La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica

Immunology and Infection

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Summary

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

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Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

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Abstract

Introduction

El objetivo general de este método consiste en evaluar y cuantificar la fagocitosis microglial vivo con precisión. La microglía son los macrófagos residentes tejido del sistema nervioso central (SNC). Se realizan una variedad de funciones para asegurar el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Estos incluyen la vigilancia inmunológica, la secreción de factores neurotróficos y, de importancia fundamental, la fagocitosis 1. Fagocitosis microglial es clave en varios eventos importantes durante el desarrollo del cerebro y la retina, tales como fagocitosis de las sinapsis irrelevantes (poda sináptica) y la eliminación de las neuronas apoptóticas 2-4. Además, la fagocitosis microglial de las neuronas dañadas o apoptóticos, restos celulares, y los microbios invasores se ha demostrado ser esencial para el mantenimiento de la homeostasis del SNC a través de la edad adulta 5. Por último, la fagocitosis microglial ha sido implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y relacionados con la edaddegeneración macular, donde se ha sugerido que la capacidad de fagocitosis defectuosa o insuficiente puede contribuir a la acumulación de amiloide-beta placas (Aß) y drusas, respectivamente 6,7.

función Microglial está estrechamente regulada por su microentorno, en particular por factores solubles, tales como el factor de crecimiento del tumor interacciones célula-célula o β. Las neuronas expresan constitutivamente varios ligandos de la superficie celular, tales como CD200 y CX3CL1, mientras microglia exclusivamente expresan los respectivos receptores CD200R y CX3CR1. Estos receptores contienen inmunorreceptoras motivos de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su porción intracelular. Estos inhibidor de los receptores son críticas para la prevención de la estimulación más de microglia, que puede contribuir a la neuroinflamación. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas normales, las interacciones célula-célula entre las neuronas y la microglia mantienen microglia en un estado de reposo. Durante la lesión tisular, sin embargo, las neuronas pueden regular a la baja expresión de estos ligandos, la eliminación de su efecto inhibidor sobre la activación de la microglia. Función microglial (incluyendo la fagocitosis) está por lo tanto estrechamente vinculada a su microambiente 8. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ensayos estandarizados para estudiar la fagocitosis microglia en un contexto fisiológico o de una manera que se replica completamente su microambiente del SNC.

Varios ensayos han sido desarrollados para medir la actividad fagocítica de microglia in vitro, donde microglia primarias o líneas de células de microglia se cultivan con las células diana (por ejemplo, neuronas apoptóticas) o perlas marcadas fluorescentemente. Captación objetivo es evaluada mediante microscopía de imágenes fluorescentes o citometría de flujo 9-12. Estos ensayos permiten realizar pruebas de cómo la manipulación farmacológica o genética puede afectar a la fagocitosis microglial y, mientras informativa, no logran replicar completamente el complejo entorno en vivo. Los métodos indirectos para el examen de la fagocitosis microglialin vivo se han reportado: estos se llevan a cabo por tinción de las moléculas se cree que participan en la fagocitosis (por ejemplo, CD68), la evaluación de la proximidad física de la microglía y los objetivos para la fagocitosis (por ejemplo, neuronas comprometidas o elementos sinápticas), o por detección inmunohistoquímica de fagocítica los objetivos dentro de las células microgliales (por ejemplo, Aß) 13-17. Dos estudios han utilizado métodos más directos para evaluar la fagocitosis microglia in vivo. Hughes y sus colegas han utilizado técnicas de imagen para determinar el consumo de microglial de cuentas entregadas por vía intracraneal 18. Sierra et al. Desarrolló un método perfeccionado para evaluar cuantitativamente la fagocitosis de las células apoptóticas microglia utilizando técnicas de imagen complejas 4. Sin embargo, estos métodos implican protocolos complicados para la preparación del tejido, seccionamiento, proyección de imagen, y el análisis. Hemos utilizado anteriormente análisis de citometría de flujo para evaluar la fagocitosis de los fotorreceptores a caboer segmentos de células de la retina epitelio pigmentario (RPE) en cultivo 19. A continuación, se describe un protocolo para evaluar rápidamente la captación de partículas marcadas con fluorescencia por la microglía de la retina como una medida cuantitativa de la fagocitosis in vivo microglia.

El protocolo se describe aquí permite una medición fiable y cuantitativa de la fagocitosis microglial de la retina en poco menos de seis horas en tres pasos fundamentales: (1) la entrega intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia, (2) la cosecha y preparación de tejido de la retina, y (3) el flujo de análisis de citometría. El método que hemos desarrollado es un método robusto para evaluar la fagocitosis microglial en la retina, y puede ser utilizado con éxito para probar cómo varios compuestos o manipulación genética alteran esta función microglial clave en la configuración fisiológicas. Como un área especializada del sistema nervioso central, la retina es un modelo de sistema de fácil acceso para estudiar la función de la microglia 20. Si bien este método fue desarrollado en tque ojo, creemos que puede ser útil para todos los neurólogos que investigan la función microglía fagocítica.

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Protocol

Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps.

1. Preparación de Materiales para Inyección

  1. Esterilizar una aguja de 33 G y jeringa: desmontar y autoclave a 115 ο C. Preparar las agujas para la inyección por el aumento en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  2. Descongelar las partículas marcadas con fluorescencia a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a. Preparar la solución de partículas para la inyección mediante la reconstitución de una solución de 50 mg / ml en PBS estéril con Ca 2 + / Mg2 +.
    NOTA: partículas marcadas-AF488 de origen fúngico que han sido validados por ensayos de fagocitosis se utilizan en este protocolo 21-23. Para la absorción óptima, preparar partículas fresco e inmediatamente antes de la inyección.
    Nota 2: Partículas concentraciones pueden ser optimizados para cada experimento específico.

2. intravítrea La inyección de solución de bolas

NOTA: Dos pas personas se requieren para llevar a cabo la inyección, de tal manera que la persona que realiza la inyección puede contener el ratón y mantener el foco en el globo del ojo, mientras que la otra persona pasa la jeringa cargada y empuja el émbolo.

  1. Anestesiar el roedor por inyección intraperitoneal de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina en una dosis de 20 l / 10 g de peso corporal. Antes de la inyección, utilice pizca dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia.
    NOTA: El isoflurano tiene un profundo efecto en la función de las células mieloides, por lo tanto, su uso a lo largo de este ensayo debe evitarse 24,25.
  2. la aguja de carga con una solución de partículas 0,5 l de marcado con fluorescencia.
  3. Coloque el ratón hacia los lados bajo un microscopio quirúrgico (Figura 1A-B). Use un material blando, por ejemplo, un paquete de gel, para un mejor posicionamiento del ratón. Para los ratones jóvenes en la que los ojos no están abiertos, suavemente abrir los párpados con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo, creando un fissuvolver a lo largo de la ranura de la cual los párpados con el tiempo se abre.
    1. Con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo aplicar cuidadosamente la presión alrededor de los párpados, por lo que el globo ocular aparece un poco fuera de la cavidad. Mantenga la cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados para mantener el ojo un poco fuera de la cavidad. Tenga cuidado de no comprender demasiado cerca de la garganta (Figura 1B).
  4. Para perforar el globo ocular, insertar la aguja de la jeringa en el limbo corneal (donde la córnea y la esclerótica Connect). Esto es visible como un círculo gris en ratones pigmentados. Retraer la aguja ligeramente para expulsar un pequeño volumen de fluido vítreo y luego inyectar. La persona que realiza la inyección debe coloque un lado del ratón con una mano y la aguja con la otra; la segunda persona debe empujar lentamente el émbolo.
  5. Retraer la jeringa lentamente. Aplicar gotas para los ojos hidratante para mantener el ojo hidratado. </ Li>
  6. Deje que el roedor se recuperan en una jaula sobre una almohadilla de calor y continuar siguiendo al animal. Si se trabaja con cachorros, no devolver el animal a una jaula con otros animales de alerta hasta que está respirando y capaces de movimiento espontáneo. Si se trabaja con los adultos, no regrese al roedor a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera la posición decúbito esternal.

3. La recolección de tejido de la retina

NOTA: tejido de la retina de los ojos no inyectados con partículas marcadas con fluorescencia se debe recoger como un control para el análisis de citometría de flujo. Aunque el ensayo se puede realizar utilizando una única retina, para un mejor rendimiento, dos retinas, se mezclarán juntos.

  1. Recoger la retina del tejido 3 horas después de la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia.
    NOTA: Mientras que el tiempo después de la inyección de la solución de partículas se puede optimizar para cada experimento específico, se encontró que 3 h después de la inyección, la captación de partículas podría ser visto a lo largo de la mayoría de las capas of la retina (Figura 1C-D).
  2. Sacrificio ratones por dislocación cervical.
  3. Recoge los globos oculares presionando suavemente contra el párpado con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo para proptose el globo ocular. Coloque la pinza detrás del globo ocular y de tracción.
  4. Diseccionar la retina bajo un microscopio de disección. Transferir el globo ocular a una placa de Petri que contiene una pequeña cantidad de PBS con Ca2 + / Mg2 +. En una zona seca de la placa de Petri, perforar el globo ocular en el limbo corneal con la punta del fórceps superfinas.
  5. Mantenga el globo ocular con la ayuda de finos 45 o fórceps en ángulo y el uso de tijeras de primavera para cortar alrededor del limbo corneal, hasta que se corta aproximadamente la mitad de la circunferencia del limbo corneal.
  6. Mantenga el globo ocular con los finos 45 o fórceps en ángulo y llevar el globo ocular en PBS. Con un segundo par de finas 45 o fórceps en ángulo rasgar la córnea y la esclerótica de diferencia. La lente y la retina va a salir intact.
  7. Separar la lente y la retina. Recoger la retina y transferir a un tubo de ensayo 5,4 ml de poliestireno que contiene 2 ml de PBS con Ca2 + / Mg2 +.

4. Preparación de una suspensión de células individuales

  1. Preparar suspensiones de células individuales utilizando un kit de disociación de tejido neuronal con modificaciones menores a las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, las retinas de triturado en la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 y realizar una digestión enzimática a 37 ° C sin agitación.

5. Tinción de suspensiones de células individuales para el análisis de citometría de flujo

  1. Resuspender las células en 200 l de tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con albúmina de suero bovino 0,2% (BSA) y azida sódica al 0,09%) y la transferencia a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Centrifugar durante 5 min a 130 x g.
    NOTA: La azida sódica es nociva para el ser humano y el medio ambiente. Utilice equipo de protección personal unand desechar los residuos de acuerdo con las regulaciones locales.
  2. Invierta la placa sobre un fregadero para eliminar el sobrenadante. Para bloquear los receptores de Fc, Resuspender las células en 25 l de tampón de tinción que contiene 5 mg / ml de anticuerpo anti-ratón CD16 / CD32 por pocillo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Añadir 25 l de tampón de tinción que contiene 0,5 mg / ml de anti-ratón de Ly6C-APC-Cy7, 0,5 mg / ml de anti-ratón Ly6G-Pe-Cy7 y 2,5 g / ml de anti-ratón CD11b-AF650. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  4. Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Invertir la placa para eliminar el sobrenadante. Lavar volviendo a suspender las células en 200 l de tampón de tinción.
  5. Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Resuspender en 200 l de tampón de tinción que contiene 0,5 g / ml de yoduro de propidio (PI). Transferir a tubos de microtitulación de 1,2 ml.
  6. Lavar los pocillos con un 100 l adicionales de tampón de tinción que contiene 0,5 g / ml de PI y la piscina con los 200 l anteriores en el1,2 ml tubos de microtitulación. Se obtiene un volumen total de 300 l de células teñidas.

6. Análisis de citometría de flujo

  1. El uso de un láser convencional de tres (violeta, azul, y el láser rojo), evitar el PE, PerCP-Cy5.5, BV510 y colorantes PI debido a la notable desvío de los extremadamente brillantes AF488-partículas fluorescentes. Utilice cuarto láser (amarillo) para optimizar este ensayo, ya que permite a los anticuerpos marcado con PE y PI (en el canal mCherry en lugar del canal de PerCP-Cy5.5) que se utilizará (Figura 2).
    NOTA: Si un láser de color amarillo no está disponible, utilice un tinte de exclusión de células muertas en otro canal.
  2. Puerta de PI células negativas (PI) para excluir las células muertas (Figura 2B).
  3. Después de excluir las células muertas, puerta de células positivas CD11b (CD11b +), esto incluirá todas las células mieloides (Figura 2C).
  4. Dentro de la población CD11b +, puerta de Ly6C - / Ly6G - para excluirneutrófilos (CD11b + / + Ly6G) y monocitos (CD11b + / + Ly6C; Figura 2D). Después se active en la microglía (aquí definida como CD11b + / Ly6C - / Ly6G - por simplicidad), dos poblaciones claras deben ser visibles; uno negativo y uno positivo para las partículas marcadas con fluorescencia. Las células fagocíticas se han tomado las partículas y por lo tanto son AF488 + (Figura 2E).
    NOTA: Ly6c positivo o Ly6G poblaciones positivas también puede ser analizado para medir la absorción de partículas usando este enfoque de tinción. El porcentaje de células fagocíticas CD11b + se correlaciona bien con el porcentaje de microglia fagocítica (Figura 2F). Para los investigadores sin experiencia citometría de flujo, un análisis más simple con CD11b tinción solo puede llevarse a cabo, aunque esto incluirá los neutrófilos y monocitos fagocíticas, así como microglia. Dentro de este CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> población, estas células son> 99% microglia, a juzgar por la tinción con los marcadores de F4 / 80 y CX3CR1; estos marcadores se pueden añadir, pero no son necesarios en nuestras manos.

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Representative Results

Aquí se describe un método para cuantificar rápidamente y de manera fiable el número de microglia retina fagocíticas en un entorno fisiológico utilizando el análisis de citometría de flujo (Figura 2). Este método puede adaptarse para probar el efecto de compuestos y / o la manipulación genética de la capacidad fagocítica de microglia (Figuras 3A, 3B). También se puede utilizar en los jóvenes (10 - 20 días postnatal) o ratones adultos (Figura 3C). dosis variables de lipopolisacárido (LPS) se administraron por vía intraperitoneal. 24 horas después de la exposición a LPS, se utilizó el protocolo descrito aquí para evaluar la función fagocítica microglia de la retina (Figura 3A). Una dosis de 1,42 mg / kg de LPS indujo un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de microglia fagocítica en comparación con el control del vehículo (Figura 3B), como era de esperar 26.


Figura 1: Configuración de la inyección intravítrea y Representante sección de retina mostrando partículas marcados con fluorescencia en capas de la retina. (A) un paquete de gel se coloca bajo el microscopio de disección. (B) un roedor se lleva a cabo como se muestra en la posición del ojo para la inyección intravítrea. (C) Tres horas después de la inyección partículas marcadas con fluorescencia se pueden ver capas en la mayor parte de la retina. (D , los ratones e) CX3CR1 GFP / GFP y partículas marcadas con un fluorocromo rojo se utilizan para visualizar captación de partículas por la microglía. Microglia en el más profundo (D) y las capas superficiales (E) ocupan partículas. - Las barras de escala. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Estrategia de apertura de puerta a Seleccione fagocítica microglía (A) se analizan las células individuales suspensiones de tejido de la retina de un ratón p10 (B) Después de excluir las células muertas (PI +), se seleccionan (C) células CD11b + (D)... seleccionar sólo para microglia, se excluyen CD11b + neutrófilos (Ly6G +) y monocitos (Ly6C +). (e) microglia fagocítica habrá tomado las partículas marcadas con fluorescencia. (F) El número de fagocíticas células CD11b + es similar a la de microglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, agrupados de tres experimentos independientes; barras de error representan la media ± SEM.rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Microglía fagocítica función puede evaluarse después de LPS desafío y en las crías y ratones adultos (A) ratones jóvenes (p10) fueron desafiados con LPS intraperitoneal en dosis variables, 24 horas antes de evaluar la fagocitosis (B) Desafío con 1,42 mg /. kg resultó en un aumento significativo del porcentaje de microglia retinal fagocítica en comparación con los controles del vehículo (p = 0,0021). (C) Este protocolo se puede utilizar para medir la retina función fagocítica en ratones microglial de las crías y adultos por igual. Hay un porcentaje significativamente menor de la microglía fagocítica en ratones adultos en comparación con ratones jóvenes (p10) (p = 0,019) no estimulados con LPS. n = 9 -12, agrupados de tres a cuatroexperimento independiente; barras de error representan la media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay tres pasos críticos en este método: (1) la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia; (2) la recolección y preparación de tejido de la retina; y (3) análisis citométrico de flujo. Recomendamos que los investigadores practican inyecciones intravítreas antes de realizar el método que aquí presentamos. Ratones albinos (por ejemplo, BALB / c) y una solución de color (por ejemplo, partículas marcadas con fluorescencia) pueden ser utilizados para una fácil visualización de la aguja y la solución inyectada. inyecciones intravítreas son difíciles y si no se realiza correctamente dará lugar a resultados sesgados y variables. Los problemas comunes asociados con la mala técnica de inyección son la perforación de la lente y / o daños a la retina, que puede resultar en hemorragia y la inflamación. Para reducir al mínimo el riesgo de traumatismo en el ojo, el roedor debe estar en una posición estable con el movimiento mínimo de la cabeza. Para penetrar en el globo ocular, la jeringa debe insertarse lentamente y no empujado demasiado para evitar golpearla lente. Otra complicación común es el reflujo del material inyectado fuera del ojo. Para evitar esto, el émbolo debe ser presionado lentamente y, después de la inyección, el globo ocular se debe permitir que retraerse en la cuenca del ojo y la jeringa se debe retraer lentamente. Los mejores inyecciones intravítreas activan microglia en niveles bajos, pero claras diferencias entre los grupos no tratados y tratados se pueden medir. Es esencial que los controles apropiados (por ejemplo, ratones no retado) se utilizan en cada experimento para establecer los niveles de línea de base fagocíticas. Otro aspecto de este método que requiere la práctica es la disección de la retina. Para asegurar las preparaciones de células individuales comparables entre muestras, tejido de la retina se debe recoger con rapidez y con una interrupción mínima del tejido posible. Realización de los últimos pasos de la disección en PBS (ver 3.4 hasta 3.7) facilitará la recogida. Por último, es importante preparar el tejido de la retina para citometría de flujo correctamente. microglia activada regular al alza Fcreceptores y de este modo la unión no específica a la porción Fc de anticuerpos pueden producirse 7. Un bloque de Fc se debe realizar para prevenir la tinción inespecífica. Selección de fluoróforos y compensación establecido apropiados también es importante 27.

Como rutina usamos ratones de 10 a 20 días después del parto para estos experimentos. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para evaluar la función fagocítica microglial en ratones adultos (Figura 3C). Es de destacar que, debido a la presencia de la vasculatura hyaloid, las poblaciones de células mieloides exógenas (Ly6C + o Ly6G +) son más prominentes en ratones jóvenes (de aproximadamente 40 - 50% de todas las células CD11b +) que en adultos (aproximadamente el 5% de todos CD11b + células). Los investigadores deben determinar la edad más apropiada para sus experimentos. El protocolo que aquí se presenta permite la detección robusta de los niveles de microglia fagocítica en la retina. Sin embargo, se recomienda que tres y cincuenta y siete biológicaal replica ser utilizado en cada experimento y se llevan a cabo que al menos tres experimentos independientes. Mientras que las partículas utilizadas en este protocolo han sido validados para ensayos de fagocitosis 21-23, si se requiere una validación adicional, inmunohistoquímico co-localización de las partículas con marcadores específicos fagocíticas se pudo realizar.

Una posible limitación de este método es el acceso diferencial de la microglía a las partículas. En la retina normal, microglia residen en dos capas, la capa plexiforme externa más profundo, y la capa plexiforme interna más superficial, que está más cerca del vítreo 7. Tras la estimulación, o durante el envejecimiento, microglia pueden migrar a lo largo de todas las capas de la retina. En este método, las partículas marcadas con fluorescencia se inyectan en el vítreo. Tres horas después de la inyección esto resulta en la acumulación de partículas en toda la retina y en particular a lo largo de la superficie vítrea. Los investigadores pueden optimizar aún más los concentratide partículas o de tiempo después de la inyección para sus experimentos. Es probable que la microglia en una proximidad más cercana al vítreo tendrán un acceso más fácil a las partículas. Sin embargo, se muestra que las partículas se extienden a través de la retina y son tomados por microglia en todas las capas, pero no en células de la retina epitelio pigmentado (RPE), probablemente debido al acceso limitado del talón (Figura 1C-E). Todavía tenemos que determinar si la microglia subretiniano (que puede acumularse con la edad) tendría acceso a las partículas. Si esto es importante para el investigador, este protocolo se puede realizar después de la inyección subretinal cuidado de las partículas. Otra consideración importante es que puede ser inherentemente diferentes comportamientos entre microglia retina y microglia en otras regiones del SNC. Es bien sabido que las regiones específicas del cerebro tienen diferentes susceptibilidades a la enfermedad. Por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson, las neuronas de la sustancia negra son en su mayoría afectados, mientras que en Alzenfermedad de Heimer, las neuronas del hipocampo se ven afectados en su mayoría 28. Por lo tanto, en el estudio de la patología de una enfermedad específica, la región del cerebro es probable que sea un factor importante. Un protocolo similar al que se describe aquí se puede realizar después de la inyección intracraneal para explorar las diferencias potenciales en la respuesta fagocítica entre microglia de la retina y el cerebro. La retina tiene muchas características comunes con otras regiones del cerebro, incluyendo la presencia de una sangre-retina-20 de barrera. Microglia retina y la microglía del cerebro se originan a partir de los mismos progenitores saco vitelino y parecen muy similares en cuanto a morfología y la superficie celular expresión de marcadores 7,29. Por otra parte, varias enfermedades cerebrales (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, derrame cerebral y la esclerosis múltiple) tienen manifestaciones oculares, lo que indica que la retina es también afectó a 20. Mientras que los investigadores deben ser conscientes de las posibles diferencias regionales, creemos que este es un modelo informativo paratodas las investigaciones microglía, y sugieren que todos los neurocientíficos que estudian la fagocitosis microglial podrían utilizar este protocolo.

Una clara ventaja de realizar este ensayo en el ojo es que múltiples se han desarrollado técnicas para inducir diversas tensiones neurogénicos en la retina, y las respuestas de estrés se puede controlar en vivo y cuantificado usando protocolos estandarizados 30. Mediante la inducción de estrés neurogénica y luego realizar el ensayo descrito aquí, los investigadores pueden analizar la función de microglia en un amplio espectro de insultos que varían en severidad. Por último, cuando se combina con técnicas de citometría de flujo de clasificación, este protocolo tiene la ventaja sobre la inmunohistoquímica que puede permitir una análisis en profundidad de la microglía fagocítica (por ejemplo, qPCR, cultivo celular, proteómica).

La captación de partículas se ha utilizado anteriormente para medir fagocítica función, tanto en sistemas in vitro e in vivo. el lAtter implicado la inyección intracraneal de partículas, la cosecha y la congelación de tejido cerebral, cryosectioning, inmunotinción, las imágenes y el análisis posterior a la proyección de imagen 18. El protocolo que aquí se presenta permite la cuantificación mucho más rápido de la función fagocítica microglia retina. Tiene la ventaja sobre los sistemas in vitro que la microglia altamente sensibles no se quitan de su microambiente, lo que permite la evaluación de la función fagocítica en un contexto fisiológico. En concreto, se debería permitir a la prueba de cómo los defectos en otros tipos de células (por ejemplo, la ablación genética de los genes en las neuronas) afectan a la función fagocítica microglia. También tiene la ventaja sobre anteriores ensayos in vivo que utiliza citometría de flujo, lo que permite una detección rápida, cuantitativa y precisa de las poblaciones de células fagocíticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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