से फ्लो द्वारा चूहे गुर्दे से मैक्रोफेज की प्ररूपी विशेषता

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यह पांडुलिपि प्ररूपी और प्रवाह cytometry द्वारा चूहे गुर्दे से निवासी मैक्रोफेज के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। जिसके परिणामस्वरूप दाग कोशिकाओं को भी सेल छँटाई, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण या कार्यात्मक अध्ययन सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार की जानकारी प्रयोगात्मक मॉडल में प्राप्त बढ़ रही है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rubio-Navarro, A., Guerrero-Hue, M., Martín-Fernandez, B., Cortegano, I., Olivares-Alvaro, E., de las Heras, N., Alía, M., de Andrés, B., Gaspar, M. L., Egido, J., Moreno, J. A. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (116), e54599, doi:10.3791/54599 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

इस प्रोटोकॉल के निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संसद के लिए यूरोपीय संघ और राष्ट्रीय दिशानिर्देश 53/2013 के बाद स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अभिकर्मकों और समाधान की तैयारी

  1. बाँझ शर्तों के तहत सभी अभिकर्मकों और समाधान तैयार है और एक लामिना का प्रवाह हुड के नीचे का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें।
  2. धुंधला बफर तैयार (2% भ्रूण गोजातीय सीरम (1x Dulbecco के पीबीएस में एफबीएस))।
  3. खारा के प्रत्येक मिलीलीटर collagenase के 0.5 मिलीग्राम जोड़कर collagenase समाधान तैयार है।
  4. ketamine / xylazine की संज्ञाहरण समाधान तैयार (2: 1 वी / वी)।

2. किडनी छिड़काव और निष्कर्षण

  1. ketamine / xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन (75 मिलीग्राम / 12 मिलीग्राम / किग्रा वजन) द्वारा चूहों anesthetize। ध्यान से जाँच करने के लिए है कि पशु पर्याप्त anesthetized है त्वचा के एक छोटे गुना चुटकी,। तब, जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक मरहम के साथ आंखों को कवर किया। नोट: 4-सोमवें पुराने Wistar चूहों इस परख में इस्तेमाल कर रहे हैं।
  2. एक बार चूहा पूरी तरह से anesthetized है, एक लापरवाह स्थिति में एक शल्य चिकित्सा की मेज पर जगह है।
  3. पेट के लिए 70% इथेनॉल लागू करें।
  4. फुफ्फुस और पेट cavities को बेनकाब करने के रिब पिंजरे में pubis से पेट की त्वचा और पेरिटोनियम के माध्यम से एक केंद्रीय चीरा,।
  5. जब तक सभी रक्त गुर्दे से निकाल दिया जाता है एक छिड़काव प्रणाली का उपयोग गुर्दे छिड़कना उदर महाधमनी में नमकीन घोल (0.9%) इंजेक्षन। पेट के स्तर पर महाधमनी की मदद में कटौती करने के लिए रक्त जारी।
  6. गुर्दे नाभिका (गुर्दे की नस, धमनी और मूत्रवाहिनी) से काटने से चूहे से दोनों गुर्दे निकालें। गुर्दे decapsulate करने के लिए, उंगलियों का प्रयोग, ध्यान कैप्सूल 11 को अलग गुर्दे के किनारे दबाएँ।
  7. हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल में गुर्दे रखें।

3. किडनी पाचन और सेल निलंबन

  1. छोटे टुकड़ों में कैंची के साथ एक गुर्दे के आधे में कटौती और डालएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में टुकड़े।
    नोट: सभी निम्नलिखित सांद्रता 1 नमूना (1/2 चूहे की किडनी) के लिए गणना कर रहे हैं।
  2. collagenase समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। उलटा द्वारा मिश्रण हर 5 मिनट सुनिश्चित करें कि collagenase समाधान पूरे ऊतक तक पहुँचता बनाने के लिए।
  3. समाधान लीजिए और एक सवार की सहायता से एक झरनी (40 माइक्रोन) के माध्यम से इसे पारित, और धुंधला बफर के 10 मिलीलीटर में यह resuspend।
  4. 15 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. 1 मिलीलीटर एसीके (अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम) lysing बफर में गोली फिर से निलंबित। 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए धुंधला बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. 10 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. पुनः निलंबित बफर (1 मिलीलीटर) धुंधला की एक पर्याप्त मात्रा में गोली और एक झरनी (30 माइक्रोन) का उपयोग सेल निलंबन फिल्टर।
  8. एक hemocytometer पर trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना और स्टेशन के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 2 लाख कोशिकाओं को जोड़नेining।

4. सेल धुंधला और फ्लो का विश्लेषण

  1. 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  2. एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए: पुनः निलंबित चूहे सीरम के 100 μl में गोली (100 पतला 1)।
  3. 5 मिनट के लिए बफर धुंधला और सेंट्रीफ्यूज 100 XG के 1 मिलीलीटर जोड़कर धो लें।
  4. CD45 एपीसी-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (4: 100) हर हालत के लिए धुंधला बफर के 100 μl में कोशिका की सतह धुंधला के लिए एंटीबॉडी मिक्स और समाधान जीवित कोशिकाओं (: 1,000 3) का पता लगाने के लिए।
  5. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंटीबॉडी मिश्रण में सेल गोली फिर से निलंबित।
  6. 5 मिनट के लिए 100 XG पर धुंधला बफर और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर जोड़कर धो लें। इस चरण को दोहराएँ।
  7. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए निर्धारण / Permeabilization समाधान के 600 μl जोड़ें।
  8. 5 मिनट के लिए 170 XG पर 1 मिलीलीटर Permeabilization / धो बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ 2 बार धोएं।
  9. intracel के लिए: CD68 FITC एंटीबॉडी (1000 35) जोड़ेंहर हालत के लिए Permeabilization / धो बफर के 100 μl को lular धुंधला हो जाना।
  10. CD68-एंटीबॉडी समाधान में गोली पुनः निलंबित और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए सेते हैं।
  11. 5 मिनट के लिए 170 XG पर 1 मिलीलीटर Permeabilization / धो बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं।
  12. , Permeabilization / धो बफर के 100 μl में गोली पुनः निलंबित CD86PE एंटीबॉडी (35: 1000) जोड़ने के लिए और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  13. 5 मिनट के लिए 100 XG पर बफर और सेंट्रीफ्यूज Permeabilization / धो के 1 मिलीलीटर जोड़कर धो लें।
  14. Permeabilization / धो बफर के 100 μl में गोली पुनः निलंबित और यह ट्यूब एक प्रवाह cytometry के लिए गुजरती हैं।
  15. प्रवाह cytometry द्वारा नमूनों का विश्लेषण। साइड-बिखरे हुए प्रकाश / आगे-बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी / एफएससी) विंडो में गेटेड जीवित कोशिकाओं में CD45 धुंधला निर्धारित करते हैं। एक दूसरे चरण में, CD68 + कोशिकाओं में CD86 और CD163 अभिव्यक्ति का विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम गुर्दे में मैक्रोफेज घुसपैठ की वृद्धि की उपस्थिति के साथ जुड़े गुर्दे की चोट के एक भड़काऊ प्रयोगात्मक मॉडल में बृहतभक्षककोशिका विविधता का विश्लेषण किया। इस मॉडल में, गुर्दे की क्षति, Wistar चूहों में 3 सप्ताह के लिए पीने के पानी में एल्डोस्टेरोन (1 मिलीग्राम -1 किलो -1 दिन) से अधिक नमक (NaCl 1%) के प्रशासन द्वारा प्रेरित किया गया था के रूप में पहले 12 की सूचना दी।

हमारे प्रयोगों की अनुसूची 1 चित्र में दिखाया गया है। सबसे पहले, गुर्दे की कोशिकाओं अलग थे यांत्रिक तरीकों और collagenase (चित्रा 1 ए) के साथ आगे enzymatic पाचन का उपयोग कर। इसके बाद, एरिथ्रोसाइट्स lysed थे और गुर्दे मैक्रोफेज से फ्लो का उपयोग करके पाया गया। कोशिकाओं की झिल्ली का पता लगाने और CD68 intracellular धुंधला के लिए (चित्रा 1 बी) के लिए CD45, CD86 और CD163 के लिए एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे। अंत में, मैक्रोफेज पी के phenotypeopulations योजना के अनुसार विश्लेषण किया गया था चित्रा 1C में दिखाया।

