تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

في العقود الأخيرة، أحدثت ثورة في تقنيات التصوير الطريقة التي الأطباء في تشخيص ومراقبة المرض. هذه تقنيات التصوير، ومع ذلك، كانت محدودة إلى حد كبير لنظم التصوير الجسم كله، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)، واحد الفوتون الانبعاثات التصوير المقطعي (SPECT)، التصوير المقطعي (CT)، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وقد تم إيلاء اهتمام خاص للسرطان، واختراقات التصوير التكنولوجية قد تحسنت بشكل كبير الطريقة أن هذا المرض يتم تشخيص وعلاج. وعلى الرغم من هذا التقدم، هناك مكان واحد حيث هذه التقنيات التصوير فقط لا تناسب: غرفة العمليات. بينما تقنيات تصوير الجسم كله يمكن أن تساعد في تخطيط العمليات الجراحية، أنهم يفتقرون عادة قرارات مكانية عالية بما فيه الكفاية لمساعدة الأطباء على تحديد في الوقت الحقيقي عما إذا كانت جميع أنسجة الورم تمت إزالته أو أنسجة الورم المتبقية لا تزال مخبأة على هامش الجراحية 1. التأكد من أن أي إختراقيوتترك هوامش ورم خلف هو واحد من الأهداف الجراحية الأكثر أهمية، ويجب أن الجراحين يسيرون على حبل محكم بين استئصال الأنسجة صرامة وحذرا. إذا تمت إزالة أكثر من اللازم، وتتفاقم الآثار الجانبية غير المرغوب فيها بالنسبة للمريض. إذا القليل جدا هو إزالتها، وزادت معدلات تكرار 3. لذلك، من الأهمية بمكان لتحديد هوامش ورم دقيقة، ونحن نعتقد أن التصوير أثناء العملية chemiluminescent يمكن أن تساعد على تحسين دقة تحديد هوامش الورم من خلال مساعدة الجراحين على تصور الأنسجة الخبيثة التي يمكن أن تبقى على خلاف ذلك لم يتم كشفها مع التقنيات المعمول بها.

هناك العديد من تقنيات التصوير يجري التحقيق حاليا لفائدة ممكنة من حيث نظم التصوير أثناء العملية. وتشمل هذه بيتا وانبعاث γ والاشعاعات وتحقيقات مضان بصري رامان الطيفي 6 و 7 و Cherenkov التلألؤ 8 و 9. حتى الآن، ومع ذلك، فقد أصبح إنشاء أيا من هذه كأدوات السريرية القياسية. التصوير مضان البصرية وقد ثبت حتى الآن أن تكون واعدة أكثر من هذه التقنيات، وبالتالي هو الأكثر استكشافها. في حين سبق أن ثبت أن تكون أداة قيمة للعديد من التطبيقات، فإنه لا يخلو من حدودها. في الواقع، العيب الرئيسي هو مضان الخلفية التي تولدها الأنسجة البيولوجية autofluorescent بطبيعتها. هذه إشارة الخلفية autofluorescent هي نتاج استثارة الأنسجة المحيطة بها، بالإضافة إلى fluorophore، من مصدر الضوء الخارجي اللازم لتوليد إشارة الفلورسنت. من منظور عملي، وهذا يمكن تألق ذاتي يحتمل أن يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والتي يمكن أن تحد من جدوى هذه التقنية في غرفة العمليات.

مدير المدرسةميزة التصوير التوهج على التصوير مضان هو أنه لا يوجد ضوء الإثارة ضروري. ونتيجة لذلك، ليس هناك تألق ذاتي الخلفية. في التصوير التوهج، وبدلا من ذلك إنشاء طاقة الإثارة كيميائيا. وتنتج هذه العملية أي إشارة الخلفية غير مقصودة، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع نسب الإشارة إلى الضوضاء. وهذا يمكن أن يؤدي في نهاية المطاف إلى الكشف عن أكثر دقة ودقة من هوامش الجراحية. إلى حد ما يثير الدهشة، ظلت جدوى هذا النهج باعتباره تقنية التصوير أثناء العملية غير مستكشفة 10. في الواقع، وأقرب مثال لهذه التقنية هو أكسدة مينول التي كتبها الميلوبيروكسيديز في الفئران 11 و 12 و 13. لذا التصوير الطبي الحيوي Chemiluminescent هي منطقة غير مستكشفة بدلا من الأبحاث التي يمكن أن تقدم المزايا التالية: (1) تألق ذاتي الحد الأدنى مما أدى إلى إشارة خلفية منخفضة مع مرحباgher نسب الإشارة إلى الضوضاء. (2) موجات الانضباطي من انبعاثات chemiluminescent تتراوح ما بين مرئية للبالقرب من الأشعة تحت الحمراء. و (3) مجمعات chemiluminescent functionalizable أنه عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات رابط والجزيئات الحيوية الموجودة بالفعل المستهدفة، وتوفير الوصول إلى مكتبات كاملة من تحقيقات التصوير الجزيئي المستهدفة 14.

وتوضح هذه الدراسة إثبات صحة مبدأ الفائدة المحتملة من التصوير chemiluminescent في الإعداد الطب الحيوي باستخدام عامل التصوير القائم على الروثينيوم. خصائص chemiluminescent من هذا المركب ومدروسة، مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى منتصف 1960s 15. عند التنشيط الكيميائي، وكيل وتنتج الضوء في حوالي 600 نانومتر 16، والتي هي مناسبة تماما لأغراض التصوير الطبي. يتم توفير طاقة التنشيط خلال تفاعل الأكسدة التي تؤدي إلى متحمس للدولة التي لديها حياة 650 نانو ثانية في الماء 17 -follالمستحقة على جيل من الفوتونات على تخفيف هذه الحالة المثارة. من خلال استخدام البخاخات عن بعد مصممة خصيصا لهذا الغرض، وكنا قادرين على اكتشاف مركب على حد سواء خارج الحي وفي الجسم الحي. نتائج التجارب الأولية واعدة جدا، مما يشير إلى مزيد من التحقيق في هذه التكنولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: كل من التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها أجريت وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للمركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان (MSK) رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. بناء جهاز Nebulizing

  1. إرفاق الخشب الجزء ألف (12.5 × 2.5 × 1.8 سم 3) منتصبا في وسط الجزء باء (12.7 X 10.7 × 1.8 سم 3) باستخدام اثنين من البراغي (4 × 25 ملم 2). إرفاق الخشب الجزء جيم (11 × 2.5 × 1.8 سم 3) إلى منتصف الجزء ألف (12.5 × 2.5 × 1.8 سم 3) باستخدام برغي واحد، مثل ذلك الجزء C (11 × 2.5 × 1.8 سم 3) لا يزال من الممكن نقلها. انظر الشكل 1.
  2. حفر اثنين من الثقوب من خلال طرف السفلي من الزناد زجاجة رذاذ من البلاستيك 3 أوقية بخاخ صغير (D)، ودفع قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ (10 سم من 1/16 "الصلب) (E) من خلال تشكيل اثنين من الحلقات، واحد على كل جانب من الزناد. التفاف الجزء السفلي من زجاجة رذاذ مع شريط لاصق (F) لمنع العلاقات كبل من الانزلاق. إرفاق زجاجة رذاذ على الخشب جزء C (11 × 2.5 × 1.8 سم 3) باستخدام اثنين من العلاقات كابل البلاستيك (28 سم) (G).
  3. قطع المحرك 011 أجهزة (I) وإعادة توصيله مرة أخرى مع الكابلات فضفاضة من أجهزة التحكم (H). ثم، ونعلق محرك سيرفو إلى الأعلى من الخشب الجزء ألف (12.5 × 2.5 × 1.8 سم 3) باستخدام شريط لاصق.
  4. نعلق قلم رصاص (J) إلى ذراع محرك سيرفو باستخدام مشبك الورق (K). بإحكام ربط أجزاء الخارجية من قلم رصاص لحلقات الصلب قضيب استخدام البلاستيك مغطاة الأسلاك تويست (L) وتأمين نهايات على قلم رصاص مع شريط لاصق.
  5. قطع كابل موصل مغناطيسي وحدة تحكم محرك سيرفو ل(M) وأعد لكابل مكبر الصوت (N). ثم، الشريط وحدة التحكم في المحركات المؤازرة لالخشب الجزء باء (12.7 X 10.7 × 1.8 سم 3). قطع كابل W1 مع الموصلات المغناطيسية في نصف ونعلق جزء واحد إلى نهاية فضفاضة من النحاس الصورةكابل peaker (1 م). ربط (المغناطيسي) شركة i2 التبديل تبديل والسلطة P1 إلى كابل W1 المتاحة وبطارية 9V.

2. الحساسية تحديد أسلوب

  1. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وإعداد الحلول من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 في المياه بالتناضح العكسي (100 ميكرولتر) بكميات من 260 ميكروغرام (347 نانومول)، 52 ميكروغرام (69 نانومول)، 26 ميكروغرام (34 نانومول) ، 5 ميكروغرام (6.9 نانومول)، 3 ميكروغرام (3.5 نانومول)، 520 نانوغرام (694 بمول)، 260 نانوغرام (347 بمول)، 52 نانوغرام (69 بمول)، و 26 نانوغرام (34 بمول)، و 5 نانوغرام (6.9 بمول)، و3 نانوغرام (3.5 بمول).
  2. مزيج 100 ميكرولتر من كل [رو (BPY) 3] الكلورين 2 حل مع 100 ميكرولتر من محلول مائي من نترات السيريوم الأمونيوم ((NH 4) 2 سي (NO 3) 6) في الماء (25 ملم) على شريحة المجهر.
  3. إعداد الاستحواذ في القارئ تلألؤ بيولوجي من قبل تهيئة برامج التصوير.
    1. تسجيل الدخول إلى ملف تعريف المستخدم والبحث عن أكيلوحة التحكم sition. انقر على "تهيئة" وانتظر حتى الصك جاهز.
    2. ابحث عن "وضع التصوير"، وتأكد من "الفلورسنت" و "الصورة" يتم فحص وأن "نيون" لم يتم التحقق منه.
    3. تغيير "وقت التعرض" الإعداد ل "الفلورسنت" إلى 20 ثانية. ضبط الإعدادات المتبقية ل "الفلورسنت" على النحو التالي: "Binning": متوسط. "F / إيقاف": 1؛ و "تصفية الانبعاثات": المفتوحة.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى أن تتكيف وفقا لأدوات وبيئة تجريبية تستخدم مرات التعرض، إذا كان مختلفا عن الإعداد المقدمة.
    4. ل "الصورة"، استخدم الإعدادات التالية: "التعرض تايم": السيارات. "Binning": متوسط. و "F / إيقاف": 8. ضبط "موضوع الطول" وفقا لتصوير target.Look ل "مجال الرؤية" القائمة المنسدلة. الإعداد الأولي هو "جيم" تغيير إلى "B" (14 سم المسافة بين جأميرا ومرحلة العينة).
  4. إعداد البخاخات عن طريق وضع شريحة مجهرية على ورقة من الورق المقوى الأسود على أرضية غرفة التصوير لحمايتها من عامل مؤكسد. مزيج 100 μLdroplet من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 -solution مع 100 ميكرولتر من محلول مائي من (NH 4) 2 سي (NO 3) 6. لاحظ مربع التقاطع الأخضر.
    1. وضع التصوير الموضوع على ورقة البناء السوداء، مثل أن مساحة الفائدة في وسط ضوء المربع الأخضر التقاطع عرض على المسرح العينة. إعداد البخاخات عن طريق فصل زجاجة رذاذ بلاستيكية من الدعم خشبي. ملء محلول ثلاثي الإيثيلامين (1: 3 في الماء / الإيثانول) في خزان البلاستيك، وأعد لدعم خشبي.
    2. وضع البخاخات داخل القارئ تلألؤ بيولوجي والتأكد من أن التيار يتم قطع من الحبل البخاخات. تأكد من أن مفتاح الطاقةفي وضع التشغيل، مفتاح التبديل هو خارج، وLED أحمر مضاءة. وضع البخاخات بحيث تدفق رذاذ وأشار نحو المنطقة من الفائدة على موضوع التصوير، مع التقليل من عرقلة عرض من الكاميرا على التصوير الموضوع من قبل رئيس رذاذ فوهة.
    3. ضع قطع صغيرة سوداء من الورق المقوى على أي بؤر التوتر المحتملة (مثل علامات بيضاء على الشرائح المجهرية أو مواقع الحقن) لحمايتهم من الرذاذ. مكان لا يقل عن 40 سم من الحبل بعيد البخاخات داخل غرفة التصوير، بحيث لا تتداخل مع موضوع التصوير، والبخاخات، أو مزلاج الباب المغناطيسي. إغلاق باب نظام التصوير.
      ملاحظة: إن التقاطع تغيير حجم استنادا إلى "مجال الرؤية" وضع في "العيش صورة." تأكد من أن هذا هو تعيين إلى "B".
  5. الحصول على صورة عن طريق الشروع في تسلسل التصوير. انقر على "اكتساب" في "لوحة تحكم اقتناء". على sequ التصوير الأولسينعقد، تمكين الحفظ التلقائي إذا رغبت في ذلك (موصى به) واختيار مجلد البيانات. تجاهل "تسميات تحرير التصوير" الحوار حتى نهاية التسلسل.
    ملاحظة: البرنامج تحكم يعرض الإجراءات الصك خطوة بخطوة في الوقت الحقيقي. بعد إعداد قياس وتحريك مرحلة عينة في المكان المناسب، فإنه يفتح مصراع الكاميرا وبحساب قياس الوقت. ويمكن أيضا فتح مصراع من سماع صوت نقرة التي تم إنشاؤها بواسطة آلة.
  6. كما يفتح مصراع الكاميرا، رذاذ ثلاث رشقات من محلول ثلاثي الإيثيلامين (1: 3 في الماء / الإيثانول، 0.24 ± 0.04 مل في انفجار رذاذ) عن طريق التحول التبديل تبديل ثلاث مرات لتوليد التوهج.
    ملاحظة: إن المرحلة عينة تتحرك أثناء القياس. ترك ما يكفي (لا تقل عن 40 سم) كابل داخل أداة للسماح لهذا. تأكد من أن الحل ليتم رش من البخاخات يمكن يطمح إليه الأنابيب الصاعدة وأنه لا توجد فقاعات الهواء في الأنبوب. لديك العديد من البطاريات الغيارالصورة لالبخاخات جاهزة في حالة الحاجة.

3. في فيفو التصوير بعد الجهازية الوريد حقن

  1. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وإعداد 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) محلول يحتوي على ما بين 8 و 33 نانومول من [رو (BPY) 3] الكلورين 2. تحضير محلول مائي من (NH 4) 2 سي (NO 3) 6 في الماء (25 ملم) في نفس الوقت.
  2. عن طريق الوريد حقن 100 ميكرولتر من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 في الوريد ذيل الفئران السليمة (ن = 5).
  3. الموت ببطء الفئران 10 دقيقة بعد الحقن عبر CO 2 الخنق.
    1. إزالة الجلد مع Y-قطع من الجذع، ثم إزالة القوس الساحلي في U-شكل لفضح القلب والرئتين. يروي الفئران عن طريق خفض متنفسا في الأذين الأيمن وحقن 20 مل من برنامج تلفزيوني من خلال إبرة قياس 24 إلى البطين الأيسر (18). قطع بعناية من خلال البطنالجلد وفضح الكلى والكبد. قطع طولي من خلال الأجهزة لإنشاء قطع مرئية.
  4. إعداد اكتساب كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،6، مع التغييرات التالية.
    1. بعد غسلها جيدا الخزان البلاستيك البخاخات وملئه بمحلول مكون من (NH 4) 2 سي (NO 3) 6 في الماء (25 ملم) بدلا من ثلاثي الإيثيلامين.
      ملاحظة: من المهم أن يشطف جيدا فوهة البخاخات بعد كل استخدام، منذ بلورة (NH 4) 2 سي (NO 3) 6 قد تدمر فوهة الرش بعد عدة استخدامات.
  5. استخدام الحيوان أو الجهاز عينات كاملة للتصوير.
    1. للتصوير البطن كله، وضع الذبيحة الماوس مع البطن المفتوح التي تواجه الكاميرا ورئيس لافتا إلى الجزء الخلفي من الصك. توسيط جهاز للتصوير (على سبيل المثال، في الكبد أو الكلى) في ضوء المربع الأخضر التقاطع.
    2. Fأو فرد التصوير الجهاز النوعي والكمي، وإزالة الماوس من أداة التصوير ويعلقون عليه. بدءا من تجويف الجسم فتحت بالفعل، استئصال الأعضاء الداخلية (على سبيل المثال، الكلى، الكبد، الرئة، العضلات، والطحال والمخ، والقلب). قطع طريق الجلد الساق الخلفية لاستئصال الأنسجة العضلية. بعناية فتح الجمجمة مع مشرط لاستئصال الدماغ.
      1. إذا كان الجهاز من الفائدة الكبد والكلى أو الطحال، وقطع جميع الأجهزة في النصف طوليا، ضع كل جهاز على طبق بتري أو قطعة من الورق المقوى الأسود.
    3. اتبع الإجراء هو موضح في الخطوات 2،3-2،6 لتحديد الانبعاثات النسبي للالتتبع chemiluminescent لأجهزة احدة.

4. في فيفو التصوير من الغدد الليمفاوية

  1. إعداد 10 ميكرولتر من محلول PBS تحتوي على 80 نانومول من [رو (BPY) 3] الكلورين 2. تحضير محلول مائي من (NH 4) 2 سي (NO 3) 6 في واثالثا (25 ملم) في نفس الوقت.
  2. ضخ 10 ميكرولتر من الحل subdermally إلى مخلب هند من الفئران السليمة (ن = 5). ونتيجة لسيطرة سلبية، وضخ مخلب المقابل مع 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني النقي. التضحية الفئران عبر CO 2 اختناق 15 دقيقة بعد الحقن. إزالة الجلد على ساقيه الخلفيتين لفضح القنوات الليمفاوية إلى الغدد الليمفاوية المأبضية.
  3. إعداد اكتساب كما هو موضح في الخطوة 3.4.
  4. إزالة الغدد الليمفاوية المأبضية من ساقيه الخلفيتين، قطع منها في النصف، ورذاذ لهم أكسدة على طبق بيتري، كما هو موضح من قبل (الخطوة 3.5.3)، لغرض تقدير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظام البخاخات الموضحة في قسم البروتوكول 1 يمكن بناؤها من مواد يسهل المتاحة بتكلفة منخفضة. الغرض منه هو أن يكون أقحم للرش من الحد / عامل مؤكسد داخل قارئ للإضاءة الحيوية التي نجمت عن بعد (الشكل 1). لدينا تصميم يسمح للتشغيل الآمن من البخاخات داخل القارئ تلألؤ بيولوجي على مسافة 14 سم من العدسة. ولم يلاحظ أي تعفير أو عدم وضوح العدسة أثناء العملية. اخترنا كيل chemiluminescent المتاحة تجاريا [رو (BPY) 3] الكلورين (2) لتطوير طريقة لدينا بناء على سعره المنخفض والاستقرار في محلول مائي، والسلوك الأكسدة موصوفة وصفا جيدا، وخصائص chemiluminescent (الشكل 2) 19. يمكن تحديد إشارة يمكن كشفها الحد الأدنى كما هو موضح في قسم البروتوكول 2 عن طريق أكسدة قطرة واحدة من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 (100 ميليلتر، 6.9 pmol- 347 نانومول في H 2 O) مع (NH 4) 2 سي (NO 3) 6 (100 ميكرولتر، 25 مم) على شريحة المجهر. ثم، باستخدام البخاخات والرش على حل ثلاثي الإيثيلامين (1: 3 في الماء / الإيثانول)، يتم تشغيل إشارة chemiluminescent. في حالتنا، تم تحديد إشارة يمكن كشفها الحد الأدنى لتكون 6.9 بمول / سم 2 (الشكل 3). فمن المتصور، على الرغم من أن تحسين ظروف التفاعل والحساسيات الكاميرا، وأحيانا مصراع، مجلدات، ويمكن أن يؤدي تركيزات كاشف لأقل من ذلك عتبات الكشف. ويمكن أيضا أن هذه الظروف رد فعل استخدامها لاستكشاف واختبار التوهج في أي مجموعة معينة من المجمعات المعدنية، عامل مؤكسد، والاختزال.

الانتقال إلى التجارب المجراة في أقسام بروتوكول 3 و 4، النساء العاريات (الأباعد) الفئران 5-6 أسابيع من العمر وNU / J الفئران الذكور 6-8 أسابيع من العمر استخدمت. لالحقن في الوريد، تبلغ من8-33 نانومول من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في الماوس (ن = 5) تم اختيارهم. وتم اعدام الحيوانات 10 دقيقة بعد الحقن، وتعرضت تجويف البطن. وضعت الفئران في القارئ إضاءة الحيوية مع البخاخات لافتا نحو الأنسجة من الاهتمام (الشكل 4). للتصوير مع حقن عن طريق الوريد، [رو (BPY) 3] الكلورين تم الكشف عن إشارة chemiluminescent في الغالب في الكلى، مما يشير بقوة إلى القضاء الكلوي من جزيء صغير ماء (الشكل 5). وكانت نسب الإشارة إلى الضوضاء لحقن الفئران مع [رو (BPY) 3] الكلورين 2 مقابل PBS 27/1 لالكلى و21/1 للكبد. لالليمفاوية التصوير العقدة، و 80 نانومول من [رو (BPY) 3] الكلورين 2 في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تم حقن subdermally إلى لوحة القدم الخلفية من الفئران (ن = 5). تم التضحية الفئران لمدة 15 دقيقة حقن المنصب من قبل CO 2 الخنق. الجلد الذي يغطي كلا من الداخلية هند الساقين واق إزالة لفضح العضلات والغدد الليمفاوية، والأوعية اللمفاوية. أدى التصور chemiluminescent لاحق من العقد الليمفاوية المأبضية إلى الملاحظة التي الليمفاوية الغدد تحتوي على [رو (BPY) 3] 2+ إظهار 10 ± 4.3 أضعاف إشعاع أعلى من تلك غير المعالجة (167000 ص / (ق × 2 سم × ريال سعودي) و 17000 ص / (ق × 2 سم × ريال سعودي)؛ P <0.028) (الشكل 6).

شكل 1
الشكل 1: صورة من البخاخات. الأجزاء المستخدمة: قطع هيكل خشبي (A، B، C)، وزجاجة رذاذ (D)، والصلب عازمة قضيب (E)، شريط لاصق (F)، علاقات كابل البلاستيك (G)، 011 موصل المؤازرة جزء (H)، سيرفو (I)، قلم رصاص ( J) الذي عقد بواسطة bent مشبك الورق (K)، بالبلاستيك العلاقات سلك تويست (L) سلك موصل W1 (M) وكابل مكبر الصوت (N) مما يؤدي إلى البطارية. ويستند هذا الرقم على البحوث التي نشرت أصلا في المرجع erence 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. خصائص [رو (BPY) 3] 2+. هيكل (A) والإثارة والأطياف الانبعاثات (ب) من [رو (BPY) 3] 2+. أكسدة / تخفيض على أساس دورة الحفازة chemiluminescent (C). ويستند هذا الرقم على البحوث التي نشرت أصلا في اشارة 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الصفحة = "1"> الشكل (3)
الشكل (3): عتبة الكشف عن [رو (BPY) 3] 2+. شدة إشارة تمثيلية في تركيزات مختلفة من [رو (BPY) 3] 2+ على شريحة المجهر (A). التصوير إشارة الكمي مع عتبة الكشف (الخط المنقط باللون الأحمر) والخلفية (الأسود خط منقط) (B). ويستند هذا الرقم على البحوث التي نشرت أصلا في اشارة 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: التوهج التصوير. الرسم التخطيطي على فأرة الحاسوب والبخاخات وضعه في القارئ تلألؤ بيولوجي (A ز>) والرسم التخطيطي (ب) من البخاخات لرش على الماوس. ويستند هذا الرقم على البحوث التي نشرت أصلا في اشارة 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الكشف عن [رو (BPY) 3] 2+ بعد إدارة الجهازية. الضوء الأبيض، والتوهج، وتراكب (من اليسار إلى اليمين). صور من تجويف جسم الفأر الذي تم حقنه مع 33 نانومول من [رو (BPY) 3] 2+ ورشها بالمبيدات (NH 4) 2 سي (NO 3) 6. يشير السهم البيضاء نحو الكلية اليمنى. ويستند هذا الرقم على البحوث التي نشرت أصلا في اشارة 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: الكشف عن [رو (BPY) 3] 2+ بعد ادارة تحت الجلد. المأبضي العقدة الليمفاوية التصوير يظهر الضوء الأبيض، التوهج، والصور المركبة لحقن الفئران مع [رو (BPY) 3] 2+ (أعلى) وبرنامج تلفزيوني (القاع) في الأطراف الخلفية. 80 نانومول في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، تصوير 15 دقيقة بعد الحقن (A). الضوء الأبيض وصور مركبة ل[رو (BPY) 3] 2+ (أعلى) وبرنامج تلفزيوني (القاع) المعالجة بالإثير رفعه الغدد الليمفاوية المأبضية (B). الكمي للإشارات chemiluminescent لبرنامج تلفزيوني و[رو (BPY) 3] 2+ الغدد الليمفاوية المعالجة بالإثير (C). والبيانات تمثل متوسط ± SD. ويستند هذا الرقم على البحوث في الأصلنشرت inreference 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، قدمنا ​​التكنولوجيا التي هي قادرة على ترسيم بصريا الأنسجة عن طريق انبعاث الفوتونات التي أنشأتها مراسل chemiluminescent. وعلى النقيض من الآخر، أكثر رسوخا والتكنولوجيات هذا النظام مراسل chemiluminescent يستخدم مسبار التصوير التي هي غير المشعة ويسهل الكشف على مستويات حساسية عالية جدا. وربما الأهم من ذلك، لا يتطلب التصوير التوهج مصدر الحادث الضوء (كما هو الحال في التصوير مضان البصرية) 20، سمة أن يقلل من تألق ذاتي وبشكل كبير يقلل الإشارات الخلفية.

مراسل الروتينيوم [رو (BPY) 3] الكلورين 2 لديه في الجسم الحي سمية مقبولة لأغراض التصوير (كثافة العملياتraperitoneal الماوس LD 50: 20 ملغ / كلغ) 21، هو للذوبان في الماء (تصل إلى 8 ملم)، وغير مستقر في مجرى الدم. الخصائص الفيزيائية للمجمع المعادن بشكل جيد ويشهد وتم التحقيق بالفعل للعلاج الضوئي من السرطان 22، 23. (NO 3) 6 تم الإبلاغ عن وكيل المؤكسدة (NH 4) 2 سي أن سمية منخفضة جدا (عن طريق الفم LD الفئران 50: 1600-3200 ملغم / كغم) 24 وغير قابل للذوبان في الماء في تركيزات تصل إلى 2.57 م في 20 ° C 25. في هذه المقالة، يتم عرض مظاهرة البصرية فضلا عن التوجيه يستند إلى نص لبناء جهاز nebulizing تشغيلها عن بعد. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم بروتوكولات قوية لأداء التصوير التوهج في جهاز تلألؤ بيولوجي التصوير القياسية. نحن لتوضيح استخدام [رو (BPY) 3] الكلورين (2) لvisualizatiعلى الأنسجة بعد كل من الحقن في الوريد وتحت الجلد في الفئران.

ومع ذلك، كما هو الحال مع أي تكنولوجيا التصوير الوليدة أخرى، هناك مجال للتحسين بروتوكولات لدينا. ونحن نعتقد أن هذه الدراسة إثبات صحة المبدأ يمكن أن يحفز تطوير تطبيقات التوهج متعددة للأنظمة الحية. ويمكن تناول النقاط التالية لزيادة تحسين التكنولوجيا وتوسيع نطاقه.

ومن شأن الجيل الثاني أصغر من أجهزة الرش تفجيرها عن بعد يسمح العينة ليكون أقرب إلى الكاميرا، وبالتالي تحسين القرار المكانية. تحسين المعدات البصرية قد تزيد من تحسين الكشف عن حدود هذه الطريقة. ويمكن أيضا أن يكون تمديد بروتوكول لتصوير الحيوانات الحية. ان السيطرة على وجه الدقة من عزم الدوران (عن طريق الجهد الحالي و) يسمح للتحكم أكثر دقة من حجم كاشف إصدارها مع كل رذاذ. فمن المهم للحفاظ على البخاخات بحالة جيدة. لا الشطف البخاخات قد تدمر nozzجنيه. بطارية جديدة هو أمر حاسم لحسن أداء البخاخات. ومع ذلك، فإن جميع المواد المستخدمة في البخاخات وغير مكلفة ومتاحة بسهولة تجاريا. البروتوكولات التالية الاصطناعية المتبعة، [رو (BPY) 3] 2+ مجمع يمكن بسهولة تعديل مع مختلف linkers، بما في ذلك maleimides 26، الأمينات 27، واسترات NHS 28، 29. وهذا من شأنه تمكين bioconjugation إلى جزيئات صغيرة، والببتيدات، أو الأجسام المضادة، وبالتالي تسهيل محددة الجزيئية التي تستهدف 30، 31، 32، 33. في نهاية المطاف، يمكن تسليم التحقيق يستهدف تمكين الجراحين لتحديد الآفات الصغيرة وترسم بدقة هوامش الجراحية في غرفة العمليات مع خصوصية عالية جدا. أيضا، والتغليف للغاية للذوبان في الماء [رو (BPY) 3] 2+ في المواد متناهية الصغر على حد سواء المستهدفة وبدون استهداف-قد تسمح أيضا لتصور الآفات أثناء وجودهم يتم إزالتها جراحيا 34، 35، 36. وأخيرا، تعديل المجال التنسيق لمراسل المعدنية المعقدة و / أو تغيير مركز المعادن الانتقال ذاتها تمثل طرق جذابة لتعديل وضبط موجات الانبعاثات في الظاهر وقوائم الجرد الوطنية يتراوح 37 و 38.

أثناء العملية التصوير معان كيميائي يحتاج مراسل chemiluminescent، وفي حالتنا، أكسدة، والتي يمكن أن تستخدم إلا في حدود سميتها والذوبان. يمكن أغشية الأنسجة تمثل عائقا لنشر للأكسدة في الأنسجة، وبالتالي، فإن الجيل إشارة. منذ مراسل chemiluminescent يولد إلا فوتون واحد في كل دورة، وإشارة ولدت ضعيفة نوعا ما.وبالتالي فإن الضوء المحيط في غرفة العمليات يجب أن منعت من دخول الكاميرا في حين أن التقنية المستخدمة. هذا قد يجعل ICI للاهتمام بوجه خاص لتطوير التطبيقات بالمنظار، حيث يتم الإضاءة المحيطة تستبعد بشكل طبيعي.

ونحن نأمل ان يكون هذا الأسلوب قد يتحول إلى أداة قيمة للجراحين في غرفة العمليات. غياب النشاط الإشعاعي هو مفيد للفريق المريض والتشغيل على حد سواء، ويجعل أقل احتياطات السلامة الضرورية، مما يمكن أن يجعل هذه التقنية إلى بديل أكثر جاذبية.

التشغيل السلس من البخاخات وموقعها تلعب دورا حاسما للحصول على نتائج جيدة. الزوايا والمناطق دون المستوى الأمثل يمكن أن تسهم في إشارة التباين. يجب وضع كابل التحكم من خلال الباب مع الرعاية، ويكفي كابل يجب أن يبقى داخل القارئ تلألؤ بيولوجي ذلك أنه ليس ضيقة أو مزق.

في نهاية المطاف، chemiluالتصوير minescence هو نهج جديد جذابة للغاية للتصوير الجزيئي. لأنه يقوم على أساس الكيمياء الراسخة، توظف مواد غير مكلفة ومتوفرة بسهولة، ويتجنب كل من الإشعاع ومصادر الضوء الإثارة. ونتيجة لذلك، نحن على حد سواء أمل وثقة في المستقبل، والتصوير التوهج يمكن أن يكون له تأثير عميق على العلاج الجراحي لمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics