לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodriguez-Tirado, C., Kitamura, T., Kato, Y., Pollard, J. W., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J. Vis. Exp. (116), e54603, doi:10.3791/54603 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גרורה לאתרים משניים כגון ריאות, כבד ועצמות הוא אירוע טראומטי עם שיעור תמותה של כ 90% 1. האתרים הללו, הריאה הוא קשה ביותר על מנת להעריך באמצעות דימות אופטי intravital בשל העמדה הסגורה שלו בתוך הגוף, הטבע עדין התפקיד חיוני בשמירת פיזיולוגיה נכונה. בעוד שיטות קליניות (טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה ממוחשבת (CT)) מסוגלות לספק תמונות לא פולשנית של רקמה זו, אין להם את הרזולוציה צורכת לדמיין את אירועי זריעה המוקדמים, עם פיקסל בודד המורכב מכמה אלפי תאים כמעט. דגמים נוכחיים של קביעת זריעת ריאות גרורתי שאירועים רק לאחר הגעתו של תאים סרטניים הם דטרמיניסטיים להישרדות והצמיחה הבאה. משמעות הדבר היא כי כלי הדמיה intravital בזמן אמת עם רזולוציה תא בודד 2 נדרשים על מנת להגדיר את פנוטיפים של cel זריעהls ולבדוק מודלים אלה. בעוד הדמיה אופטית גבוהה ברזולוציה של הריאה שבוצעה באמצעות הכנות vivo לשעבר שונות, ניסויים אלה הם בדרך כלל מבחני פעם אחת נקודות והם רגישים חפצי מסקנות אפשריות שגויות בשל הסביבה שינתה באופן דראמטי (טמפרטורה, שפע, ציטוקינים וכו ' וכתוצאה מכך) מהסרת מחלל החזה ומערכת הדם 3. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הדמיה אופטית intravital זמן לשגות של הריאה השלמה אפשרי באמצעות ואקום התייצב 2,4,5 חלון הדמיה עם זאת, פעמי הדמיה טיפוסיות היו מוגבלות כ -6 שעות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לביצוע הדמיה זמן לשגות intravital לטווח ארוך של הריאה ניצול חלון כזה על פני תקופה של 12 שעות. רצפי הזמן לשגות התמונה שהושגו באמצעות שיטה זו לאפשר להדמיה לכמת תאי תאי אינטראקציות, דינמיקת הממברנה זלוף וסקולרית הבריאה. בנוסף, אנו דescribe טכניקת עיבוד תמונה שנותנת תצוגה ברורה וחסר תקדים על נימי הדם זעירות ריאות.

Introduction

הדמיה ברזולוציה גבוהה אופטית intravital הוכיחה להיות חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים רבים, ומאפשרים פרמטרי תא בודד ואת המשנה הסלולר להימדד לכמת. בחקר הסרטן, הדמיה intravital של תאים סרטניים ואת סטרומה הובילה לגילוי של אינטראקציות microenvironmental רבים 6-11 שנמצאים רק החיה בשלמותה.

תגליות על microenvironments הקשורים intravasation והפצת תאים סרטניים בסרטן השד באמצעות דימות אופטי ברזולוציה תא בודד in vivo אף הביאה סמנים חדשניים הפרוגנוזה ועל התגובה לטיפול בחולי סרטן השד 12-16. טכנולוגיות ההדמיה הטובות ביותר הזמינות לצפייה עמוקה בתוך האיברים חיוניים הפנימיים שלמים הן השיטות הקליניות (MRI, PET, CT) אשר מציעות נופים מצוינים של האיבר כולו והוא יכול לחשוף פתולוגיות עוד לפני שהם מייצרים סימפטומים קליניים. הם אינם מסוגלים, however, כדי לחשוף את השלבים המוקדמים של גרורות ואת המנגנונים התאיים נהיגת התקדמות גידול בשל חוסר ברזולוצית תא בודד. עד גרורות סרטני בריאות גלויות באופנים אלה, הם מבוססים היטב התרבה. נוכח ההערכה כי 90% של תאים סרטניים שהפיץ מגיעים אל הריאות או אינם שורדים 17 או בתחילה להישאר רדומים 18, ואת התצפית כי הם מגיעים הרבה יותר מוקדם מהצפוי בעבר 19, הדמיה השלבים המוקדמים ההגעה והישרדות הופך קריטי הבנת התהליך של זריעה והישנות גרורתי של גידול באתרים מרוחקים.

ביצוע תצפיות אלה הריאה הוכיח קשה מאוד עם זאת; הרוב המכריע של מחקרי הדמיה נצל הכנות vivo לשעבר או explant 20-23, אשר רק לתת תצוגה לתוך הריאות בנקודות פעם אחת. בעוד הכנות אלה מספקות מידע שימושיrmation, הם לא נותנים הבנה מלאה של אינטראקציות, יחסי סיבה ותוצאה, ודינמיקה המתרחשות בין הרכיבים השונים של microenvironment. עדר מערכת דם תקין (וחוסר איזון קשור של הומאוסטזיס) ואת הניתוק משאר המערכת החיסונית של הגוף עושה את זה שוקק כדי לאמת את המסקנות כי ההכנות האלה ליצור ברקמת שלמי in vivo.

קבוצות רבות בצעו הדמית intravital של הריאה השלמה 2,4,5,24-33 עם Wearn וגרמנית להיות הראשון כמנתח לחשוף את שכבת פלאורלי 24 וטרי הראשון שניצלו את חלון הדמיה מושתל 25.

הדמיה ברזולוציה גבוהה הריאה מתעכבת מאוד על ידי התנועה המתמדת וטכניקות מספר של הריאות פותחו כדי להתגבר על מגבלה זו. ואגנר Filley 27 למד את התנועה הטבעית של הריאה כלביםועוצב הפרוטוקול כירורגית שלהם לאתר החלון המושתל שלהם מעל אזור יחסית נייח בעוד וגנר מנוצל ואקום כהכנה כירורגית חלונו כדי לשתק את הרקמות 28. מאז אותה תקופה, מגוון של טכניקות כבר נוצל לתדמית הריאה כולל: הידוק הסמפונות, דום נשימה רציפה הדמיה מגודרת, רכישת oversampled, הדבקה של אונת ריאת ואקום 34. לכל אלה היתרונות והחסרונות שלה ולא טכניקה אחת התפתחה כנעלה על 34 אחר. לדוגמא, clamping הסמפונות דום נשימה רציפה לשנות את חילופי דברים הרגילים של גזי הריאה ועלולים לגרום תמט ריאות. הדמיה מגודרת ורכישת oversampled אינן סובלות חסרון אלה אך דורשים במהירות גבוהה או ציוד הדמיה מיוחד לא נגיש לציבור רחב. לבסוף הוא דבק של הריאה ואת הטכניקה ואקום להימנע הם החסרונות שהוזכרו לעיל, אך עשויים להפגין פגיעה הנגרם כוח גזירה אם טיפול אינו taken. בשנים האחרונות, חלון הוואקום כבר מיניאטורי ומותאם לשימוש בעכברים באמצעות מיקרוסקופיה confocal multiphoton 4,5,33 ו הדמיה ברזולוציה גבוהה מעולה שהושג 2. טבלת 1 מסכמת היסטוריה עשירה זה ומדגיש את הניירות האלה המתארים רומן התקדמות בשימוש חלונות הדמיה ריאות intravital.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ intravital multiphoton המורחב זמן לשגות כדי גרורות תמונת הריאה החייה, השלמה עם החלטת subcellular הגבוהה ביותר האפשרית. תמונות נרכשות עבור עד 12 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מצויד בעדשת מטרת צמצם המספרי גבוהה צינור מכפיל מרובה (PMT) גלאי. מודלים עכבר מהונדס מנוצלים מקרופאגים יליד תווית fluorescently יחד עם dextran משקל מולקולרי גבוה פלורסנט תאים סרטניים טרנספקציה פלורסנט חלבון (לתייג התאים בכלי הדם ואת הגידול respectively). בעוד שבחירה זו של תאים שכותרתו fluorescently מאפשרת הדמיה של אינטראקציות מקרופאג תא האנדותל תאים סרטניים ודינמיקה, פרוטוקול זה יעבוד עבור כל זן של העכבר פלורסנט או ללא ניאון. לאחר רכישה, תנועה להיסחף שיורית (אם בכלל) מסולקת באמצעות פיג'י תוסף 35,36 וממוצע זמן פקוד מאקרו מותאמת אישית בערוץ וסקולרית לחסל הבהוב הנגרם על ידי תאי דם במחזור ללא תווית.

בעוד פרוטוקול זה מתמקד גרורות הדמיה, הטכניקות החלות על תהליכים ביולוגיים רבים אחרים הנצפה עם הדמית תא בודד ברזולוציה גבוהה הריאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים מתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי ע"ש אלברט איינשטיין טיפול בבעלי חיים מוסדיים לרפואת ועדת שימוש.

1. במודל עכבר היצירה שכותרתו fluorescently תאים סרטניים

  1. הכן 100 מ"ל של 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור / בופר פוספט (BSA / PBS) חיץ על ידי ערבוב 0.1 גרם של BSA עם 100 מ"ל של PBS.
  2. כן תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ידי transfection היציב.
    הערה: כאן אנו משתמשים בתאי E0771-LG, נגזרים גרורתי מאוד של תאי אדנוקרצינומה חלב E0771 עכבר 37 כי בודדו גרורות שפותח הריאה של עכבר C57BL / 6 מוזרק לוריד עם תאי E0771 הורים 38.
    1. 24 שעות לפני transfection, צלחת 1 x 10 5 תאים EO771-LG על צלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ על 2 מ"ל של antibioFBS חינם 10% טיק (בסרום שור עוברי) DMEM (בינוני הנשר השונה של Dulbecco) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. בזמן transfection, דגירה 2 מיקרוגרם של וקטור חלבון פלואורסצנטי עם 10 μl של מגיב transfection למשך 30 דקות לפני הוספת 190 μl של התקשורת סרום מופחת.
    3. EO771-LG לשטוף תאים עם בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) פעם ומוסיפים את תערובת transfection בעדינות.
    4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 6 שעות.
    5. שוטפים את התאים והתרבות transfected ב 2 מ"ל של DMEM מלאה (10% FBS, פירובט 1 מ"מ, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין) עבור 2 ימים.
    6. שטפו תאים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי, להוסיף 500 μl של 0.25% טריפסין- EDTA דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    7. אסוף השעית תא ומערבב עם 1 נפח לפחות של DMEM המלא ומסובב ב 280 x ז.
    8. Resuspend התאים 1 מ"ל של DMEM מלאה ולהרחיב את תרבית תאים לתוךצלחת בתרבית רקמה 10 ס"מ.
    9. התחל בחירה של תאים transfected על ידי הוספת 700 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטיביוטיקה סלקטיבית G418 8 מ"ל של DMEM מלאה והתרבות במשך שבוע, שינוי בינוני כל שלושה ימים.
  3. להעשיר את האוכלוסייה פלורסנט מתאי transfected שהיו תחת סלקציה G418 ידי מיון התא המופעל פלואורסצנטי (FACS) 39,40.
    1. שטפו תאים עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין.
    2. דגירה של 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ומערבב עם של DMEM המלא אחת נפח לפחות.
    3. אסוף ההשעיה תא ספין למטה ב 280 XG מחדש להשעות התאים 1 מ"ל של 0.1% סטרילי (w / v) חיץ BSA / PBS.
    4. סנן את ההשעיה התא דרך רשת 40 מיקרומטר ולהתאים את עוצמת הקול עד 1 מ"ל עם 0.1% BSA / PBS חיץ למיון.
    5. FACS-למיין את האוכלוסייה המבריקה 10% בהתבסס על ספקטרום קרינה באמצעות סדרן FACS 41.
    6. תרבות התאים מסודרים לעוד שבוע uמבחר nder (700 מיקרוגרם / מיליליטר G418 ב DMEM המלא).
    7. לבחור מחדש fluorescently תאים שכותרתו ידי זרימת cytometry ידי חזרה על שלבים 1.3.1 עד 1.3.6 שוב.
    8. לאחר סיבוב שני של בחירה, trypsinize, לסנן מחדש להשעות תאי BSA 0.1% / PBS כמתואר (צעדים 1.3.1-1.3.4). ולהתאים הריכוז 2 x 10 6 תאים / מ"ל עבור תא בודד מיון לתוך 96 צלחות היטב באמצעות סדרן FACS.
    9. כן 3-5 96 צלחות גם עם 100 μl של DMEM המלא לאיסוף. כדי לשפר את ההישרדות לאחר המיון, להוסיף 100 μl של מדיום תרבות המסונן מן המנות שבו תאי EO771-LG גדלו 42.
    10. לאחר מיון התאים לתוך 96-גם הצלחות, לחזור תאים לתרבות עבור 2 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    11. זיהוי בארות עם שיבוטים אחד קיימא על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 5x.
    12. Trypsinize ולהרחיב שיבוטים קיימא ולהקפיא תאים עבור גיבוי.
      1. לשטוף בארות עם GRבשל שיבוטים עם 100 μl של PBS סטרילית. הוסף 50 μl של 0.25% w / v טריפסין דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 50 μl של שלמה DMEM ולהעביר V-תחתונה או עגולה סטרילי צלחת 96-היטב מלמטה ספין למטה ב 280 XG במשך 5 דקות.
      2. תאי Resuspend ב 100 μl של 700 מיקרוגרם / מיליליטר G418 DMEM מלא צלחת כל שיבוט ב 12 גם צלחות. להוסיף 400 μl של DMEM להשלים עם G418 והתרבות עד ומחוברות.
      3. לשטוף בארות עם 500 μl של PBS, להוסיף 100 μl של טריפסין 0.25% ו דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוספת 100 μl של DMEM המלא ומסובבים במשך 5 דקות ב g 280 x. Resuspend התאים 100 ul של DMEM להשלים עם תאי G418 צלחת ב 6 צלחות היטב עד ומחוברות.
      4. לאחר ומחוברות, תאים trypsinize, ספין למטה גלולה ב 10% DMSO ב FBS להקפיא מניות התא.
      5. שמור 1/10 של המתלים תא בתרבות ידי ציפוי אותם במנות בתרבית רקמה 100 מ"מ להערכת פוטנציאל גרורתי שלהם.
  4. בחן את הפוטנציאל גרורתי של שיבוטים שנבחרו.
    1. Trypsinize מחדש להשעות התאים מלוחים לריכוז של 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל ו להזריק 200 μl לתוך C57BL / 6 עכברים לווריד דרך וריד הזנב.
    2. לאחר 2 שבועות, לאסוף רקמת ריאה כפי שתואר לעיל 23 ולכמת ניטל גידול לפי ספירת משטח או שיטת stereological 43. בחר שיבוטים עם פוטנציאל גרורתי גבוהה הדמיה intravital.
  5. תרי MacBlue (אמרגן ספציפי מיאלואידית נהיגת חלבון פלואורסצנטי ציאן (ביטוי CFP) (Csf1r -GAL4VP16 / כטב"מ-ECFP 16)) עכברי כתב 44.
    הערה: בדרך כלל, עכברים בין 8 ל 12 שבועות משמשים, אבל עכברים מוקדם ככל 7 ו מאוחר ככל 20 שבועות נבדקו כדי לעבוד גם כן.

2. multiphoton מיקרוסקופ להגדיר הכנה הדמיה

הערה: בעוד פרוטוקול זה יכול להתבצע על כל מטרמיקרוסקופ ultiphoton, המערכת בשימוש לרכוש את הנתונים המוצגים בפרוטוקול זה תואר בעבר בפירוט 45.

  1. הפעל את כל מרכיבי מיקרוסקופ ליזר כולל לייזרי שני פוטונים ואת הגלאי לפחות אחד קדימה שעה מן מועד ההדמיה הרצויה.
  2. רגע לפני הניתוח, למדוד את כוחו של קלט אור המיקרוסקופ על ידי הנחת הראש של מד הכוח האופטי בנתיב קרן ממש לפני מיקרוסקופ ולהתאים את ידיות במראה חלל סוף לייזר עד עוצמת האור המקסימלית ב -880 ננומטר הוא לקרוא על מד הכח האופטי.

3. מערכת אבק גדר

  1. מדביקים את coverslip לתוך חלון הדמיה (משלימה איור 1) עם cyanoacrylate. אפשר לפחות שעה 4 עבור דבק יבש לחלוטין.
    הערה: זה צעד יכול להיעשות גם לפני הזמן.
  2. חותך את קצה פיפטה 100 μl על השורה הראשונה של הפתח הקטן וחברתי את הקצה נימול אל v הדקצינור acuum.
  3. חבר את מערכת הוואקום פי איור 1 ו משלימים איור 2.
  4. עם ואקום על ואת הקצה הפתוח חסום, להתאים את הרגולטור ואקום <3 inHg.
    הערה: התאמה סופית של רמת הוואקום תבוצע על ידי תצפית של כלי הדם בגוף החי.
  5. למרוח שכבה דקה של גריז נפט לחלק התחתון של הצלחת ההדמיה כדי למנוע את מדיום טבילת עדשה האובייקטיבי מלהיות רשע משם על ידי צלחת ההדמיה.
  6. מניחים את הצלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ.
    הערה: צלחת ההדמיה המותאמת אישית (משלימת איור 3) היא גיליון 1/8 "אלומיניום עבה במכונה הוא להשתלב במרחב כנס במה עם-חור במרכז להחזקת חלון ההדמיה.
  7. הכנס את חלון ואקום לתוך צלחת הדמיה עם coverslip למטה.
  8. לעקר את כל המשטחים ומכשירים כולל צלחת הבמה הדמיה, ולנצח הדמיהדאו עם 70% אתנול.
  9. חבר את הקצה החתוך של קצה פיפטה אל החלון ואקום ואת קלטתי את הצינור עד צלחת ההדמיה.
  10. תביא את הקרוב האובייקטיבי לחלון הדמית מקום טיפה גדולה של מים בין המטרה לבין coverslip.
  11. ודא שאין נזילות מן coverslip ידי חסימת הפתיחה המרכזית של חלון הוואקום והאימות כי טיפת המים בין המטרה לבין coverslip לא מקבלת aspirated.
    הערה: כדור עכבר מחשב בסגנון ישן ממוקם מעל החלון שימושי חוסם את הפתח המרכזי.

4. ניתוח

  1. מכינים את אזור הניתוח סטרילי.
    1. שמים את כל המכשירים בהישג יד. לעקר את כל המשטחים ומכשירים כולל אזור הניתוח, וכלים כירורגית עם 70% אתנול.
  2. עניבה אורך 3 אינץ 'של 2-0 תפר את הקטטר, אינץ ¼ מעל התותב בקשר כפול.
  3. כן fol קטטר וריד זנבגעיית הפרוטוקול בהוצאה ואח Harney. 46.
  4. באמצעות מנורת חום אינפרא אדום (IR), לחמם את החיה בכלוב שלה עבור ~ 5 דקות כדי להגביר את זרימת הדם בווריד הזנב כדי לסייע בהכנסת קטטר. מומלץ לשמור על בעלי החיים חממו לטמפרטורות פיסיולוגיות לאורך ההליך הכירורגי או באמצעות מנורת חום או כרית חימום.
  5. להרדים את החיה עם isoflurane 5% ולוודא כי אין בתגובה קמצוץ הבוהן.
  6. החל משחת עיניים לעיניים של החיה.
  7. השתמשו בקרם ידיים מקריח במשך 10-30 שניות כדי להסיר שיער מהאגף השמאלי של החיה; מן קו האמצע של החזה כדי ¼ של הלוך מבית השחי עד מתחת החזה.
  8. נקה כל קרם עודף לעקר עור חשוף עם 70% אלכוהול.
  9. צרף מזרק סטרילי מלא PBS אל קטטר וריד הזנב וכנס קלטת במקום בעקבות הפרוטוקול בהוצאת Harney et al. 46. ודא הקלטת היא דבקה באופן מאובטח אל המחט עצמה אינה חופשית בפער בין הזנב ואת קלטת.
  10. לצנרר העכבר הבא או הפרוטוקול בהוצאת Das et al. 47 או על ידי DuPage et al. 48
  11. הפעילו את מכונת ההנשמה ולהגדיר אותו לספק 135 נשימות לדקה ו -200 μl של תערובת isoflurane חמצן.
  12. חבר את הקטטר קנה הנשימה אל הנשמה.
  13. הזז את העכבר אל אזור הניתוח. קח בזהירות רבה שלא לעקור את הקטטר.
  14. לקשור את תפר 2-0 סביב החוטם של העכבר תחת השיניים הקדמיות.
  15. קלטתי את הקטטר אל החוטם.
  16. קלטת את forelimb שמאל כדי הקטטר כדי לשמור אותו מחוץ את שדה הניתוח.
  17. מנמיך את הרדמת isoflurane לרמת תחזוקה של 2.5% ולאמת אין בתגובת קמצוץ בוהן.
  18. בעזרת מספריים חדים, להסיר 1 ס"מ 2 של העור מעל בית החזה השמאלי.
  19. רם tהוא חלב כרית שומן ולליבון כל כלי דם חשופים עם עט הכווייה.
  20. לכרות את כרית השומן על ידי חיתוך עם המספריים החדים.
  21. הסר את שכבת השריר למטה אל כלוב הצלעות על ידי חיתוך עם המספריים החדים. יש להיזהר שלא לחתוך את ריצת הווריד השחי בבסיס של forelimb.
  22. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהרים את הצלעות 6 ה. בעזרת המספריים החדים שנערכו בזווית רדודה (~ 5 °) לחתוך את הצלעות ליד קצה הפתח בעור. קח בזהירות רבה שלא לגעת רקמת הריאה החשופה.
  23. להרחיב את הפתח בקיר החזה לחשוף את אונת הריאה כולו על ידי הסרת ארבע צלעות רצופות.
    הערה: שמור את הפתיחה במרחק של לפחות 5 מ"מ מעצם החזה כדי למנוע את הלב.
  24. רם בזהירות את העכבר תוך כדי אחיזת הקטטר הזנב קנה נשימה להזיז את העכבר על במת הדמית מיקרוסקופ.
  25. עם מעל ואקום, למלא את התא של חלון ואקום עם PBS.
  26. הפוך את העכבר ולמקם את חשופהריאות על חלון הדמית ואקום.
  27. לאט להפעיל את הוואקום בכ 3-5 אינץ 'כספית באמצעות שסתום הכדור.
  28. מניחים רתמו עשוי מנייר הדק מקופל לשתיים פעמים על החזה של עכבר הקלטת לצלחת הבמה כפי שמוצג משלים איור 2.
  29. קליפ חיישן הירך של oximeter הדופק אל החלק העליון של הירך של החיה ולהתחיל את התוכנה.
  30. מניח את החדר הסביבתי על הבמה ולהדליק את החום כדי לשמור על העכבר בטמפרטורה פיזיולוגית.
  31. להפחית את רמת isoflurane 1-1.5% כדי לשמור על הרדמה ולתחזק את זרימת הדם.

5. הדמיה Intravital

  1. תביא את הצמצם מספרי 25 x 0.95 (NA) העדשה האובייקטיבית הקרוב coverslip ולהוסיף טיפה גדולה של מים ביניהם.
  2. שימוש במצב epifluorescence, להציג את ערוץ FITC ולהביא את רקמת הריאה אל המוקד.
  3. אם לא נעשה לפני הניתוח, אניתאים סרטניים nject באמצעות קטטר וריד הזנב.
    1. נתק את המזרק PBS מן קטטר זנב וריד.
    2. טען מזרק סטרילי עם 100 μl של השעיה תאים סרטניים (2 x 10 7 תאים / מ"ל ב המרבי PBS).
      הערה: שלב זה יכול להיעשות מראש ללמוד הגעת תאים סרטניים אל הריאות בנקודות זמן שונות.
    3. חברו את המזרק עם תאים סרטניים על קטטר וריד הזנב.
    4. לאט לאט להזריק את התאים הסרטניים לוריד הזנב.
    5. נתק את המזרק עם תאים סרטניים מן קטטר וריד הזנב.
    6. חבר מחדש את המזרק PBS על קטטר זנב וריד.
      הערה: זהה את המיקומים של כל תאי הגידול לפני הזרקת dextran כפי שהוא הופך להיות קשה להבחין בין התאים הסרטניים מן האות dextran דרך העינית לאחר הזרקה.
  4. אתר תאים סרטניים לתמונה
    1. הדמית תאים סרטניים בודדים, לאתר את כל תאי הגידול ולהקליט במיקום עם הלוח דואר מרובה של התוכנה.
      1. אתר בכל תחומי נוף לתדמית ידי התבוננות התאים הסרטניים ב עינית המיקרוסקופ.
      2. בתוך התוכנה, לעבור ללוח המרובה על ידי לחיצה על כפתור Multi-Point ולאחסן את המיקום של התא על ידי לחיצה על כפתור מצב הוספה.
    2. עבור הדמית פסיפס, לאתר את מקורו של הפסיפס ולהגדיר את קואורדינטות ההדמיה
      1. אתר עמדה בפינה השמאלית העליונה של המבנה כדי ליפול בפח.
      2. אפס את x, קואורדינטות y ו- z של הבמה על ידי לחיצה על הכפתור "אפס" על הבקר הבמה.
      3. לטעון את הרשימה המתאימה של קואורדינטות פסיפס ידי לחיצה על כפתור "טען" ובחירה ברשימה.
        הערה: כרטיס רשימה לדוגמא עבור פסיפס 2 x 2 עם חפיפה של 20% של שדה 500 מיקרומטר מבט תהיה: Pos.1 = (0,0), ממוצע. 2 = (400,0), ממוצע. 3 = (0400), ממוצע. 4 = (400.400).
  5. הסר את המזרק wה- i PBS הקטטר וריד הזנב ולהחליף עם מזרק המכיל את dextran.
  6. לאט לאט להזריק עד 100 μl של 20 מ"ג / מ"ל ​​155 kDa rhodamine-dextran מומס PBS לתוך העכבר באמצעות קטטר זנב וריד ואחריו הזרקת 50 μl של PBS סטרילי כדי לשטוף את הצינורית. אין להכניס כל בועות לתוך הקו. בעת הצורך, להזריק dextran לפחות שעה אחת לאחר ההזרקה תאים סרטניים, כך הנפח הכולל מנוהל על העכבר אינו עולה על 4 מ"ל / ק"ג / שעה.
  7. הגדרת פרמטרי הדמיה.
    1. Switch המיקרוסקופ למצב multiphoton.
    2. הגדר את הזום גורם של 2X על ידי לחיצה על כפתור אותות תזמון ועדכון בתחום פקטור זום.
    3. התאם את כוח הליזר כדי ~ 10% (~ 10-15 mW ב המדגם) על ידי לחיצה על כפתור גלאי ליזר ולאחר מכן התאמת מחוון כוח צונאמי ל -10.
  8. תמונה כל מיקום כדי לאמת את הנוכחות של תאים סרטניים ולדמיין את הזרימה ואת היושרה של vasculature.
    הערה: כלי צריך להיראות במצב perfused מלא עם אריתרוציטים זורמים dextran ניאון צריך להיות בתוך הכלי ללא דליפה אל מרחבי extravascular. כ 10 - 20 תאים סרטניים צפויים להיות בתוך הצמצם הברור של חלון הוואקום.
  9. לכוונן את עומק ההתחלה של כל מיקום להיות צלם.
    1. עבור כל מיקום, להתאים את מיקום z ידי סיבוב ידית התמקדות בקר הבמה לתמונה את החלק העליון של התאים הסרטניים.
    2. מקם את התא במרכז שדה הראייה.
    3. לחץ על כפתור Multipoint, לחץ על המיקום של שדה הראייה כדי לסמן אותו ולאחר מכן לחץ על הוסף ולאחר מכן על הלחצן Delete כדי להחליף את המיקום המאוחסן של התא ברשימה המרובה.
    4. מבחינה ויזואלית לבחון את הבהירות היחסית של התאים הסרטניים בכל עמדה.
  10. שמור את המיקומים החדשים של כל אחד מן התאים על ידי לחיצה על הלחצן 'שמור' פאנל Multipointd ציין שם קובץ.
  11. עבור הדמיה של תאים סרטניים בודדים, לקחת שלושה תאים של בהירות כ מקבילה ולמחוק כל מיקומים אחרים מהרשימה המרובה על ידי לחיצה על מיקומם ברשימה ולאחר מכן לחיצה על הכפתור מחק.
  12. לחץ על כפתור גלאי ליזר ולהתאים את המחוונים על רווח PMT של ערוצים הירוקים ואדום 45 כך האותות הם מתחת רוויה.
  13. הזז את המחוון עבור הערוץ הכחול 45 כך מקרופאגים להופיע ציאן.
    הערה: כל אות הרמונית שנייה תופיע רק בערוץ הכחול ניתן להפריד מקרופאגים ציאן ידי ביצוע הליך חיסור ערוץ שתוארה לעיל 45.
  14. הגדר את עומק התחלה Z- מחסנית ל -0 מיקרומטר ואת עומק קץ 24 מיקרומטר ידי הזזת הבמה z למיקום ולחיצה על התחל וכפתורים סוף בהתאמה.
    הערה: תאים בתוך עומק זה יהיה מדמיינים עם האות הטוב ביותררעש ורזולוציה.
  15. הגדרת גודל z צעד עד 3 מיקרומטר.
  16. הגדר את פרמטרי ההדמיה הבאים פרמטרים שתוארו לעיל 45,49.
    1. עבור הדמיה של תאים סרטניים בודדים, לחץ על לחצן אותות תזמון ולאחר מכן זן 4 V לתחום גורם זום (שווה ערך ל גורם זום של 1.5x), זן 3 לתחום ממוצעי מסגרת ולחץ על כפתור זמן לשגות וזן 10 לתחום זמן לשגות.
      הערה: הגדרות אלו תרכושנה 1 מסגרת כל 3 שניות.
    2. עבור הדמית פסיפס, לחץ על לחצן אותות תזמון וזן גורמים זום של 1.5 וולט (שווה ערך ל גורם זום של 4X), זן 3 במספר ממוצעי מסגרת ולחץ על כפתור הזמן לשגות וזן 10 לתוך הזמן- לפקוע שדה שהייה.
      הערה: הגדרות אלו תרכושנה 1 מסגרת כל 3 שניות.
  17. הפעל את מרובות, Z- מחסנית מצבי הדמיה t לשגות ידי לחיצה על הכפתורים שלהם.
  18. לחץ על כפתור ההקלטה לרכוש תמונות.
    לֹאE: רקמת ריאות היא מאוד עדינה רגישה צילום ניזק. אם לאחר זרימת דם הדמית הזמן לשגות מפסיקה בתחום ההדמיה, הליזר הוא הסיכוי טוב ביותר מדי גבוהת הדמיה ומאוחרת יותר של שדות אחרים חייב להיעשות בהספק נמוך.
  19. כל 30-45 דקות, להזריק לאט 50 μl של PBS או תמיסת מלח כדי לשמור על לחות של החיה.

6. המתת חסד

  1. הגדל את isoflurane עד 5%.
  2. שמור את החיה תחת isoflurane 5% עד 30 שניות לאחר שתפסיק לנשום ולהסיר את החיה מן הבמה.
  3. בצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוחלט.

ניתוח תמונה 7.

  1. בניסויים הדמיה תא בודד:
    1. טען תמונות לתוך פיג'י ועיצובם בתור hyperstack.
    2. עבור כל z-פרוסת hyperstack, להפעיל את סרט הזמן לשגות ולחפש תנועת XY שיורית. אם תנועת XY שיורית נמצאה, להחיל את התוסף בשם StackReg 36 אל הערימהלחסל את התנועה.
  2. בניסויים הדמיה פסיפס:
  3. טען תמונות לתוך פיג'י ותופר אותם על ידי פתיחת מאקרו תפירת הפסיפס (קובץ קוד משלימת תפירת פסיפס) ומידע הזנה על התמונות כגון הספרייה, שם בסיס הקובץ, מספר שדות x ו- y בפסיפס והמספר של פרוסות ונקודות זמן.
    הערה: בשל כיצד Java מפרש ספריות, שמות תיקיות חייבות להיות שני לוכסנים כמפרידי תיקיית משנה. בשל מגבלות של תפירת Pairwise תוסף המובנהית, שמות קבצי בסיס לא יכילו כל מקפים.
  4. כדי לקבל תצוגה ברורה של הגבולות של כלי הדם, ממוצע יחד את כל נקודות הזמן עבור ערוץ הדם לתוך תמונה אחת ולאחר מכן לשכפל את התמונה כרקע עבור כל מסגרת של הסרט של הערוצים האחרים.
    הערה: זה נעשה פשוט על ידי הפעלת ממוצעים דם בצע מאקרו (קובץ קוד משלימה בצע מיצוע דם).
  5. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את סוג התוצאות שניתן להשיג בשיטה זו, אנו מזריקים תאים סרטניים E0771-LG שכותרתו עם תלתן חלבון פלואורסצנטי לווריד הזנב של עכברים MacBlue 44 בשעה משתנים נקודות זמן לפני הניתוח. לאחר ניתוח, 155 dextran שכותרתו rhodamine KD הוזרק IV לציון ההדמיה בכלי הדם ואת הזמן לשגות בוצעה.

כאשר הדמיה עכברים 24 שעות לאחר ההזרקה, תאים בודדים גלויים הפנימי של כלי הדם, אינטראקציה עם מקרופאגים ומונוציטים. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2 א (משלימה סרט 1). הנה קטע אופטי בודד של תאים סרטניים בודדים (ירוקה) 12 מיקרומטר עמוק ונתקעו בכלי דם הריאות הוא צלם במשך 5 שעות ו -20 דקות כפי שהוא אינטראקציה זמנית עם מקרופאג תושב (ציאן). כלי הדם מסומן על ידי dextran משקל מולקולרי גבוה. היציבות שלהדמיה היא כזו הדמיה Z- מחסנית רציפים של השדה יכול להיות רכשה שחזור 3 ממדי יכול להתבצע (תרשים 2B, סרט משלימה 2).

שימוש בהגדרות מיקרוסקופ כמתואר בפרוטוקול הדמית פסיפס מאפשר הדמיה של מבנים גדולים יותר מאשר שדה אחד של נוף. לדוגמה, איור 3 מדגים הרכישה של נגע גרורתי יחיד, 12 ימים שלאחר ההזרקה. פסיפס 5 x 5 זה מראה 890 מיקרומטר שדה הראייה מעל 205 דקות ב 15 (איור 3 א, פאנל משמאל; משלימה Movie 3) ו -25 מיקרומטר (איור 3 א, פאנל מימין) מתחת לפני השטח של הריאה. למרות השדה הגדול של נוף, ברזולוציה הגבוהה של מסגרות יסוד המרכיבות את הפסיפס מאפשרת ללכוד אירועי subcellular כגון מיטוזה של תא בודד כפי שמעיד הפרדה כרומוזומליות (איור 3B, משליםסרט 4).

הזרקת intravascular של משקל מולקולרי גבוה שכותרתו fluorescently תוצאות dextran ב תיוג של לומן כלי הדם, אולם ללא תווית מחזורי אריתרוציטים ו לויקוציטים לחסום את dextran. בנימים הקטנות של הריאה, על החסימה היא תוצאה שלמה בתוך מהבהבים של אות dextran ובהשוואה להפסד של תחימת כלי הדם (איור 4, שמאל; משלימת Movie 5). היציבות מרחבית הגבוהה הניתנת על ידי פרוטוקול זה מאפשר מיצוע זמן של ערוץ הדם, ללא טשטוש, ובכך משחזר את החסימות הזמניות. ערוצי אותות אחרים אז יכול להיות מעולף על כלי הדם כדי לספק תצוגה ברורה של גבולות כלי (איור 4, נכון; משלימה סרט 6).

איור 1
איור 1:. פריסה של מערכת ואקום הבית מנוצל ומוגדר לרמה מוגדרת עם רגולטור ואקום. כד ללכוד מונע זיהום של מערכת רגולטור ואקום ידי נוזלי גוף. צינורית דקה וגמישה מעבירה את הוואקום לקיצוץ קצה פיפטה כך שתתאים ליציאת הוואקום של חלון ההדמיה. חלון ההדמיה הוא בכושר לתוך חריץ הפסקה בצלחת הדמית שמירה על יציבות מיקומית שלה ביחס העדשה האובייקטיבית מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הדמית תא בודדת של הריאות (א) סטילס מסרט זמן לשגות של תאים סרטניים בודדים במיטת נימי הריאה 24 שעות לאחר וריד זנב.זריקה. (אדום = כלי דם, ירוק = תאים סרטניים, ציאן = המקרופאגים) (B) הדמיה יציבה מאפשרים שלושה ממד ושחזור נתוני הדמיה לאורך זמן. כלי דם כבר השקיעו בממוצע לבהירות. (אדום = כלי דם, ירוק = תאים סרטניים, כחול = המקרופאגים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: יציבותה של הריאות מאפשר ברזולוציה גבוהה, גדול בתחום צפו הדמיה של הריאות על ידי סדרתית רכישת התפירה יחד של במכפיל הנמוך הגדלה פילדס (א) 5 x פסיפס 5 מציג 890 מיקרומטר שדה הראיה של. נגע גרורתי הריאה 12 ימים לאחר הזרקה לוריד הזנב של תאים סרטניים נלקחה ב 15 מיקרומטר מתחת לפני שטח הריאות(פאנל משמאל). פנל ימני מראה נגע אותו גרורתי ב 25 מיקרומטר מתחת לפני שטח הריאות. (ב) שדות ברזולוציה גבוהה הפרט לחשוף תהליכים subcellular כגון יישור כרומוזומליות (חיצים צהובים) והפרדה (חצים אדומים) בעת חלוקת התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הזרקת intravascular של שכותרתו fluorescently המולקולרי הגבוהה המשקל Dextran מרקס לומן של כלי הדם, חוץ מהתקופה ללא תווית אריתרוציטים ותאי במחזור שני לחסום את קרינת האיתותים (א) התוצאות ספיגות בתוך תיוג שלם אשר נע בזמן וכתוצאה מכך טשטוש השפעה מהבהבת. גבולות הכלי. (ב) גבוהיציבות מרחבית של חלון הוואקום מאפשרת ערוץ הדם להיות השקיעו בממוצע, מילוי החסימות הזמניות הגדרה ברורה של גבולות הכלי. הערוצים האחרים אז הם כיסו בלי ממוצעים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שָׁנָה מחבר ראשון / מחבר אחרון בעל חיים כִּירוּרגִיָה סוג של הדמיה הערות
1926 Wearn & גרמנית חתולים דופן בית החזה נכרתה כדי שכבת פלאורלי. הפתיחה שנייה עשתה דרך הסרעפת כלפי מטה כדי הצדר לתאורה. מיקרוסקופ שדה בהיר. "חלון" קודם דרך קיר פלאורלי.
1939 אֲרִיג מַגָבוֹת חתולים הצלעות מופרדות, 1 ב. חלון מושתל, האוויר ייוסר חזה עם ואקום. מיקרוסקופ משקפת ועור באמצעות תאורה מקוטבת. ראשית מושתל חלון אופטי. ואקום נהג לצייר רקמות לחלון.
1963 דה אלווה & ריינר ארנבים וכלבים אחת או שתי צלעות הם resected ו -1. מוכנס החלון לצורך איחוי כדי דופן בית החזה. עור נסגר מעל החלון חי מותר לרפא. לפני הדמיה, העור היה גזור כדי לחשוף חלון. צילום גבוה מהירות stroboscopic משומש באמצעות mag נמוכה (11x) אובייקטיבי. חלון בתחילת הישרדות.
1965 וגנר & Filley כלבים forelimb ימין הוסר, חתך אחד צלעות חלון מוכנס לצורך איחוי. מיקרוסקופיה השתקפות עם מטרת 22x. חלון חינם ראשית יחסית תנועה ללא ואקום.
וגנר כלבים צלע אחת היא כריתה, 3 ב. חלון מושתל. ברגים מקורבים מושחל חלון כדי ליצור חותמים על דופן בית חזה. מיקרוסקופיה Brightfield עם טבילה אובייקטיבית נפט גבוהה בהגדלת 100X. חלון ראשון להשתמש בשואב אבק כדי לייצב תנועת רקמות.
1992 Groh & גץ ארנבים צלע אחת שנקטעה, 1.2 ב. חלון מושתל. ברגים מקורבים מושחל חלון כדי ליצור חותמים על דופן בית חזה. אבק מוחל. מיקרוסקופיה epifluorescent עם המטרה 25x. השימוש הראשון של חלון ואקום עם epifluorescence.
1994 Fingar & Wieman חולדות 2 צלעות הן resected, 1 ב. מושתל חלון לצורך איחוי כדי קיר עור חזה. מיקרוסקופיה epifluorescent עם מטרת 40X. חלון בתחילה הישרדות בחולדות.
2000 Funakאושי & Mitsui עכברים דופן בית החזה כולו הוסר. טבעת יניקת ואקום מצורפת ריאה ימנית. מיקרוסקופיה Confocal עם מטרה 20X. השימוש הראשון של חלון ואקום בעכברים.
2005 לם & גלני חולדות דופן בית החזה כולו הוסרה, 1 ב. חלון מצורף ריאות. השתקפות מיקרוסקופ epifluorescent עם מטרה 20X. השימוש הראשון של חלון ואקום בחולדות.
2008 Tabuchi & Keubler עכברים 3 צלעות הם resected, סרט פלסטי להחיל פתיחה לאטום חור בקיר חזה. האוויר הוסר באמצעות קטטר intrapleural. מיקרוסקופיה epifluorescent עם מטרת 20X. ראשית להשתמש בסרט פלסטיק לאטום הפתח בדופן בית החזה.

טבלה 1: סקירה היסטורית של Development של Windows Imaging ריאות Intravital. חלונות הדמיה רומן רבים ריאות intravital פותחו לאורך השנים עם האחרון שבהם מיניאטורי לשימוש בעכברים, העסקת ואקום לייצוב רקמות והשגת ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להיות מסוגל לחשוף פרט subcellular.

איור 1 משלימה: עיצוב ציור של חלון הדמיה אבק אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימת איור 2: תמונות של התקנת אבק אנא לחצו כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 3: עיצוב Drawi ng של כנס פלייט שלב אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלים איור 1
משלימה סרט 1:. סרט של סטילס באיור 2A (קליק ימני להוריד).

משלים איור 2
משלימה העבר 2:. סרט של שחזור 3D שמוצג באיור 2B מראה זוויות צפייה שונות והתקדמות לאורך זמן (קליק ימני להוריד).

> משלים איור 3
משלימה Movie 3:. סרט של פסיפס 5x5 שמוצג באיור 3 א ב 15 מיקרומטר מתחת לפני השטח ריאות (קליק ימני להוריד).

משלים איור 4
משלים לצעוק 4:. סרט של תא בודד מתואר באיור 3 ב העוברים מיטוזה הבריאה (קליק ימני להוריד).

משלים איור 5
סרט משלימה 5: סרט של איור 4, פאנל משמאל מראה חסימה ו fמצליף. (קליק ימני להוריד).

משלים איור 6
משלימה סרט 6:. סרט של איור 4, נכון פאנל מראה התאוששות של הגדרה וסקולרית לאחר מיצוע דם (קליק ימני להוריד).

קובץ קוד משלימה:. פסיפס תפירה אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ קוד משלימה:. בצע דם ממוצעים אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רזולוציה גבוהה הדמיה אופטית vivo בשילוב עם תגים תפקודיים שכותרתו fluorescently כגון חלבונים ונוגדנים יש עלה באופן משמעותי את הבנתנו של המפל גרורתי. זה איפשר להדמיה ישירה וכימות של תא בודד ופרמטרים המשנה הסלולר בתאי גידול, תאי המארח microenvironment שלהם. הדמיה זו בתוך הגידול הראשוני הובילה, למשל, כדי גילוי microenvironments הדיסקרטית, כי הם תומכים או של פלישת צמיחה או 6,7 הפצה. במקרה של פלישה, in vivo הדמיה חשפה את התפקיד המועדף של הזרמת שיתוף migrational של מקרופאגים ותאי גידול intravasation 7,50.

בשנת אתרים משניים כמו הריאות, להבנת הדינמיקה של התנהגות תאים סרטניים בשלבים המוקדמים של גרורות, לרבות שלב הזריעה מראש micrometastasis כשקבוצות יחידות קטנות של תאים סרטניים מגיעותאינטראקציה עם האנדותל של כלי הדם, יושג רק באמצעות דימות אופטי ברזולוציה גבוהה. שיטות הדמיה קליניות רגילות אין החלטה צריכה לדמיין גם את המבנה העדין של מיטת הנימים או מורפולוגיה האינטראקציה של תאים ברזולוצית תא בודד. טכניקות ההדמיה שהוצגו בפרוטוקול זה לבצע משימה מאתגרת זו.

חלונות הדמית Intravital כגון אלה המפורטים בהצעת טבלת 1 יתרון משמעותי על פני הכנות ריאות vivo לשעבר ידי שמירת פיזיולוגית ריאות נכונה כולל זלוף, חיבור למערכת החיסונית מציע יותר מסתם תצוגה סטטית של דינמיקת סלולר. הוואקום התייצב חלונות בהצעה מסוימת ברמה של יציבות רקמות המאפשרת רכישת תמונות הרשומות מאוד, מה שמאפשר שלושה שחזורים ממדיים (תרשים 2B) ואת היכולת עבור שדה גדול של הדמית פסיפס נוף (איור3A יור). כל אלה ביחד מספקים מגוון דעות של הריאה, מנקודת מבט בהגדלה נמוכה סוג היסטולוגי אשר נותן את המורפולוגיה רקמות, כדי נוף הסלולר תת שיכולים אפילו לחשוף ההפרדה כרומוזומליות ולהפלות רדום חלוקת תאים סרטניים (איור 3). ערוצי רכישה מרובים יציאתם של מספר סוגי תאים ואת האינטראקציות ביניהם להיות דמיינו בו זמנית (איור 2 א).

בעוד הפרוטוקול לוקח קצת מיומנות טכנית, תרגול ותשומת לב כמה צעדים ונקודות קריטיים ישפר את שיעור ההצלחה של פעמי ההליך והדמיה של עד 12 שעות ניתן לצפות. זה קריטי כדי לוודא רקמת הריאה היא מרוכזת היטב מעל החלון (שלב 4.25). הדבר מבטיח כי הוואקום מוחל באופן שווה לחלוטין ברחבי רקמת הריאה (שלב 4.27). אי למרכז את הרקמה יגרום תנועה של הרקמה. הרתמה ההרחקה (משלים איור 2) משמשת to להפחית את ההצעה מושרה על ידי התכווצות של שרירי צלעי במהלך הנשימות הטבעיות החיה לוקחת. זה צריך להיות הדוק על העכבר, אבל לא לדחוס את החזה. דחיסה יותר מדי מפעיל לחץ על כל האונות של הריאות, כמו גם את הלב ואת התוצאות כדאיות מופחתת של העכבר. אם dextran לא נצפה זורם בכלי דם הריאות לאחר ההזרקה (שלב 5.8), רקמת הריאה היא גם נפגעה מטיפול לא נאה במהלך ניתוח או רמת הוואקום היא גבוהה מדי. הורדת הוואקום ידי כספית 0.5-1 אינץ ניתן ניסיתי לראות אם זרימה משוחזרת. אם הזרימה אינה מתחדשת, או אם יש זרימה, אבל dextran הוא ציין extravascularly, רקמת הריאה נפגמה באזור זה וזה יהיה צורך תמונת שדה מבט שונה. תחזוקה של זרימת דם תקינה באזור ההדמיה חשובה להבטיח כי פיזיולוגיה נכונה נמדדת. מאז מסופק חמצן לרקמות מבפנים של alveoli ולא דרך vasculature, להיפוקסיה סביר. ובכל זאת, כלי דם unperfused פוטנציאליים יכול להוביל חמצן שינה / CO 2 רמות וגם ימנעו במחזור לויקוציטים מלהגיע ברקמות של עניין. ויזואליזציה של אריתרוציטים זורמים יכולה לשמש כאינדיקטור של תפקוד ריאות התקין. רקמת הריאה היא מאוד עדינה גם רגישה-ניזק תמונה. אם לאחר זרימת דם הדמית הזמן לשגות מפסיקה בתחום ההדמיה, הליזר הוא הסיכוי טוב ביותר מדי גבוהת הדמיה ומאוחרת יותר של שדות אחרים חייב להיעשות בהספק נמוך. מצאנו ~ 10-15 mW על מדגם לייצר תמונות בהירות מספיק ללא נזקי בעת שימוש או GFP או תלתן (שבו יש ארבע פעמים את בהירות ממוצעת) תאים transfected. רמות בהירות מינימאליות עבור חלבוני הניאון הם תלויים במידה רבה על פרמטרי מיקרוסקופ ואת רמות הביטוי בתאים חייבים להיבדק באופן אמפירי.

בפרוטוקול זה, תאים סרטניים מסומנים עם cytoplas בהירחלבון פלואורסצנטי מיקרופון המציע תצוגה ברורה של גוף התא וחללים תאיים, המוציאים את החלבון (גרעין כלומר). המקרופאגים מסומנים על ידי ניצול syngeneic במודל עכבר מהונדס לתאי הגידול. תיוג שני סוגי התאים מאפשר הדמיה של האינטראקציה הישירה שלהם בזמן אמת. המשך המורחב של הדמיה מאפשר כימות של התדירות, משך וההיקף שבה תאים סרטניים אינטראקציה עם מקרופאגים בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

כאשר ביצעו כראוי, הליך זה מאפשר תנועה חופשית, ערוצים מרובים, ברזולוציה גבוהה, הדמיה תא בודד בריאה בשלמותה לתקופות של עד 12 שעות. שימוש עדשה אובייקטיבית צמצם מספרית גבוהה כגון 25x 0.95NA ואת היכולות של multiphoton עבור זום אלקטרוני מאפשר ההדמיה האופטית ברזולוציה הגבוהה ביותר הריאה ראתה עד היום.

ניאון מוזרק Intravascularly, משקל מולקולרי גבוה PE dextranrforms את התפקיד הכפול של תיוג מרחב וסקולרית ואימות שלמותה. dextran 155 kDa משמש למניעת דיפוזיה דרך חללי interendothelial. כל סימן של חוסר זרימת כלי הדם או דליפה של כלי הדם לחלל extravascular מציינת נזק לרקמה עקב טיפול לא נכון או ואקום מוגזם.

לבסוף, טכניקות עיבוד תמונה ייחודיות יכולות להיות מועסקות המנצלות את היציבות מרחבית הגבוהה של פרוטוקול זה. מאז אריתרוציטים ללא תווית לויקוציטים אחרים שוללים את dextran הניאון כשהם עוברים דרך הנימים, איתות ניתן בממוצע לכל זמן להסיר את המהבהבים שהם יוצרים. זה מציע נוף מוגדר היטב של כלי הדם לא יתכן אחרת.

מגבלות של טכניקה זו כוללות היא את האופי פולשנית של הניתוח, אשר מסבך את השימוש בו באופן פוטנציאלי עבור חקר מחלות המחלישות את החיה (סרטן גרורתי בשלב למשל מאוחר,אנמיה חרמשית חריפה), והעובדה כי הניתוח הוא מסוף המגבילה אותו להשתמש כדי יחיד, אם כי ארוך (עד 12 שעות), פגישת הדמיה. יתר על כן, נתון משך הזמן הארוך של פגישת ההדמיה ועתודת גליקוגן בכבד הנמוכה של עכברים 51, תוספת גלוקוז יכול להינתן כדי למנוע מקורות פוטנציאליים של הטיה בניסויים.

פרוטוקול זה יכול להיות שונה באופן פוטנציאלי עם נוגדנים בזריקות שכותרתו fluorescently או במקום או בנוסף dextran כדי לתייג מבנים אחרים או סוגי תאים בזמן אמת. זה ירחיב את היכולות לניתוח לנתח במיקרו-סביבה של הגידול על ידי אינטראקציות תא חזותי גידול התא המארח ישירות ודינמיקה בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum McMaster Carr 4172K12  Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe McMaster Carr 5346K13 Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml Corning Life Sciences Glass 5360-50 Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.  Ted Pella, Inc. 260368 Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.  Exel International 26746 Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0 VWR 95056-992 String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz Hendel Corp. LOC1647358 Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG 155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length McMaster Carr 5155T12 Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length  McMaster Carr 5181K24  Thick Tubing
Depillatory Lotion Nair -
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/1 Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle BD 305128 Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID McMaster Carr 5117k51 Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers Fisher Scientific 14-135F Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl Denville Scientific Inc. P1125 Pipette Tip
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm Roboz Surgical RS-5912 Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt Roboz Surgical RS-5980 Blunt Scissors
Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Harness
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip BD 309659 Syringe
Cyano acrylate Staples LOC1647358 Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly Fisher Scientific 19-086291 Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm Harvard Apparatus 734118 Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter Kent Scientific Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 250 ml
Oxygen TechAir OX TM
1x PBS Life Technologies 10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In Grainger 3CGJ7 Vacuum Valve
Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 683 Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice Jackson Laboratory 026051 
Multiphoton Microscope Olympus Fluoview FV1000 Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure Precision Plastics Chamber for FV1000 Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136
Laser Power Meter Coherent FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head Coherent PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector Addgene 40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic ThermoFisher Scientific 10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter  Beckman Coulter XDP
Trypsin EDTA 1x Corning 25-052-Cl
40 µm Mesh Falcon 352235
96 Well Plate Costar 3599
60 mm Culture Dish Corning 430196
10 cm Culture Dish Corning 353003
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Corning 21-031-CV
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664 
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6, (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4, (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179, (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12, (11), e1001995 (2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5, (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15, (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112, (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106, (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14, (5), R124 (2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483 (2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7, (353), ra112 (2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13, (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58, (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6, (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, (8), e6562 (2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475, (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24, (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90, (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2, (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26, (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192, (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98, (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25, (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212, (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16, (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12, (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158, (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6, (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042 (2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7 (2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2, (2), e25294 (2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, (1), C1-C18 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics