein genre et l' espèce ont été observés. De même , la souche de A. tumefaciens et le temps / saison d'inoculation peuvent influencer ATScm -2. Il est suggéré que d'entreprendre des essais préliminaires de ces variables dans la spécies et génotypes sous enquête préalable à une plus grande adoption à grande échelle du protocole. Théoriquement, il n'y a aucune limite à l'âge ou la taille des tiges dont l'AISS pourrait être appliqué aussi longtemps que il y a un cambium en pleine croissance. inoculer Cependant, pour faciliter le traitement en aval des secteurs de tissus transgéniques, il est recommandé de tiges d'environ 1 cm de diamètre.

AISS est pas sans ses limites. La taille relativement petite des secteurs de tissus transgéniques limite actuellement les méthodes de phénotypage en aval et, par conséquent, seul un nombre limité de ces méthodes ont été couramment utilisés à ce jour. Ces méthodes sont principalement concentrées sur la caractérisation morphologique tel que décrit ci - dessus, ainsi que l' estimation semi - quantitative de la composition des monosaccharides dans la paroi cellulaire secondaire , comme il est indiqué dans l' introduction 9,11. Avec l'avènement et le raffinement des nouvelles technologies pour analyse fine échelle de matériaux biologiques il y a un potentiel pour développer phénotypage supplémentairespipelines pour les secteurs de l'AISS, par exemple dans l'analyse de la composition de la paroi cellulaire. Il reste toutefois difficile d'effectuer quantitative, secteur par secteur, des études d'expression génique d' acide ribonucléique (ARN) à base de protéines et / ou d' identifier et de propager l' AISS dérivé des cellules transgéniques par culture in vitro pour l' analyse supplémentaire en raison de la nature destructrice de l'essai GUS . Certains gènes rapporteurs fluorescents et l'impression de tissus ont été mis à l'essai pour quantifier l'ARN à partir des secteurs individuels, mais à ce jour ces approches ont pas été utilisées avec succès pour les moyennes et criblage à haut débit dans les opérations de routine. En outre, les techniques transgéniques non mis à l'essai à ce jour tels que l'ARNi pourrait compliquer l'analyse où l'expression de GUS et la régulation du gène cible peuvent pas co-localize.

Bien qu'il existe des limites actuelles, l'incorporation de technologies nouvelles et émergentes et les méthodes d'analyse sont susceptibles de surmonter ces limitations, le renforcement du rôle de l'AISS amoyen sa protocole haut débit pour disséquer la nature moléculaire complexe de différenciation cambium, le développement du bois et des tiges formation.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plants NA NA Please consult local nursery suppliers for plants as needed
Agrobacterium strain NA NA There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.
Binary vector (gene and promoter) NA NA We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.
LB media Sigma L3022 The same product could be sourced from another company
LB media with agar Sigma L2897 A like product could be sourced from another company
Antibiotics Sigma NA The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a  range of companies
50 ml Screw top tubes Fisher Scientific 14-432-22 The same product could be sourced from another company
2 ml Microtube Watson Bio Lab 132-620C The same product could be sourced from another company
MS Media Sigma M9274 The same product could be sourced from another company
Scalpel blade no. 11 Sigma S2771 The same product could be sourced from another company
Parafilm "M" Bemis PM996 This is the best product to use to bind the cambial window post creation 
14 ml round bottom tubes Thermo Scientific 150268 The same product could be sourced from another company
EDTA Sigma E6758 The same product could be sourced from another company
Triton Sigma X100 The same product could be sourced from another company
X-Gluc X-GLUC direct You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html
Potassium Ferricyanide(III) Sigma 244023 The same product could be sourced from another company
Potassium Ferrocyanide(II) Sigma P9387 The same product could be sourced from another company
Litmus paper Sigma WHA10360300 The same product could be sourced from another company
Single edge razor blade ProSciTech L055 The same product could be sourced from another company
Double edge razor blade ProSciTech L056 The same product could be sourced from another company
SEM Pin Stub ProSciTech GTP16111 The same product could be sourced from another company
Sample vial with screw cap ProSciTech L6204 The same product could be sourced from another company
Ethanol sigma E7023 The same product could be sourced from another company
LR white ProSciTech C025 The same product could be sourced from another company
Embedding Mould ProSciTech RL090 We recommend this variety, however there are plenty of options available
Water Soulable mounting media ProSciTech IA019 One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.
Hydrogen peroxide Sigma 216763 A like product could be sourced from another company
Glacial acetic acid Sigma A9967 A like product could be sourced from another company
Safranin O ProSciTech C138 A like product could be sourced from another company
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope FEI This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised
ImageJ imaging software can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/

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References

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