गुर्दे मैक्रोफेज सामग्री CD45 और CD68 (2A चित्रा) के लिए दोहरी सकारात्मकता के साथ कोशिकाओं का चयन करके विश्लेषण किया गया था। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है, नियंत्रण समूह (0.57 ± 0.16 बनाम 0.25 ± 0.02% CD45 + / CD68 कुल गुर्दे की कोशिकाओं प्रति + मैक्रोफेज) की तुलना में CD45 + / CD68 + मैक्रोफेज एल्डोस्टेरोन का इलाज चूहों में मनाया गया में वृद्धि का उपयोग करना ( चित्रा 2, टेबल डालने देखें)। CD45 + / CD68 + मैक्रोफेज के सेल व्यवहार्यता, के रूप में बैंगनी रंग के साथ धुंधला प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित, नियमित तौर पर था 95% से अधिक (डेटा) नहीं दिखाया .Thereafter, CD86 (एम 1 मार्कर) और CD163 (M2 मार्कर) अभिव्यक्ति के बीच मूल्यांकन किया गया था CD45 + / CD68 + कोशिकाओं। Aldosterone प्रशासन CD45 + / CD68 + / CD86 + एम 1 की सामग्री में वृद्धि हुईमैक्रोफेज (2.87 ± 2.3 बनाम 1.36 ± 0.68;% CD45 + / CD68 + / CD86 + कुल CD45 + / CD68 + कोशिकाओं प्रति मैक्रोफेज) (चित्रा 2)। हालांकि, CD45 + / CD68 की कम संख्या + / CD163 + M2 मैक्रोफेज दोनों एल्डोस्टेरोन का इलाज और नियंत्रण समूहों में मनाया गया। विश्लेषण करने के लिए है कि क्या कम CD163 अभिव्यक्ति प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटिओलिटिक बहा से संबंधित था, हम collagenase पाचन, चूहे पेरिटोनियम से अलग मैक्रोफेज में शामिल इस प्रक्रिया को दोहराया है, के रूप में पहले 13 में वर्णित है। जैसा कि चित्र 2 बी में सूचना दी, CD45 + / CD68 + पेरिटोनियल मैक्रोफेज दोनों CD86 और CD163 के लिए सकारात्मक थे, चयनित एंटीबॉडी की उपयोगिता मान्य और चूहे की किडनी में एम 1 / M2 मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन के लिए हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि।

इन परिणामों को मान्य करने के लिए,भड़काऊ ऊपर प्रयोगात्मक मॉडल में गुर्दे की क्षति के साथ जुड़े प्रतिक्रिया immunohistochemistry और वास्तविक समय पीसीआर द्वारा अध्ययन किया गया था। जैसा कि चित्र 3 में सूचना दी, वृद्धि पर नियंत्रण की तुलना में CD68 + मैक्रोफेज, एल्डोस्टेरोन + नमक इलाज चूहों में मनाया गया। फिर, बृहतभक्षककोशिका phenotype मार्कर गुर्दे एम 1 / M2 बृहतभक्षककोशिका वितरण को चिह्नित करने के लिए निर्धारित किया गया है। INOS की वृद्धि की mRNA अभिव्यक्ति और IFN-γ (एम 1 मार्कर) एल्डोस्टेरोन + नमक उपचार के बाद मनाया गया, जबकि ARG1 या आईएल -10 mRNA अभिव्यक्ति (M2 बृहतभक्षककोशिका मार्कर) एल्डोस्टेरोन प्रशासन के बाद भी नहीं बदला। साथ में, इन परिणामों की पुष्टि है कि एल्डोस्टेरोन + नमक प्रशासन विवो में भड़काऊ एम 1 बृहतभक्षककोशिका phenotype मध्यस्थता करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: गुर्दे की कोशिकाओं अलगाव और Macrophage जांच से फ्लो द्वारा लिए प्रोटोकॉल। (ए) और प्रवाह cytometry (बी) द्वारा बृहतभक्षककोशिका का पता लगाने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। CD45, CD68, CD86 और CD163 मार्कर (सी) के लिए अलग वितरण के अनुसार अलग अलग बृहतभक्षककोशिका phenotypes के प्रतिनिधि योजना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एम 1 और गुर्दे में M2 बृहतभक्षककोशिका मार्करों Aldosterone से, पक्ष बिखरे हुए प्रकाश / आगे-बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी / एफएससी) खिड़की (ए में गेटेड जीवित कोशिकाओं में से फ्लो द्वारा इलाज चूहों CD45 धुंधला के प्रतिनिधि डॉट भूखंडों छोड़ दिया है। ) नियंत्रण और एल्डोस्टेरोन + नमक का इलाज पशुओं में गुर्दे निलंबन से। बॉक्स डॉट भूखंडों के अंदर जीवित कोशिकाओं को पहचानतीCD45 व्यक्त। इस बॉक्स में शामिल कोशिकाओं (एक सही) CD68 + कोशिकाओं में CD86 और CD163 अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए विश्लेषण किया गया। CD45, CD68, CD86 और CD163 का पता लगाने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पेरिटोनियल मैक्रोफेज, पहले से इस्तेमाल एक ही रणनीति को लागू करने के लिए डॉट साजिश है। डेटा SEM (बी) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Aldosterone + नमक प्रशासन के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया। (ए) CD68 धुंधला और के प्रतिनिधि छवियों (बी) के नियंत्रण और एल्डोस्टेरोन + नमक का इलाज चूहों में एम 1 मार्करों के लिए आरटी पीसीआर (INOS और INFγ) और M2 मार्कर (ARG1 और आईएल -10) द्वारा मापा mRNA स्तर की मात्रात्मक विश्लेषण। डेटा एक्सप्रेस रहे हैंप्रवर्तन निदेशालय के रूप मतलब ± SEM। * पी <0.05 बनाम नियंत्रण। स्केल पट्टी:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

मैक्रोफेज विषम कोशिकाओं है कि गुर्दे संबंधी विकार सहित विभिन्न भड़काऊ रोगों, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं। इसमें गुर्दे की बीमारी में मैक्रोफेज सबसेट के लक्षण वर्णन में बढ़ती रुचि है क्योंकि प्रत्येक बृहतभक्षककोशिका उप-जनसंख्या गुर्दे चोट के विकास के लिए एक अलग तरीके से योगदान देता है, के रूप में स्तवकवृक्कशोथ, मधुमेह अपवृक्कता और गुर्दे के कैंसर 14-16 में सूचना दी है। तीव्र गुर्दे की चोट के प्रारंभिक दौर में, एम 1 मैक्रोफेज की एक विशेषता मनाया जाता है, ट्यूबलर गल जाना और सूजन को बढ़ावा देने। हालांकि, बाद के चरणों में M2 मैक्रोफेज के एक उच्च सामग्री सूजन को हल करने और ऊतक remodeling में भाग लेने के लिए मनाया जाता है। क्रोनिक किडनी रोग में, दोनों एम 1 और M2 मैक्रोफेज एक साथ सह-अस्तित्व में है, हालांकि एम 1, प्रमुख हो सकता है इस तरह बढ़ रही है और भड़काऊ गुर्दे की क्षति को बनाए रखने। इसलिए, गुर्दे की बीमारी में बृहतभक्षककोशिका उपप्रकार के pathophysiological भूमिका के हमारे ज्ञान को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। इम्युनोहिस्टोकैमिकल अध्ययन एक मजबूत तरीके से 17 में बृहतभक्षककोशिका सबसेट का प्रतिशत निर्धारित नहीं कर सकता। इसलिए, यह नई तकनीक विकसित करने के लिए मात्रात्मक अलग बृहतभक्षककोशिका phenotypes निर्धारित करने के लिए और गुर्दे की सूजन प्रतिक्रिया पर इन कोशिकाओं की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक है।

यह पांडुलिपि चूहों में से फ्लो से संख्या और गुर्दे मैक्रोफेज सबसेट के phenotype निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। हमारे अध्ययन में, चूहों एल्डोस्टेरोन के प्रशासन द्वारा गुर्दे की क्षति के एक भड़काऊ मॉडल के अधीन थे। इस मॉडल में, हम के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित और immunohistochemistry द्वारा की पुष्टि की वृद्धि हुई मनाया CD45 + और C68 + बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ। इसके अलावा, एम 1 मैक्रोफेज (CD68 + / CD86 +), लेकिन नहीं M2 मैक्रोफेज की एक संवर्धन, एल्डोस्टेरोन इलाज चूहों में मनाया गया। इन परिणामों के आगे एम 1 (INOS और IFN-γ) की mRNA अभिव्यक्ति और M2 macroph निर्धारण से पुष्टि की गईउम्र मार्कर (ARG1 या आईएल -10)। अलगाव प्रोटोकॉल के विश्लेषण के दौरान सूचना कम सेल मृत्यु दर प्रवाह cytometry। वहाँ कई कारकों है कि सेल व्यवहार्यता और सतह मार्कर का पता लगाने प्रभावित कर सकता है, इस तरह के ऊतक हदबंदी के स्तर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से की अवधि और ऊतक पाचन (एंजाइमी, मैकेनिक, आदि) के प्रकार हैं। अत्यधिक पाचन सेल मृत्यु दर और बृहतभक्षककोशिका सक्रियण बढ़ जाती है और सतह मार्कर अभिव्यक्ति कम हो जाती है, जबकि विपरीत प्रभाव कम गुर्दे की हदबंदी से हो सकता है। हालांकि, जब हमारे प्रोटोकॉल चूहा पेरिटोनियम से अलग मैक्रोफेज में आयोजित किया गया, CD86 और CD163 के एक बढ़ाया उपस्थिति इन कोशिकाओं में मनाया गया।

हमारी प्रोटोकॉल एल्डोस्टेरोन की मध्यस्थता उच्च रक्तचाप के साथ चूहों से गुर्दे में बृहतभक्षककोशिका विविधता निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया है, और इसलिए, अन्य भड़काऊ गुर्दे की बीमारी मॉडल के लिए extrapolated किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि सूजन संशोधितऊतक अखंडता, इस प्रकार कोलैजिनेज़ द्वारा ऊतक पाचन की दर को प्रभावित।

यह ध्यान रखें कि कुल बृहतभक्षककोशिका सामग्री का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है, कोशिकाओं तय की और CD68 एंटीबॉडी 18 के साथ intracellular लेबलिंग अनुमति देने के लिए permeabilized थे। निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल है कि fluorochromes प्राथमिक एंटीबॉडी, विशेष रूप से phycoerythrin संयुग्मित प्रभावित कर सकते हैं formaldehyde के उपयोग शामिल थे। इस समस्या को हल करने के लिए, CD86 पीई एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के निर्धारण / Permeabilization समाधान और आगे CD68 धुंधला के अलावा के बाद किया गया था। दूसरी ओर, यह है कि formaldehyde भी इस तरह के mRNA अभिव्यक्ति assays के रूप में अन्य assays कि मैक्रोफेज अलगाव के बाद किया जा सकता है, के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, वहाँ वाणिज्यिक formaldehyde तय कोशिकाओं से mRNA को अलग-थलग करने के लिए उपलब्ध किट हैं।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल एक quantitati में गुर्दे मैक्रोफेज के प्ररूपी लक्षण वर्णन के लिए एक विधि का वर्णनve तरीके का उपयोग कर प्रवाह cytometry। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल चूहा गुर्दे से अलग बृहतभक्षककोशिका आबादी भेदभाव करने का उपयोग करने के लिए आसान है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और उपयोगी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood Faster Or equivalent equipment
Centrifuge Hettich Or equivalent equipment
Flow cytometer (FACSAria) BD Biosciences
Fetal bovine serum BioWest S1820-500
PBS 10x LONZA BE17-515Q
Collagenase Sigma-Aldrich 12/1/9001
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A10492-01
Flow cytometry strainers BD Biosciences 340626
Falcon cell strainers Thermo Fisher Scientific 352340
Flow cytometry tubes Falcon 352052 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
Centrifuge tubes Corning centristar 430791
Water bath Memmert GmbH + Co. KG WNE 7 37 °C
Fixation/Permeabilization Solution or Permeabilization/Wash Buffer BD Biosciences 554714
Rompum (Xylazine) Bayer Or equivalent
Ketalar (Ketamine) Pfizer Or equivalent
Hanks’ balanced salt solution Sigma-Aldrich H8264-500ML
Saline solution Braun 622415
Anti-CD45 (clone:OX-1) APC-Cy7 Biolegend 202216 Diluted 1:100
Anti-CD68 (clone: ED1) FITC Bio-RAD MCA341F Diluted 35:1,000
anti-CD86 (clone: 24F) PE Biolegend 200307 Diluted 35:1,000
anti-CD163 (clone: ED2) Alexa Fluor 647 Bio-RAD MCA342R Diluted 4:100
Live/dead stain  Molecular Probes L34955 Diluted 3:1,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946 (2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics