Hazırlama ve
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., et al. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Aktivite bazlı protein profili (ABPP) enzimin aktif sitesi hedef kimyasal sistemlerinin kullanımı ile kompleks proteomun daki bir enzimin tanımlanması için bir yöntemdir. sonda içine bir raportör etiketi-jel floresans tarama protein blot, floresan mikroskobu ya da sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile etiketlenmiş enzim algılanmasına olanak verir. Burada, hazırlanması ve bileşik ARN14686 kullanımını seçici enzim N -acylethanolamine asit amidaz (NAAA) tanıdığı bir tıklama kimya faaliyet tabanlı prob (CC-ABP) açıklar. NAAA örneğin palmitoiletanolamidi (PEA) ve oleoylethanolamide (OEA) gibi endojen peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör (PPAR) -alfa agonistleri devre dışı bırakarak iltihabı teşvik eden bir sistein hidrolazdır. NAAA lizozom asidik pH autoproteolysis ile aktive edilen bir aktif olmayan, tam uzunlukta bir proenzim olarak sentezlenir. Lokalizasyon çalışmaları hNAAA ağırlıklı B-lenfositlerinde ve, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücrelerde eksprese olduğu gösterilmiştir ave. Biz ARN14686 tespit ve protein blot ve floresan mikroskobu ile kemirgen dokularında aktif NAAA ex vivo olarak ölçmek için kullanılabilir şeklinin örneklerini sağlar.

Introduction

Yaygın tüfek analizi 1,2, maya için sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi platformları içeren ekspresyonu, etkileşimler ve işlevleri proteinlerin araştırmak için yöntem kullanılan iki hibrid yöntemler 3,4 ve in vitro deneyler, bu olmasıyla sınırlıdır kendi doğal yapısında proteinlerinin aktivitesini değerlendirmek mümkün. Etkinlik bazlı protein profilleme (ABPP) bu boşluğu doldurmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, küçük moleküllü kovalent hedef saptama için izin veren bir raportör gruba konjuge edilmiş bir ilgi enzimin aktif bölgesine bağlanabilen probes. Tıklama kimyası (CC) kullanarak, muhabir prob entegre edilebilir veya hedef nişan 5,6 oluştuktan sonra sokulabilir. İkinci prosedür, suc biyo-dik reaksiyonlar vasıtasıyla haberci reaktif bir dizi modifiye edilebilir bir terminal alkin veya azid gibi uygun kimyasal gruplar ihtiva eden sondalannın kullanılmasını gerektirirCu (I) H [3 + 2] siklo-7-9 ya da Staudinger ligasyon 10,11 Hüsgen, paladyum.

Son zamanlarda, in vitro ilk ABP gibi sistein hidrolaz, NAAA 12 in vivo tespiti bileşik ARN14686 tarif. NAAA antienflamatuar nükleer reseptör PPAR-alfa 13-15 endojen agonistleri olan oleoylethanolamide (OEA) ve palmitoiletanolamidi (PEA) de dahil olmak üzere doymuş ve tekli doymamış FAES, hidrolitik devreden katalize eder. NAAA ağırlıklı doğal bağışıklık tepkisinin düzenlenmesinde önemli bir rol öne hem de B-lenfositleri 14,16 olarak, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücre olarak ifade edilir. Enzim, bir aktif olmayan formda endoplazmik retikulum içinde sentezlenir ve otoproteolitik mekanizması 17 hücrenin asidik bölümlerinde aktive edilir. Otoproteolitik klevaj (C13 Yeni N-terminal sisteini üretirFare ve sıçanlarda 1, insanlarda 126P), bu FAE için nükleofil sorumlu 18,19 hidrolizidir. NAAA aktivitesinin farmakolojik inhibisyonu FAEler 16,20,21 artmış hücresel seviyedeki lehine FAE sentezini / yıkımını dengesini değiştirir. Çeşitli β-lakton ve β-laktam türevleri, yüksek bir potansiyel ve seçicilik 16,22-26 ile NAAA aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu inhibitörler, katalitik sistein 16,27,28 S -acylation olarak hareket eder.

(- [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 4-cyclohexylbutyl- K) 16 bileşiği, ARN14686 sistemik aktif serin türevi β-laktam NAAA inhibitörünün kimyasal yapısı, ARN726 göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir azid taşıyan raportör etiketi ile müteakip CC konjügasyonu için bir terminal alkin etiket taşıyan bir C9 doymuş alifatik zinciri ile ikame edilmiştir. Biz minimall için iki adımlı bir ABP tasarımı seçtiy böylece NAAA için prob afinite koruyarak, orijinal iskele yapısını değiştirebilir. Ayrıca, hacimli etiketlerin giriş kaçınarak, bir sonda, bir doğrudan ABP daha canlılarda tedavi için daha uygun olabilir. ARN14686 yüksek etki ile NAAA inhibe enzim 12 katalitik sistein ile kovalent bir katılma ürünü oluşturmak suretiyle (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM). canlı farelerde deneyler prob NAAA akciğerlerde ifade yakalama seçici olduğunu göstermiştir. Yüksek prob konsantrasyonunu (in vitro 10 uM, 10 mg / damar içi, iv mi) 12 kullanılarak, asit seramıdaz, NAAA ile 33-34% özdeşlik paylaşan başka sistein amidaz, aynı zamanda, düşük afiniteli bir hedef olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, tam Freund adjuvanı (CFA) 29 uygulanmasından sonra iltihaplı sıçan dokularında aktif NAAA varlığını incelemek için ARN14686 kullandık.

Burada, Preparati için bir protokol anahatARN14686 (Şekil 1) ve NAAA aktivasyonu ex vivo soruşturma onun uygulaması üzerinde. Bir örnek olarak, CFA tatbikatından sonra sıçan pençelerde NAAA görselleştirmek için deneysel bir prosedürü açıklar. Bu deneyde, protein sondanın IV enjeksiyonundan sonra pençe dokusundan ekstre edilir ve ABP-etiketli proteom biyotin-azid ile CC tabi tutulur. Biyotinile örnekleri streptavidin boncuk kullanılarak zenginleştirilmiş ve protein lekeler yapılmaktadır. Başka bir uygulamada, prob ile tedavi edilen farelerden alınan fare akciğerlerinde floresan mikroskobu aktif NAAA lokalizasyonunu tarif etmektedir. Bu durumda, dokunun kesit bölümleri ve rodamin ilave edilmesi için CC tabi tutulur. Bir iş akışı şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Bütün kimyasal reaksiyonlar havalandırılan bir duman başlığı ve bir laboratuar kaplama, eldiven ve koruyucu gözlüklerin kullanımı ile yapılmalıdır. reaksiyonlar da bir azot ortamında gerçekleştirilmelidir.

Etik açıklama: hayvanları da içeren Bizim prosedürleri Deneysel ve diğer bilimsel amaçlar (DM 116.192) ve Avrupa Ekonomik Topluluğu düzenlemeler için kullanılan hayvanların korunması konusunda İtalyan düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir (OJ EC L 358/1 1986/12/18 ).

NOT: sentezi [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat, büyük ölçekli verimlerle tarif edilmiştir, ancak bu aşağı doğru kolayca ölçeklendirilebilir (N-Cbz-L-serin, 50 g) eklenmiştir.

1. sentezi

NOT: Sentez Reaksiyon şeması için Şekil 1'e bakınız.

  1. 2-piridil undek-10-inil karbonat hazırlanması ve undek-10-inil 2-oksopiridin-1-karboksilat
    1. 50 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, undec- 350 mg çözülürkuru diklorometan 3.5 ml, 10-in-1-ol elde edilir.
    2. 1.1.1 çözeltiye, 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ve 2-dipiridilkarbonat (DPC) 530 mg 25 mg ekleyin. 16 saat oda sıcaklığında (RT) karıştırın.
    3. 20 mL diklorometan ekleyin.
    4. bir ayırma hunisi içine karışımı aktarın. Su 15 ml ekleyin sallayın ve iki faz ayrılması için izin verir.
    5. , Musluğunu açın organik faz (alt) toplamak ve sonra stopcock kapatın. Doymuş NaHCO 3 çözeltisi 15 ml ilave edilir. ayırma hunisi çalkalayın ve iki faz ayıralım. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
    6. Na 2 SO 4 Organik tabaka, yuvarlak dipli bir şişeye (dara önce) içine pamuk üzerinde filtre edildi ve indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılır.
    7. şişeyi tartılır ve 2-piridil undek-10-inil karbonat ve undek-10-inil, 1.7 bir oranda 2-oksopiridin-1-karboksilat bir karışımı olan bir yağ, 600 mg elde edilir: 1.
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ana bileşen δ = 8.39 (dd, J = 5.0, 2.0, 1 H), 7.98 (td, J = 7.9, 2.0, 1 H), 7.40 (ddd, J = 7.2, 4.9, 0.9, 1 H), 7.30 (d, J = 8.2, 1 H), 4.22 (t, J = 6.6, 2H), 2.73 (t, J = 2.4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 2H), 1,50-1,23 (m, 12H).
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) küçük bileşen δ = 7.74 (dd, J = 7.2, 1.9, 1 H), 7.47 (dd, J = 6.7, 2.3, 1 H), 6.44 (d, J = 9.4, 1 H), 6,30-6,25 (m, 1 H), 4.35 (t, J = 6.5, 2H), 2.72 (t, J = 2.4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. daha fazla ayırma veya saflaştırma yapılmadan bir yağ kullanın.
  2. [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat hazırlanması
    1. Benzil N - [(S) -1- (hidroksimetil) -2 - [(4-metoksifenil) amino] -2-oxoethil] karbamat.
      1. 4 L'lik yuvarlak dipli bir şişede tetrahidrofuran 1.5 L diklorometan 0.5 L p -anisidine arasında 141.5 g çözülür.
      2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. N-Cbz-L-serin 50.0 g ekleyin ve N 43.9 g S - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid hidroklorid.
      4. 30 dakika boyunca 0 ° C 'de manyetik bir çubuk ile karıştırın.
      5. buz banyosunda solüsyonun çıkarın ve 16 saat oda sıcaklığında, bir manyetik çubuk ile karıştırıldı.
      6. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında solventler buharlaştınn.
      7. Bir spatula ile karıştırıldı, 1 sikloheksan / etil asetat ve süzün: 1, 400 ml ilave edilir.
      8. Adımı yineleyin 1.2.1.7 iki kez daha.
      9. Etil asetat, 500 ml sakızsı artığı içinde çözündürülür ve (2 kez), doymuş NaHCO 3 çözeltisi 400 ml 0.1 M HCI çözeltisi (10 kez), 400 ml ile yıkanır, ve tuzlu su ile, 400 ml.
      10. Organik tabaka kurutulurSO 4 Na 2, (dara ilk), yuvarlak dipli bir şişeye pamuktan çözelti filtre edildi ve indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılmak.
      11. şişeyi tartılır ve beyaz bir katı madde 61,4 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9.86 (bs, 1 H), 7.52 (d, 2H, J = 9.0Hz), 7.42-7.25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5.06 (d, 1 H, J = 12.9 Hz), 5.02 (d, 1 H, J = 12.9 Hz), 4.98 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1 H), 3.72 (s, 3H), 3.70-3.57 (m, 2H).
    2. Benzil N - [(S) -1- (4-metoksifenil) -2-okso-azetidin-3-il] karbamat.
      1. N 58.6 g çözülür - [(S) -1- (hidroksimetil) -2 - [(4-metoksifenil) amino] -2-okso-etil] karbamat, N, N-dimetilformamid içinde 1.6 L.
      2. bir buz banyosu ile 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. 1,1'-sulfonyldiimidazole 50.6 g ekleyin ve 30 dakika için bir manyetik çubuk ile karıştırıldı.
      4. Bu solüsyon soğumayakısımlar halinde -20 ° bir buz / NaCI banyosunda C ve sodyum hidrit (mineral yağ içinde% 60) 10.2 g ekleyin.
      5. 1 saat boyunca -20 ° C 'de karıştırınız, sonra 2 ml metanol ve 1 L su ile söndürün.
      6. Vakum, çökelti filtre 200 ml su ile yıkanır ve vakum altında kurutulur.
      7. beyaz bir katı 42.2 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.08 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7.30 (d, 2H, J = 8.9Hz), 6.95 (d , 2H, J = 8.9Hz), 5.06 (s, 2H), 4.86 (ddd, 1 H, J = 8.5, 5.6, 2.6 Hz), 3.90 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.73 (s, 3H) , 3.55 (dd, 1 H, J = 5.6, 2.6 Hz).
    3. Benzil N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat.
      1. Benzil N- 9.0 g Askıya - [(S) -1- (4-metoksifenil) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 500 ml asetonitril ve 400 ml su içinde.
      2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. ceri 45.4 gr ekleCı amonyum nitrat kısım kısım 45 dakika boyunca ve 15 dakika boyunca 0 ° C 'de manyetik bir çubuk ile karıştırıldı.
      4. Dikkatle doymuş NaHCO 3 çözeltisi 500 ml ilave edilir, ve daha sonra etil asetat ile 500 ml ekleyin.
      5. çökelti filtre edin ve etil asetat ve 200 ml ile yıkanır.
      6. İki fazlı çözelti ayınn ve etil asetat, 200 ml (3 kez), sulu tabaka yıkayın.
      7. Na 2 SO 4 Organik tabaka, bir iki atomlu silika pedi içinden aktif kömür 5 g, filtre eklemek, ve düşük basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılır.
      8. dietil eter ekleyin ve bir spatula ile karıştırılmıştır.
      9. Katı filtre edin ve kirli beyaz bir katı madde 4.85 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.97 (d, 1 H, J = 8.7 Hz), 7.94 (bs, 1 H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5.05 (s, 2H), 4.67 (ddd, 1 H, J = 8.7, 5.4, 2.7 Hz), 3.40 (t, 1 H, J = 5.4 Hz,), 3.09 (dd, 1 H, J = 5.4, 2.7 Hz).
      [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amonyum asetatın hazırlanması.
      1. Etil asetat 245 ml asetik asit 0.93 ml içinde çözülür. Bu işaretle "çözümü yakalama."
      2. Etanol içinde 298 ml [(R) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat - benzil- N 3.28 g çözündürülür.
      3. sikloheksadien 14.1 ml ve karbon üzerinde% 10 Paladyum 3.27 g ekleyin.
      4. 12 saat boyunca oda sıcaklığında süspansiyon karıştırılır, ve daha sonra silisli toprak pedinden geçirilerek filtre. tuzaklama solüsyonu doğrudan akıtılarak sıvı dökün.
      5. 35 ° C'nin altında tutularak, indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında çözücüyü buharlaştınn.
      6. tetrahidrofuran ile elde edilen katı toz haline getirin ve beyaz bir katı, 1.72 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.68 (bs, 1 H), 3.99 (ddd, 1 H, J = 5.2, 2.4, 1.2 Hz), 3.32 (t, 1 H, J = 5.2Hz), 2.79 (dd, 1H, J = 5.2, 2.4 Hz), 1.90 (s, 3H).
  3. Hazırlanması undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat
    1. 10 ml'lik bir yuvarlak tabanlı şişe içinde, kuru diklorometan ve 2 ml [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat, 60 mg çözülür.
    2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye soğutulur ve çözelti N 81 ul, N-diizopropiletilamin damla damla ilave edin.
    3. Kuru diklorometan ve 2 ml undek-10-inil 2-oksopiridin-1-karboksilat ihtiva eden ham bir karışım içinde 350 mg çözülür çözeltisine ekleyin ve 15 st için oda sıcaklığında karıştırılmıştır. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar solvent buharlaşır.
    4. Kolon kromatografisiyle (silis jel), otomatik bir kolon kromatografisi cihazı kullanılarak saflaştınlır:
      1. Silis jel üzerine absorbe örnek sikloheksan ile sütun dengeye ve kartuşa örnek yüklemek.
      2. 0 ila 0: 100 ila sikloheksan / etil asetat ile elüte 100 ve test tüpleri üzerinde tepe toplar.
      3. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar bileşiğe tekabül eden fraksiyonların çözücü buharlaştırılmakta ve beyaz bir katı, 40 mg elde edilir.

CC Reaktiflerin 2. Hazırlık

  1. Etiket-azit Moleküllerin 5 mM'lik bir stok çözeltisinin hazırlanması
    1. dimetil sülfoksit, 0.5 ml (DMSO) içinde azid PEG3-Fluor 545 1.5 mg eritin. -20 ° C'de 0.5 ml mikrosantrifüj tüplerine alikotları ve mağaza sağlayın.
    2. DMSO, 0.5 ml azid PEG3-Biotin 1.1 mg çözülür. -20 ° C'de 0.5 ml mikrosantrifüj tüplerine alikotları ve mağaza sağlayın.
  2. Tris, 50 mM stok çözeltisinin hazırlanması (2-karboksietil) fosfin (TCEP)
    1. 1 ml su içinde TCEP 14.3 mg eritin ve taze her zaman bunu yapmak.
  3. CuSO 4 50 mM Çözeltisinin Hazırlanması · 5H 2 O
    1. Cam bir şişe içinde, 12 çözülür1 ml su içinde CuSO 4 · 5H 2 O .48 mg. en fazla bir ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza ediniz.
  4. Tris 83.5 mM stok çözeltisinin hazırlanması: [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)
    1. Cam bir şişe içinde, DMSO 200 ul TBTA 8,85 mg çözülür. en fazla bir ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza ediniz.
  5. (Kullanımdan hemen önce) TbTa hazırlanması 1.7 mM Çalışan Çözüm
    1. Bir cam şişeye 83.5 mM TBTA 20 ul ekle ve DMSO 180 ml seyreltin.
    2. Tert-butanol ve vorteks 800 ul ekleyin.

CFA ile tedavi Sıçanların Pençe Dokusunda 3. NAAA İfade Analizi

NOT: erkek Sprague-Dawley sıçanları, 175-200 g ağırlığında ve hayvanların etik kullanımı için kurallarına uygun olarak tüm işlemleri gerçekleştirmek. Evin 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde havalandırılan kafeslerde sıçan ve onlara yiyecek ve su ücretsiz erişim sağlar. CF protokolü içinBir tedavi, 7 gün CFA uygulamasından sonra Bonezzi ve ark., 29 kullanın hayvanlar tarafından yayınlanan makalesine bakın.

  1. ARN14686 intravenöz olarak uygulanması
    1. araç (% 15 PEG ve% 15 Tween tuzlu su çözeltisi) içinde ARN14686 eritin. Sıçan ağırlığı (doz 3 mg / kg, enjeksiyon hacmi 5 ml / kg) 'e uygun bir çözücü konsantrasyonunun, hesaplayın.
    2. Üç saf üç CFA ile tedavi edilen sıçanlarda IV enjeksiyonu ile devam edin. uygun bir plastik emniyet cihazı, her sıçan yerleştirin. Daha sonra, damar genişlemesini sağlamak için 2-4 dakika için ılık suda sıçan kuyruğu yerleştirin ve kuyruk damarından bileşiği iv enjekte edilir.
    3. Sadece taşıyıcı ile yapılan üç sıçan (naif CFA ile muamele edilmiş), iv enjekte edilir.
  2. Paw Toplama ve Diseksiyon
    1. Sonda veya araç uygulamasından sonra CO 2 inhalasyon 4 saat ile sıçan Kurban ve bir neşter kullanılarak diz eklemi üzerinde onları 0.5 cm keserek onların pençeleri toplamak.
    2. Dikkatle makas destekli diseksiyon ile deri kaldırmak ve kemik onları kazıma yumuşak dokuları teşrih. kemikleri atın ve pençeleri yumuşak dokuları toplamak. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza ek bileşen dondurularak örnekleri.
  3. Pençe Homojenizasyon ve lizozomal protein hazırlanması
    NOT: CC reaksiyonu inhibe gibi, deterjanlar ve amin içeren tamponlar kullanmaktan kaçının.
    1. Fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve bir proteaz inhibitör kokteyli (Malzeme / Reaktif Tablo) 4 ml 320 mM sukroz bunları (bölüm 3.2.1 de tarif edildiği gibi elde edilmiştir) 3 sıçandan pençe doku birleştirin ve homojen; yüksek performanslı dağıtma aracı kullanmak (Malzeme / Reaktif Tablo).
    2. 4 ° C'de 1,000 x g'de 20 dakika boyunca doku Homojenat santrifüje tabi tutulur; süpernatant kaydedin.
    3. Ekle 2 PBS içinde 320 mM sükroz ml doku topağı, proteaz inhibitör kokteyli veBir kez daha homojenleştirin.
    4. 4 ° C'de 1,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ve adım 3.3.2 den birine süpernatant ekleyin.
    5. 4 ° C'de 12,000 x g'de 30 dakika boyunca toplanan yüzey maddeleri santrifüjleyin.
    6. PBS iki hacim pelet ve tekrar süspansiyon tartılır (yani, pelet, her 100 mg, 200 ul). 1.5 ml'lik bir toplama tüpüne transfer edildi ve 1 saat için -80 ° C'de dondurun.
    7. örnekleri çözülme ve -80 ° C'de 1 saat boyunca tekrar dondurma.
    8. dondurma / eritme devri iki kez daha tekrarlayın.
      Not: Bu adım proteinini çözünür hale getirmek üzere tasarlanmıştır. gerektiğinde gece boyunca dondurun.
    9. 4 ° C'de 100,000 x g'de 1 saat boyunca santrifüje. çözünür lizozomal protein içeren süpernatant toplayın ve pelet atın. -80 ° C'de saklayın veya hemen protein ölçümü ile devam edin.
    10. Bir BCA protein tahlili 30 ticari kit kullanılarak protein içeriği ölçmek (bakınız Materyal / Reaktif Tablo
    11. kullanılana kadar -80 ° C'de örnekleri saklayın.
  4. Azid PEG3-biotin ile CC
    NOT: CC ve streptavidin boncuk zenginleştirme (3.4-3.6 adımlar) protokolü hafifçe Speers ve Cravatt 31 tarafından yayınlanan protokolü modifiye edilmiştir.
    1. probe- ve araç ile tedavi edilmiş farelerde (naif CFA ile tedavi edilen sıçan) lızozomal proteinlerinin 500 ul (PBS içinde 1 mg / ml) hazırlayın.
    2. Streptavidin agaroz,% 50 bulamaç 40 ul ön temizlemeden örnekler 4 ° C 'de, 1 saat boyunca (kullanımdan önce 1 ml PBS ile üç kere yıkama). 4 ° C'de 1000 x g'de, 4 dakika için santrifüj ve üstteki sıvı kısmı alınır.
    3. Azid PEG3-biotin ve vorteks bir 5 mM stok 11.3 ul ekle.
    4. taze hazırlanmış TCEP ve vorteks 50 mM stok 11.3 ul ekleyin.
    5. 50 mM CuSO 4 11.3 ul 1.7 mM TBTA yeni hazırlanmış çalışma çözeltisi karışımlar 34 ul 2 O stok.
    6. Bir önceden karıştırılmış TBTA / CuSO 4 · 5H 2 O çözeltisi ve vorteks 45.3 ml ekleyin.
    7. 2 saat boyunca 25 ° C'de reaksiyon inkübe (daha uzun bir enkübasyon süresi, tepkime etkilemez). Bu aşamada protein yağış dikkat edin. inkübasyondan ilk saat sonra karıştırın.
  5. Aşırı CC Reaktiflerin çıkarılması
    1. 4 ° C'de 6500 x g'de, 4 dakika boyunca santrifüj örnekler ve supernatant çıkarın.
    2. sonication (bir sonda sonikatör ile 5 sn) tarafından soğuk metanol ve tekrar süspansiyon 750 ul ekleyin.
    3. 4 ° C'de 6500 x g'de, 4 dakika için numune santrifüj ve bir şırınga ve bir iğne kullanılarak supernatant çıkarın.
    4. (Sonication gerekli değildir) iki kez adımı tekrarlayın 3.5.2.
    5. Son yıkamadan sonra, 5 saniye için, protein pellet ve sonikasyon 3x PBS içinde sodyum dodesil sülfat (SDS),% 2.5 325 ul ekle.
    6. 65 ° C'de 5 dakika boyunca numune ısıtın ve sonikasyonkazanç.
    7. Oda sıcaklığında 6500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ve süpernatantı kaydedin.
    8. % 0.5 SDS seyreltilmesi için PBS 1.4 ml ilave edilir. -20 ° C'de saklayın veya streptavidin zenginleştirme ile devam edin.
  6. streptavidin Zenginleştirme
    1. PBS ile 4.2 ml'ye aşama 3.5.8 'de elde edilen numunelerin hacmi getirmek. bir kesim sonu ucu kullanılarak streptavidin agaroza% 50'lik bir bulamacın 40 ul ekle (kullanımdan önce 1 ml PBS ile üç kere yıkama).
    2. rotasyonlu oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya bırakılır ve daha sonra 1,400 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
    3. Boncuk pelet ve sütun dönmeye ml bir 1 boncuk aktarmak için artık süpernatant kullanmak kurutma olmadan süpernatantı (Malzeme / Reaktif Tablo).
    4. % 1 (PBS içinde), SDS 3x 1 ml (PBS içinde) 6 M üre, 3x 1 ml PBS içinde 4x 1 mL yerçekimi ile yıkayın.
    5. PBS kullanımı 2x 500 ul, oda sıcaklığında 1400 x g'de 2 dakika süre ile 1.5 ml tüp ve santrifüj boncuk aktarmak. Yavaşça bir şırınga ve iğne ile süpernatant aspire.
    6. 95 ° C'de 32, 15 dakika, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yıkama tamponu 25 ul (6 M üre, 2 M tioüre,% 2 SDS, 6 mM biyotin, PBS içinde tümü) eklenerek reçineye bağlı proteinler Zehir.
  7. protein Blot
    1. (: 9 ml 0,5 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 5 ml% 20 SDS, 5 mg Bromofenol mavisi, 3 ml gliserol, ve H2O 9 ml) ekleyin 6x Laemmli tamponu 5 ul ekle kullanımdan hemen önce,% 5 β-mersaptoetanol eklenir. Kısaca bir% 4-12 poliakrilamid jel içine elde edilen süpernatant reçine ve yük 25 ul pelet 2.000 xg'de örnekleri santrifüj.
    2. Imalatçının talimatlarına 33 uygun bir kurutma zar üzerinde jel elektroforezi ve protein transferini gerçekleştirir.
    3. Bir bloke edici tampon, 10 ml 1 saat boyunca kurutma membran Doymuş% 0.1 Tween-20 ihtiva eden (Materyal / Reaktif Tablo).bu arka plan artırabilir olarak, süt kullanmaktan kaçının.
    4. % 0.05 Tween-20, PBS içinde 10 ml zarın yıkanması ve fluoresan streptavidin 10 ul oda sıcaklığında tamponu artı% 0.1 Tween-20 de 1 saat bloke 10 ml (Malzeme / Reaktif tabloya bakınız).
    5. bir kez PBS ile tek başına (10 dk), PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 4 kez yıkayın.
    6. Bir görüntü tarayıcı kullanın (Malzeme / Reaktif Tablo). Enstrüman ve bağlı bilgisayarda açın. hazır olana kadar bekleyin.
    7. satın alma programını başlatın ve floresan modunu seçin. membran alanını seçin ve kaydedilen dosyalar için hedef klasörü seçin.
    8. Aşağıdaki toplama parametreleri ayarlayın: 680 nm uyarma uzunluğu, BPFR700 filtresi, (kanal 2), ve 25 mikron piksel boyutu 1.000 V photomultiplier tüp (PMT) değeri. görüntü kazanır.

Floresan Micros tarafından Fare Akciğerler katalitik olarak aktif NAAA 4. Yerelleştirmekopya

NOT: 8 ila 10 haftalık fareler erkek ve hayvanların etik kullanımı için kurallarına uygun olarak tüm işlemleri gerçekleştirmek. House 12 saat ışık / karanlık döngüsünde havalandırılan kafeslerde fareler ve onlara yiyecek ve su ücretsiz erişim sağlar.

  1. Farelerde ARN14686 intravenöz olarak uygulanması
    1. araca ARN14686 çözülür:% 15 PEG ve% 15 Tween-20 tuzlu su çözeltisi. Fare ağırlığı (doz 3 mg / kg, enjeksiyon hacmi 5 ml / kg) 'e uygun bir çözücü konsantrasyonunun, hesaplayın.
    2. 3 farelerin iv enjeksiyonu ile devam edin. Uygun bir plastik tutma cihazına her fare yerleştirin. Daha sonra, damar genişlemesini sağlar ve kuyruk damarından bileşiği iv enjekte 2-4 dakika için ılık suda fare kuyruğu yerleştirin.
    3. Sadece araç ile 3 fareler iv enjekte edilir.
  2. Akciğer Toplama ve Dilim Hazırlık
    Uyarı: Davlumbaz dikkatle paraformaldehid Kulp, ve eldiven giymek!
    1. chlo ile fareler anesteziral hidrat (/ kg, 400 mg) eklenmiştir. Bir ayak tutam anestezi onaylayın. aşağıdaki gibi bir transcardial perfüzyon gerçekleştirin:
      1. Yüzeysel makasla ventral deri kesme ve torakal ve periton zarı yüzeyleri açığa.
      2. Yüzeysel sadece xiphoid süreci altında, makasla periton membran kesti ve diyafram ve visseral organları maruz kalmaktadır. önemli damarsal lacerate için dikkatli olun.
      3. bir lateral diğerine diyaframın keserek göğüs boşluğu açın.
      4. otomatik bir şırınga pompasına bağlanan 25 G iğne takın ve fosfat tamponu içinde 60 mi% 4 PFA (0.1 M, pH 7.4) ve ardından% 0.9 tuzlu su çözeltisi 20 ml demlenmeye.
    2. perfüzyon tamamlandıktan sonra, forseps kullanarak kalbi çekin ve dikkatlice dışarı incelemek. forseps ile trakea kavrayın ve makas kullanılarak içinden tamamen kesti. Yavaşça yukarıya doğru trakea römorkör ve göğüs kafesine gelen akciğerleri kaldırın. için doku teşrihsoldan sağa akciğer ayırın.
    3. Postfix'i soğuk 2-metilbütan 1 saat dondurularak örnekleri için paraformaldehid% 4 doku ve -80 ° C'de saklayın.
    4. Bir Kriyostat kullanarak 40 mikron bölümleri toplayın slaytlarda hemen takar (bir her beşinci) ve aşağıda ayrıntılı olarak immünohistokimya için onları süreci.
  3. Doku Dilimleri Permeabilization ve Engelleme
    1. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100, PBS ile geçirgenliği.
    2. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) ile bloke eder.
    3. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkayın ve CC ile devam edin.
  4. Doku Dilimleri Azid-PEG3-Fluor 545 CC
    1. 1 ml çözelti için bölüm 2'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır CC reaktifleri karıştırarak bir solüsyon hazırlanır, ekleyin: Azid-PEG3-Fluor 545 (5 mM stok) 2 ul, TCEP 20 ul (taze 50 mM stoc hazırlanank) TbTa içinde 58,8 ul (taze) CuSO 4 · PBS 2 O (50 mM stok) 5H, ve 900 ul 20 ul 1.7 mM çalışma çözeltisi hazırlanır.
    2. bölüm 4.2 göre hazırlanmıştır doku dilimleri, CC karışımı yaklaşık 400 ul ekleyin. CC karışımı seçilen hacmi dilimleri karşılamak için yeterli olduğunu dikkat edin. ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    3. PBS (5 dakika için 1x), soğuk metanol (5 dakika süre ile 1 x), PBS içinde% 1 Tween-20 ve 0.5 mM EDTA (2 dakika için 3 x) içindeki bir çözeltisi ve PBS (5 dakika için 1 x) ile yıkanır.
    4. Hava kuru, DAPI ile antifade mountant bir damla ekleyin (bkz Malzeme / Reaktif Tablosu) kapak fişleri (kabarcık oluşumunu kaçınarak) ile yakın ve cila ile mühür. analize kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
  5. Görüntü edinme
    1. 546 nm ve 450 nm uyarma lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanmak için aşağıdaki (Malzeme / Reaktif Tabloya bakınız)Kullanım kılavuzu.
    2. NA = 1.40 ile 60X objektif lens seçmek göz mercekleri ile slayt önizleme emin ve ilgi alanına odaklanmak için.
    3. Numune ve ekipmanları özelliklerine göre satın alma parametrelerini belirler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ARN14686 NAAA önleyicisi ARN726 skafold göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir C9 doymuş alifatik zincirdir, bir terminal alkin etiketi (Şekil 1) taşıyan ile ikame edilmiştir. alkin etiketi bir flüorofor ya da CC yoluyla biyotin molekülü eklemek için iki aşamalı bir etiketleme prosedürü kullanımını sağlamak amacıyla tanıtıldı. Bu özellik, in vitro ve in vivo olarak NAAA prob için çok yönlü bir araç ARN14686 vermektedir.

Burada, bu molekülün potansiyeli temsil eden ARN14686 iki uygulama göstermektedir. 2 Burada bildirilen deneysel işlemin bir şemadır. Probun iv uygulamasından sonra, iki farklı algılama yöntemleri kullanılabilir: Protein blot aktif NAAA ifade I) analizi ve fluorescenc göre hücreler içinde aktif NAAA ekspresyonu ve lokalizasyon ii) Analize mikroskopi.

Ilk temsilcisi sonuç son zamanlarda bizim gruptaki 29 tarafından yayımlandı. Biz CFA kaynaklı pençe iltihap sıçan modelinde NAAA ifadesini analiz. Prob (3 mg / kg) ya da araç naif CFA ile tedavi edilen sıçanlarda iv enjekte edildi. Sıçanlar 4 saat sonra kurban edilmiştir. CC prob etiketli proteinler üzerine bir biyotin-künyesini zenginleştirilmiş lızozomal özü uygulandı. Biyotinile proteinler yanında olduğumuzu streptavidin boncuk kullanılarak zenginleştirilmiş. Elüsyona tâbi tutulmuş proteinler aktif NAAA seviyeleri belirgin kontrol sıçanlarının kişilerce CFA nisbetle (Şekil 3) ile tedavi edilen farelerin pençe artmıştır gösteren protein blot ile analiz edilmiştir. Protein leke analizi avantajı, jel elektroforezi ile ayrılır prob reaktif proteomu, ayrıntılı bir inceleme mümkün kılmasıdır. Bu yaklaşım aynı zamanda potansiyel prob kapalı hedeflerin açıklanması için izin verir. A no-prob kontrolü al olmalıdıryolları deneysel zemin oluşturmaktadır endojen biotinlenmiş proteinler, dışlamak amacıyla dahil. Şekil 3'te ok ucu da bir yükleme referans kontrol olarak kullanılabilir arka plan proteinleri belirtir.

İkinci bir yayınlanmamış deneyi (Şekil 4) olarak, flüoresan mikroskobu ile ex vivo tespiti için NAAA araştırmak için ARN14686 kullanılır. Biz 3 mg / kg (IV) 'farelere ARN14686 uygulanmış ve 2 saat transcardial perfüzyon ile tedaviden sonra bunları kurban. Akciğerler toplandı, miktarın arkasına ve soğuk 2-metylbutane dondurulmuştur. fluorofor eklenmesi için CC reaksiyon Kriyostat ile toplanan 40 mikron kalınlığında doku dilimleri, doğrudan gerçekleştirildi. floresan mikroskobu ile analiz, alveoler makrofajlar ait dağınık veziküler yapılarda katalitik olarak aktif NAAA varlığını göstermiştir. Bir proteine ​​özgü antikorunun kullanımı, sadece karşılaştırıldığındactive enzim görülmektedir.

Şekil 1

Şekil 1:. ARN14686 sentezi Reaksiyon Şeması undek-10-in-2-ol, katalitik 4-dimetilaminopiridin (DMAP) varlığında, dipiridilkarbonat (DPC) ile aktive edildi karışık karbonat üretilir. Bu karbonat daha sonra. Hedef molekülü ARN14686 elde etmek için amino laktam ile reaksiyona sokuldu bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2:. Mevcut çalışmada gösterilen genel stratejinin Akışı şeması prob hayvanlar (sıçan veya fare) enjekte ve hedef olan ifade, iki farklı deneysel prosedür izlenerek analiz edilirs: i) etiketli proteome ekstrakte edilir ve biyotin CC ilave edilir. streptavidin boncuk ilgili biyotinile edilmiş proteinlerin bir zenginleştirme aşamasından sonra, prob hedef proteini lekesi ile analiz edilir. ii) Doku dilimleri hazırlanır ve bir fluorofor CC tarafından eklenir. Probe hedef yerelleştirme florasan mikroskobu ile analiz edilir. Bu rakam Bonezzi ark adapte edilmiştir. 29 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. CFA ile tedavi edilen farelerin pençelerde NAAA aktivasyon analizi, naiv sıçanlar (sütun 1 ve 2) veya CFA enjekte sıçanlardan streptavidin zenginleştirilmiş proteinler 7 gün enjeksiyonundan sonra protein blot analizi (kuşak 3 ve 4). Sıçanlar, taşıyıcı veya ARN14686 (3 mg / kg) iv enjeksiyonları verilmiştir. blot zarfloresan streptavidin ile problanmıştır. ok NAAA bandını belirtir; Ok başı protein benzer bir miktar her bir şeride yüklendi olduğunu gösteren, yaklaşık 90 kDa'lık bir biyotin içeren bant gösterir. Bu rakam Bonezzi ark modifiye edilmiştir. 29 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Prob etiketli floresan mikroskobu fare akciğerlerinde NAAA taşıt (A), akciğer bölümleri veya azid PEG3-Fluor 545 ile CC sonra ARN14686 enjekte (B) farelerin Örnek resimler bildirilmiştir ex vivo yöntemler. sinyal v tespit edilirken pozitif sinyali (kırmızı hücreleri), ARN14686-enjekte edilmiş farelerde tespit edilmiştirmüsaadelerinin uygulanan fareler. bir azid-PEG3-Fluor 545 pozitif, alveolar makrofaj bir detayı daha yüksek büyütmede C 'de gösterilmiştir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile işaretlenmiştir. Ölçek çubuğu = A 50 mikron ve C 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enzim aktivitesi ince RNA transkripsiyonu, protein sentezi, protein translokasyon, post-translasyonel modifikasyon ve protein-protein etkileşimi dahil olmak üzere farklı seviyelerde düzenlenir. Genellikle, enzim ifadesi tek başına faaliyeti hesaba katmaz. ABPP kendi doğal yapısında proteinlerin aktivitesi çalışma için geliştirilmiştir. İki özellik gereklidir: kovalent olarak ilgi bir enzim ve bir raportör etiketi aktif sitesine bağlanan kimyasal bir sonda prob etiketli enzim tespit etmek.

Prob tasarımı ve sentez prosedürünün kritik noktalardır. probun hedef yeterli afinite ve seçiciliğe sahip olmalıdır. Ayrıca, bir raportör etiketinin bulunması etkileşimini hedef etkilememelidir. Bu sorun büyük ölçüde hedef yakalandı edildikten sonra muhabir etiketi sokulduğu iki adımlı bir ABP, tasarımı ile aşılır. Etiket içermeyen Probes, in vivo çalışmalar için uygun olan, proteinin aktivitesiMinimal harici değişiklik ile canlı bir hücrenin veya organizmanın içinde değerlendirilebilir. NAAA prob ARN14686 yukarıda özetlenen gereklerini yerine getirmek için tasarlanmıştır. Β-laktam reaktif savaş başlığı NAAA önleyicileri 16,26 arasında β-Laktam sınıfından elde edilen önceki sonuçlar göre seçildi. Bu bileşikler kovalent olarak enzimin katalitik sistein bağlanarak güçlü ve seçici bir şekilde NAAA inhibe eder. Ayrıca, bileşikler, 16, sistematik olarak aktif olduğu gösterilmiştir. Biz uzun alifatik zincirler dikkate NAAA artan afinite alarak, bir C9 doymuş alifatik zinciri tanıttı. Bir terminal alkin, iki adımlı etiketlemesi için izin vermek için ilave edildi.

Bir diğer önemli bir adım doz ve in vivo uygulama için bir zaman seçmektir. Bu plazma içinde prob, hedef afinite ve seçiciliğe stabilitesine bağlıdır. Doğru doz po nişan kaçınarak hedef yakalama sağlamak için seçilmiş olması gerekirssible dışı hedefler. Biz / kg ARN14686 iv 3 mg seçici naaa yakalamak için en uygun olduğunu ortaya koymuştur. Daha yüksek dozlar homolog sistein amidaz, asit seramıdaz yakalama sonuçlandı. Tedavi süresi ile ilgili olarak, zaman akciğer gibi, kısa bir süre (2 saat) bir hedef ile tepkimeye prob imkan vermek için yeterli olabilir, iyi perfüze organların analizi. pençeleri için, ancak, biz tepkime süresini iki katına zorunda kaldılar.

Protein blot ile hedef analizinde olası bir sorun, doğal biyotinile proteinlerin varlığına bağlıdır. Bunlar kaçınılmaz spesifik prob hedefleri ile birlikte tespit edilecektir. Biz CC yapmadan önce streptavidin boncuk ile preclearing adım tanıtan büyük ölçüde bizim sonuçlarımızın kalitesini artırdığını buldular. Diğer taraftan, yerel biyotinlenmiş proteinlerin varlığı mümkündür yükleme eserler kontrol etmek için kullanılabilir. Son olarak, flüoresan mikroskobu ile lokalizasyon çalışmaları ile ilgili olarak, p haberdar olmak çok önemlidirProtein blotlar aksine, floresan mikroskopi dışı hedeflerden hedef ayrımı izin vermez, çünkü seçiciliği elbise. Ön seçicilik çalışmaları fizibilitesini değerlendirmek için ve optimal deneysel koşullar kurmak için yapılmalıdır.

tanımlanan teknik sınırlamaları esas olarak deterjan ve amin içeren tamponlar kullanımı gibi CC reaksiyonu etkileyen deneysel koşullar, önlenmesi gerekliliği ile ilgilidir. Bu özellikler, bir hücre lizatı veya bir doku Homojenat hazırlarken hesap alınmalıdır. Protein içeriği en az 250 ug değilken bu işlem uygulanabilir çünkü Ayrıca, bir streptavidin zenginleştirme aşaması gerekli olduğunda, başlangıç ​​malzemesi miktarı, başka bir sorun teşkil etmektedir. Bu limit nedeniyle böyle çalışma CC-kaynaklı yağış sonrası hacimleri, protein kurtarma, ve kullanılacak streptavidin reçine miktarı gibi teknik konular, ayarlanır.

previouslY, NAAA aktivitesi, sadece enzim in vitro aktivasyonu ve alt-tabaka çözündürme 14 için bir etkinleştirme tamponu kullanılmasını gerektirir aktivitesi deneyleri, gerçekleştirerek değerlendirilebilir. Bu yaklaşım aktif değil NAAA varlığı hakkında, toplam NAAA ifade hakkında bilgi sağlar. Başka bir olasılık PEA ve OEA doku düzeylerini ölçmek için, ancak bu yöntem NAAA aktivitesini 34,35 değerlendirmek için sadece dolaylı bir şekilde temsil eder. Buna ek olarak, FAE seviyeleri, biyosentezi gibi başka faktörlerden etkilenebilir. Kimyasal prob ARN14686 NAAA ilk ABP olup. Burada açıklanan protokol, in vitro ve in vivo olarak, yakalama ve NAAA aktif formunu gösteren basit bir prosedürü gösterir. Tüm örnek manipülasyonlar böylece enzim in vivo durumu hakkında güvenilir bilgi veren, prob hedef reaksiyonlar sonra vardır. Ayrıca, floresan mikroskopi ARN14686 kullanımı benzersiz bir araç t temsilo aktif naaa lokalize. NAAA katalitik alt birimi tanıyan mevcut antikorlar, NAAA tam uzunlukta proenzim ve aktif enzim arasında ayrım yoktur.

Burada tarif edilen protokol başlayarak NAAA sentezleme ve etkinleştirme farklı hücre hatları ve enflamasyon hayvan modellerinde incelenebilir. Eş-lokalizasyon çalışmaları daha fizyolojik ve patolojik koşullarda NAAA rolünü tanımlamak için gerçekleştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2 Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics