Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Son yıllarda, görüntüleme teknolojileri doktorlar hastalığı teşhis ve monitör yol devrim var. Bu görüntüleme teknolojileri, ancak bu tür pozitron emisyon tomografisi (PET), tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT), bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gibi tüm vücut görüntüleme sistemleri, büyük ölçüde sınırlı olmuştur. Özellikle dikkat kanseri ödenmiştir ve teknolojik görüntüleme devrimler büyük ölçüde bu hastalığın teşhis ve tedavi edilir şekilde düzeldi. ameliyathane: Bu ilerlemelere rağmen, bu görüntüleme teknolojileri sadece uymaz bir yer var. Tüm vücut görüntüleme teknikleri, cerrahi planlamada yardımcı olabilir, bunlar genellikle tümör dokusunun tüm kaldırıldı veya artık tümör dokusu cerrahi sınırların 1'de gizli kalır olsun hekimler gerçek zamanlı olarak belirlemeye yardımcı olmak için yeterince yüksek uzaysal çözünürlük yoksundur. Hiçbir infiltratif emin yapmaTümör marjları geride en önemli cerrahi hedeflerinden biridir ve cerrahlar titiz ve tedbirli doku rezeksiyonu arasında sıkı-ip yürümek gerekir edilir. Çok fazla çıkarılırsa, hastada istenmeyen yan etkiler arttırılmış olur çok az kaldırılan ise, nüks oranları, 3 2 artmıştır. Nedenle, doğru tümör marjları tasvir için çok önemlidir ve biz kemilüminesan intraoperatif görüntüleme aksi kurulan teknikleri ile tespit edilmemiş kalabileceği malign doku görselleştirmek için cerrahlara yardımcı olarak tümör marjlarının belirlenmesi doğruluğunu geliştirmek için yardımcı olabilir inanıyoruz.

Şu anda intraoperatif görüntüleme sistemleri gibi olası yarar için araştırılan birçok görüntüleme teknolojileri vardır. Bu β- ve γ-radyasyon yayan sondalar 4, optik floresan 5, Raman spektroskopisi 6 dahil >, 7 ve Cherenkov ışıma 8, 9. Ancak bugüne kadar, bunların hiçbiri, standart klinik araçlar olarak kullanılır hale gelmiştir. Optik floresan görüntüleme şimdiye kadar bu tekniklerin en umut verici olduğu kanıtlanmıştır ve en çok araştırdı nedenle etti. Zaten birçok uygulama için değerli bir araç olarak gösterilmiş olsa da, bu sınırlamalar olmadan değildir. Gerçekten de, asıl dezavantajı doğal autofluorescent biyolojik doku tarafından üretilen arka plan floresan olduğunu. Bu arka plan otofloresan sinyali, floresan sinyalinin üretimi için gerekli olan, harici bir ışık kaynağı tarafından, florofor ilave olarak, çevre doku uyarılmasının bir ürünüdür. Pratik açıdan bakıldığında, bu otofloresans potansiyel ameliyathanede bu teknolojinin faydasını sınırlayabilir düşük sinyal-gürültü oranları, yol açabilir.

Müdürfloresan görüntüleme üzerinden Kemiluminesan görüntüleme avantajı uyarma ışık gerekli olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir arka plan otofloresansı yoktur. Kemiluminesan görüntülemede, uyarma enerjisi yerine kimyasal oluşturulur. Bu işlem, daha yüksek bir sinyal-ses oranlarına neden olabilir, bu nedenle herhangi bir istenmeyen arka plan sinyali üretir ve. Bu sonuçta cerrahi sınırların daha hassas ve doğru algılama neden olabilir. Biraz şaşırtıcı bir ameliyat görüntüleme tekniği olarak bu yaklaşımın yarar 10 keşfedilmemiş kalmıştır. Gerçekten de, bu tekniğin en yakın örnek, farelerde 11, 12, 13, miyeloperoksidaz tarafından luminol oksitlenmesidir. merhaba ile düşük arka plan sinyali sonuçlanan (1) en az otofloresans: kemilüminesans biyomedikal görüntüleme aşağıdaki avantajları sunabilir araştırma oldukça keşfedilmemiş alan nedenleGher sinyal-gürültü oranları; (2) görünür gelen yakın-kızılötesi değişen kemilüminesan emisyonların ayarlanabilir dalga boyları; ve (3), bir bağlayıcı teknolojileri ile bir araya getirilmiş ve zaten mevcut biyomoleküllerin hedef olduğunda, hedef moleküler görüntüleme sondaları 14 tüm kütüphanelerin erişim sağlayan fonksiyonalitesine sahip kimyasal olarak ışık veren kompleksleri.

Bu proof-of-prensibi çalışma rutenyum tabanlı görüntüleme maddesi kullanarak biyomedikal ortamda kemilüminesan görüntülemenin potansiyel yarar göstermektedir. Bu bileşiğin kemilüminesan özellikleri iyi 1960'ların ortalarında 15 kadar uzanan araştırmaları ile incelenmiştir. Kimyasal aktivasyonu üzerine, madde, tıbbi görüntüleme amacıyla uygundur 600 nm 16 ° ışık üretir. Aktivasyon enerjisi uyarılmış durumda su 17 -foll 650 ns ömrü vardır yol açan bir redoks reaksiyonu sonucu elde edilenBu heyecanlı devletin gevşeme üzerine foton kuşağının borçlu. Bir özel tasarlanmış uzaktan nebulizatör kullanımı sayesinde, biz bileşik hem ex vivo ve in vivo tespit başardık. İlk deneylerin sonuçları bu teknolojinin daha fazla araştırılması düşündüren, oldukça ümit vericidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik deyimi: onaylanmış bir protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (MSK) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kuralları uyarınca göre yapıldı tarif edilen in vivo hayvan deneylerinde tümü.

Bir püskürtme cihazı 1. İnşaat

  1. Iki vidayı (x 25 mm 2 4) kullanılarak kısım B (12.7 x 10.7 x 1.8 cm 3) merkezinde dik ahşap parça A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm 3) takın. Ahşap parça C takın (11 × 2.5 × 1.8 cm 3) C bölümü (11 x 2.5 x 1.8 cm 3) hala hareket ettirilebilir şekilde bir vida kullanılarak kısım A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm 3) ortasına. Bkz: Şekil 1.
  2. iki döngüler, ya bir tane oluşturmak yoluyla iki delik plastik 3 oz küçük püskürtücü (D) sprey şişe tetik alt ucundan Matkap ve paslanmaz çelik çubuk itin (1/16 "çelik 10 cm) (E) tetikleyici yan. kaymasını kablo bağları önlemek için koli bandı (F) ile sprey şişesinin alt kısmını sarın. Iki plastik kablo bağları kullanarak ahşap parça C (11 x 2.5 x 1.8 cm 3) (28 cm) (G) sprey şişesi takın.
  3. 011 servo motor (I) kesiniz ve servo kontrolü (H) gevşek kablolar ile yeniden bağlayın. Ardından, koli bandı kullanarak ahşap kısım A (12.5 x 2.5 x 1.8 cm 3) üstüne servo motora takın.
  4. ataç (K) kullanarak servo motor koluna bir kalem (J) takın. Sıkıca plastik kaplı büküm telleri (L) kullanılarak çelik çubuk döngüler kalem dış kısımlarını bağlamak ve koli bandı ile kalem üzerinde biter sabitleyin.
  5. servo motor kontrol ünitesinin manyetik kablo konnektörünü (M) kesiniz ve hoparlör kablosu (N) onu takın. Sonra, odun parçası B (12.7 x 10.7 x 1.8 cm 3) servo motor kontrol ünitesini bantlayın. yarısında manyetik konnektörleri ile bir w1 kablosunu kesin ve bakır s gevşek ucuna bir parçasını takmakPeaker kablosu (1 M). Mevcut w1 kablo ve 9V pil (manyetik) i2 geçiş anahtarı ve p1 gücü bağlayın.

Yöntem 2. Hassasiyet Belirlenmesi

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 260 ug (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 ug (34 nmol) miktarlarında ters osmoz, su (100 uL) içinde [Ru (bpy) 3] Cl2 çözeltilerini hazırlamak 5 ug (6.9 nmol), 3 ug (3.5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 umol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6.9 pmol), 3 ng (3.5 umol).
  2. Her biri 100 uL karıştırın [Ru (bpy) 3] Cl amonyum seryum nitrat sulu çözeltisi, 100 uL 2 çözeltisi ((NH4) 2 Ce (NO 3) 6) bir mikroskop lamı üzerine, su (25 mM) 'de.
  3. Görüntüleme yazılımı başlatarak biyoparlaklık okuyucuda satın ayarlayın.
    1. kullanıcı profiline oturum açın ve Acqui bakmaklan de kontrol paneli. "Başlatma" ve enstrüman hazır olana kadar bekleyin tıklayın.
    2. denetlenmeyen "Görüntüleme Modu" için bakın ve "Işıklı" ve "Fotoğraf" işaretli olduğundan emin olun ve "Floresan".
    3. Değiştir "Temas Süresi" 20 s "Lüminesans" ayarı. "Kutulamanın": aşağıdaki gibidir: "Lüminesans" için kalan ayarları ayarlayın Orta; "F / durdur": 1; ve "Emisyon Filtresi": Açık.
      NOT: pozlama süreleri enstrümantasyon ve kullanılan deneysel ayarlarına göre adapte edilmesi gerekebilir, sunulan kurulum farklı ise.
    4. "Temas Süresi" For: "Fotoğraf," aşağıdaki ayarları kullanın Auto; "Binning": Orta; ve "F / durdur": 8. "Görüş Alanı" açılır menüsünden için target.Look görüntüleme göre "Konu Boy" ayarlayın. Başlangıç ​​ayarı "C" dir c arasında "B" olarak değiştirin (14 cm mesafedenamera ve örnek aşaması).
  4. Oksitleyici madde korumak için görüntüleme odasının zemininde siyah inşaat bir kağıda üzerinde mikroskobik slayt koyarak nebulizatör ayarlayın. Bir 100 μLdroplet karıştırın [Ru (bpy) 3] CI2 solüsyonunun sulu bir çözeltisi, 100 uL (NH4) 2 Ce ile (NO 3) 6. yeşil kutu çarpı dikkate alınmalıdır.
    1. siyah inşaat kağıt üzerinde görüntüleme konuyu yerleştirin, ilgi alanı yeşil ışık kutusu crosshair merkezinde olacak şekilde numune sahnede sergiledi. ahşap destek plastik sprey şişesinde ayırarak nebülizatör hazırlayın. plastik hazne içine (su / etanol 1: 3) ve ahşap destek yerine tekrar trietilamin ihtiva eden bir çözelti doldurun.
    2. biyolüminesans okuyucu içinde nebulizatör yerleştirin ve güç kablosu nebulizatör kablosu çıkarılmış olduğundan emin olun. Emin olun güç anahtarıaçık, geçiş anahtarı kapalıdır ve kırmızı LED yanıyor püskürtme memesi kafası tarafından görüntüleme konuya doğru kameradan görünüm tıkanıklığı en aza indirerek sprey akışı, görüntüleme konuyla ilgili ilgi alanına doğru işaret edilmektedir böyle nebülizatör yerleştirin.
    3. Sprey onları kalkan (mikroskobik slaytlar ya da enjeksiyon sitelerinde örneğin, beyaz işaretleri) herhangi bir potansiyel sıcak noktalar üzerinde inşaat küçük kağıt, siyah parçalarını yerleştirin. Bir yerde görüntüleme konu nebulizer veya manyetik kapı mandalı ile karışmaz şekilde görüntüleme bölmesi içindeki nebulizatör uzaktan kord en az 40 cm. görüntüleme sistemi kapağını kapatın.
      NOT: Crosshair ayarı "adlı Alanında" dayalı boyutu değişecektir "Görüntü Living;" Bu "B" olarak ayarlanmış olduğundan emin olun.
  5. görüntüleme dizisi başlatarak bir görüntü kazanır. içinde "Acquire" Click "Toplama Kontrol Paneli." ilk görüntüleme dizisine üzerindeence, istenen (önerilir) ise Otomatik kaydetmeyi etkinleştirmek ve bir veri klasörünü seçin. dizinin sonuna kadar "Edit Görüntüleme Etiketler" iletişim geçiyoruz.
    NOT: kontrol yazılımı cihazın eylemleri adım-adım, gerçek zamanlı olarak gösterir. ölçüm hazırlanması ve doğru pozisyonda örnek sahne taşındıktan sonra, kamera deklanşörü açılır ve ölçüm zamanını sayar. deklanşör açılış ayrıca makine tarafından oluşturulan bir tık sesi ile duyulabilir.
  6. kemilüminesansını oluşturmak için geçiş şalteri üç kez geçerek: obtüratör açılır gibi, trietilamin solüsyonu üç patlamaları (su / etanol içinde 3, sprey patlama başına 0.24 ± 0.04 ml 1) püskürtün.
    NOT: Numune sahne Ölçüm sırasında hareket edecektir. Bu izin enstrümanın içinde yeterli (en az 40 cm) kablo bırakın. Çözelti artan borusu ile talip olabilir nebulizatör ile püskürtülür olduğunu ve borunun hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Birkaç yedek Batterie varihtiyaç halinde hazır nebulizer için s.

Vivo Görüntüleme 3. Sistemik İntravenöz Enjeksiyonu Sonrası

  1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, [Ru (bpy) 3] Cl2 nmol 8 ila 33 ihtiva eden fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi, 100 uL hazırlar. Sulu bir çözeltisi (NH4) 2 Ce hazırlama (NO 3), aynı zamanda, su (25 mM) 6.
  2. İntravenöz, sağlıklı farelerin kuyruk venine 100 uL [Ru (bpy) 3] CI2 enjekte (n = 5).
  3. CO 2 boğulma yoluyla enjeksiyondan sonra fareler 10 dakika euthanize.
    1. Daha sonra kalp ve akciğerleri maruz U-şeklinde kaburga kemer kaldırmak, gövde bir Y-cut ile cildi çıkarın. Sol ventrikül 18 bir 24 gauge iğne yoluyla PBS 20 mL sağ atriyum bir çıkış kesme ve enjekte fareler serpmek. Dikkatle göbek kesticilt ve böbrek ve karaciğer maruz kalmaktadır. görünür bir kesim oluşturmak için organları aracılığıyla uzunlamasına kesin.
  4. Aşağıdaki değişikliklerle, adım 2.3-2.6 anlatıldığı gibi tedarik ayarlayın.
    1. İyice nebülizör plastik hazne yıkandıktan sonra, bunun yerine trietilamin su (NH4) içindeki bir 2 Ce (NO 3) 6 (25 mM) ile doldurun.
      NOT: iyice kristalize beri, her kullanımdan sonra nebulizatör memesini durulanması önemlidir (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 birkaç kullanımdan sonra püskürtme memesini yok edebilir.
  5. Görüntüleme için, bütün hayvanlar veya organ örnekleri kullanın.
    1. Bütün karın görüntüleme için, kamera ve cihazın arka işaret kafa bakacak açık karın fare karkas yerleştirin. Organı ortalamak yeşil ışık kutusu crosshair (örneğin, karaciğer veya böbrek) yansıması.
    2. Fveya organ görüntüleme ve miktar bireysel, görüntüleme cihazdan fare kaldırmak ve onu aşağı pin. Önceden açılmış gövdesinden başlayarak, iç organların (örneğin, böbrek, karaciğer, akciğer, kas, dalak, beyin, kalp) tüketim. kas dokusu çıkarılması için arka bacak deri yoluyla kesti. Dikkatle beyin çıkarılması için bir neşter ile kafatası açın.
      1. ilgi organ karaciğer, böbrek veya dalak ise, uzunlamasına ikiye tüm organları kesilmiş bir petri veya siyah inşaat kağıt parçası üzerinde her organı yerleştirin.
    3. Tek organlar için kemilüminesan izleyici nispi emisyon kurmak için adımlar 2,3-2,6 açıklanan prosedürü uygulayın.

Lenf nodu 4. İn Vivo Görüntüleme

  1. [Ru (bpy) 3] Cl2 80 nmol ihtiva eden bir PBS çözeltisinden 10 uL hazırlayın. Sulu bir çözeltisi (NH4) 2 Ce hazırlayın (NO 3) 6 waAynı zamanda ter (25 mM).
  2. subdermal, sağlıklı farelerin arka bacağına çözeltisinin 10 ul enjekte edilir (n = 5). Bir negatif kontrol olarak, saf PBS 10 uL karşı taraftaki pençenin enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra CO 2 boğulma yoluyla 15 dakika fareler Kurban. popliteal lenf düğümlerine kadar lenf kanalları ortaya çıkarmak için her iki arka ayakları üzerinde cilt kaldırmak.
  3. Adım 3.4 anlatıldığı gibi satın ayarlayın.
  4. , Her iki arka bacak popliteal lenf düğümleri kaldırmak bolun ve miktar tayini amacıyla, (aşama 3.5.3) daha önce açıklandığı gibi, bir Petri tabağına oksidan ile püskürtülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol 1. bölümde tarif edilen vaporizatör, sistemin düşük bir maliyetle kolayca mevcut malzemelerden yapılabilir. Uzak tetikli bir biyolojik olarak ışık veren okuyucu içinde indirgeme / oksitleme maddesinin püskürtülmesi (Şekil 1) için bir ilave olacak şekilde tasarlanmıştır. Tasarım lensten 14 cm mesafeden biyoparlaklık okuyucunun içinde nebulizer güvenli çalışması için izin verir. lensin Hiçbir sisleme veya bulanıklaştırma işlemi sırasında gözlenmiştir. Bu ticari olarak temin edilebilir kimyasal parlak madde, [Ru (bpy) 3], düşük fiyat dayalı yöntemin geliştirilmesi için CI2, sulu bir çözelti, iyi tanımlanmış redoks davranışı ve kimyasal parlaklık özellikleri stabilite (Şekil 2) 19 seçildi. [Ru (bpy) 3] CI2 (100 uL bir damla oksidasyonu ile protokolü bölüm 2'de tarif edildiği gibi en az algılanabilir bir sinyal belirlenebilir 6.9 pmol- 34Ile H2O) 7 nmol (NH4) bir mikroskop lamı üzerine 2 Ce (NO 3) 6 (100 uL, 25 mM). Daha sonra, püskürtücü kullanılarak ve trietilamin ihtiva eden bir çözelti üzerine püskürtülerek (1: su / etanol içinde 3), kimyasal olarak ışık veren sinyali tetiklenir. Bizim durumumuzda, minimal tespit sinyali 6.9 pmol / cm2 (Şekil 3) olarak belirlenmiştir. Bu reaksiyon koşullarının, kamera hassasiyeti, deklanşör süreleri, hacimleri optimize ve reaktif konsantrasyonları daha düşük algılama eşikleri yol açabilecek olsa da, düşünülebilir. Bu reaksiyon koşulları, aynı zamanda, metal kompleksleri, oksitleyici maddeler ve indirgeyici maddelerin herhangi bir kombinasyonu kemiluminesans keşfetmek ve test etmek için de kullanılabilir.

3 ve 4, dişi çıplak (outbred) fareler 5-6 haftalık ve 6-8 haftalık nu / J erkek farelere protokolü bölümlerinde in vivo deneyler için taşıma kullanılmıştır. İntravenöz enjeksiyonlar için, günlük olarakVe 8-33 nmol [Ru (bpy) 3] CI2 100 ul PBS içinde fare başına (n = 5) seçilmiştir. Hayvanlar 10 dakika enjeksiyondan sonra kurban edildi ve karın boşluğu ortaya çıkmıştır. Fareler, ilgili dokuya doğru işaret nebulizer (Şekil 4) ile birlikte biyo-lüminesan okuyucusuna yerleştirildi. Damardan enjekte görüntülemenin [Ru (bpy) 3] CI2, kimyasal parlaklık sinyal, hidrofilik küçük molekülün renal eliminasyon düşündürmektedir böbreklerde ağırlıklı tespit edildi (Şekil 5). PBS karşılık, [Ru (bpy) 3] Cl2 enjekte edılen fareler için sinyal-gürültü oranı böbrek 27/1 ve karaciğer için 21/1 idi. Lenf düğümü görüntüleme, [Ru (bpy) 3] PBS 10 uL Cl 2 farelerin arka ayak tabanı içine subdermal enjekte edildi, 80 nmol (n = 5). Fareler CO 2 boğulma 15 dakika sonrası enjeksiyon kurban edildi. iç arka ayakları wa her ikisini de kapsayan ciltkas, lenf düğümleri ve lenf damarları açığa çıkarılarak s. Popliteal lenf nodlarının sonraki kemiluminesant görselleştirme [3 Ru (bpy)] göstermek 2+ içeren lenf gözlem yol açan 10 ± 4.3 kat) işlenmemiş olanlardan daha yüksek parlaklık (cm 2 × sr × 167.000 p / (s ve / (cm2 x SR x s) 17.000 p; p <0.028) (Şekil 6).

Şekil 1
Şekil 1: Nebulizatör Fotoğraf. kullanılan parçalar: Ahşap yapı parçaları (A, B, C), sprey şişe (D), bükülmüş çelik çubuk (E), koli bandı (F), plastik kablo bağları (G), 011 servo bağlantı parçası (H), servo motor (I) kalem ( bükülmüş kağıt klip (K tarafından düzenlenen J)), plastik kaplı tel büküm bağları (L) w1 telli bağlayıcı (M) ve pil önde gelen hoparlör kablosunu (N). Bu rakam araştırmalara dayanmaktadır başlangıçta ref yayınlanan19 erence. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Özellikler [Ru (bpy) 3] 2+. Yapı (A) ve uyarılma ve emisyon spektrumu (B), [Ru (bpy) 3] 2 +. Oksidasyon / redüksiyon tabanlı kemiluminesans katalitik döngüsü (C). Bu rakam aslında referans 19'da yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 3: Algılama Eşiği [Ru (bpy) 3] 2+. Farklı konsantrasyonlarda Örnek sinyal yoğunlukları [Ru (bpy) 3] 2 + bir mikroskop lamı (A). Algılama eşiği (kırmızı noktalı çizgi) ve arka plan (siyah noktalı çizgi) (B) görüntüleme sinyal ölçümü. Bu rakam aslında referans 19'da yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Kemilüminesans Görüntüleme. Bir fare ve biyolüminesans okuyucu yerleştirilmiş bir nebülizatör şematik çizimi (A g>) ve bir fare üzerinde püskürtme nebulizatör şematik çizimi (B). Bu rakam aslında referans 19'da yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Algılama: [Ru (bpy) 3] 2 + sistemik uygulamadan sonra. Beyaz ışık, kemilüminesans ve bindirme (soldan sağa). [Ru (bpy) 3] + 2 ile püskürtülür 33 nmol enjekte edildi, bir fare vücut boşluğu görüntüleri (NH4) 2 Ce (NO 3) 6. sağ böbrek doğru beyaz ok puan. Bu rakam aslında referans 19'da yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: 2+ Subdermal İdaresi sonra [3 Ru (BPY)] tespiti. Popliteal lenf nodu görüntüleme ile enjekte edilen farelerde için beyaz ışık, kemilüminesans ve kompozit resimleri gösteren [Ru (bpy) 3] 2+ arka bacaklarda (üst) ve PBS (alt); 80 nmol PBS 10 uL enjeksiyon, (A) 15 dakika sonra görüntülenmiştir. [Ru (bpy) 3] 2+ (üstte) ve PBS (altta) için beyaz ışık ve kompozit görüntüler popliteal lenf düğümleri (B) eksize ile tedavi edilen. Kemiluminesant PBS için sinyaller ve [Ru (bpy) 3] 2+ ile tedavi edilen lenf nodları (C) hayranlarıyla veri ± SD ortalama temsil miktarının belirlenmesi. Bu rakam aslında araştırmalara dayanmaktadır19 inreference yayınladı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, optik kemilüminesan muhabir tarafından oluşturulan fotonların emisyon yoluyla doku ortaya koymaya yeteneğine sahip bir teknoloji sundu. Diğer aksine, daha bu kemilüminesans muhabir sistemi radyoaktif olmayan ve çok yüksek hassasiyet seviyelerinde tespitini kolaylaştırır bir görüntüleme probu istihdam, teknoloji 4, 5, 6, 7, 8, 9, kurdu. Belki daha da önemlisi, kemilüminesans görüntüleme (optik floresan görüntüleme gibi) bir olay ışık kaynağı 20, otofloresans en aza indirir ve büyük ölçüde arka plan sinyallerini azaltan bir özellik gerektirmez.

Rutenyum raportör [Ru (bpy) 3] CI2, bir in vivo var görüntüleme amaçlı tolere toksisite (intraperitoneal fare LD 50: 20 mg / kg) 21, suda çözünebilen (8 mm), ve kan stabildir. Metal kompleksinin fiziko-kimyasal özellikleri, iyi karakterize edilmiş ve daha önce kanser 22, 23 fotodinamik tedavi için incelenmiştir. 24 ve konsantrasyonlarda suda çözünür kadar 20 ° K 2.57 için: oksitleyici madde (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 (1600-3200 mg / kg 50 fareye oral LD), çok düşük toksisiteye sahip olduğu rapor edilmiştir C 25 °. Bu makalede, bir uzaktan kumandalı püskürtme cihazı yapımı için görsel bir gösteri yanı sıra metin tabanlı rehberlik sunulmaktadır. Buna ek olarak, biz bir standart biyolüminesans görüntüleme cihazında Kemiluminesan görüntüleme gerçekleştirmek için sağlam protokolleri sağlar. Bu visualizati için, [Ru (bpy) 3] Cl2 kullanımını göstermektedirFarelerde intravenöz ve deri altı enjeksiyonlar hem sonrasında dokuların üzerinde.

Ancak, herhangi bir başka doğmakta olan görüntüleme teknolojisi gibi, bizim protokollerin geliştirilmesi için bir oda var. Bu proof-of-prensibi çalışma canlı sistemler için birden fazla Kemiluminesan uygulamaların geliştirilmesini teşvik inanıyorum. Aşağıdaki noktalar daha da teknoloji geliştirmek ve kapsamını genişletmek için ele alınabilir.

uzaktan tetiklenen püskürtme cihazları daha küçük ikinci nesil dolayısıyla uzaysal çözünürlüğü artırmak, örnek kameraya yakın olmasını sağlayacak. Geliştirilmiş optik donanım ayrıca yöntemin saptama limitlerini artırmak olabilir. protokol aynı zamanda canlı hayvan görüntüleme için uzun olabilir. (Akım ve gerilim) tarafından tork tam kontrolü her sprey ile serbest reaktif hacmi daha kesin bir kontrol sağlayacak. Bakımlı nebulizatörü tutmak önemlidir. nozz yok edebilir nebülizatör durulama değille. Taze pil nebulizatör uygun performansı için çok önemlidir. Bununla birlikte, nebulizer için kullanılan bütün malzemelerin ucuzdur ve kolaylıkla ticari olarak temin edilebilir. Kurulan sentetik protokoller izlenerek, [Ru (bpy) 3] 2 + Karmaşık kolayca maleimidler 26, aminler 27 ve NHS esterleri 28, 29 dahil olmak üzere çeşitli bağlayıcılar ile modifiye edilebilir. Bu küçük moleküller, peptitler, veya antikorlar bioconjugation sağlayacak ve böylece özel moleküler 30, 31, 32, 33 hedefleme kolaylaştıracaktır. Sonuçta, hedeflenen sonda teslim küçük lezyonları tanımlamak için cerrahlar sağlayabilir ve doğru çok yüksek özgüllük ameliyathanede cerrahi sınır çizmek için. Ayrıca, yüksek ölçüde suda çözünür [Ru (bpy) kapsüllenmesi 3] 2 + nanomaddelerin-hem hedef ve cerrahi 34, 35, 36 kaldırılmakta olan onlar ise hedefsiz-olabilir ayrıca lezyonların görünüm için izin verir. Son olarak, metal kompleks muhabir koordinasyon küresini değiştirerek ve / veya geçiş metali merkezi kendisi çekici yolları görünür içinde emisyon dalga boylarında modüle ve ince ayar için temsil değişen ve NUR, 38 37 arasında değişmektedir.

Ameliyat kemilüminesans görüntüleme bizim durumumuzda, kemilüminesan muhabir ihtiyacı ve sadece toksisite ve çözünürlük sınırları içinde kullanılabilir bir oksidan,. Doku membranlar, dolayısıyla sinyal nesil doku içine oksidan yayılması için bir engel temsil edebilirsiniz. kemiluminesant muhabir sadece döngü başına bir foton üreten olduğundan, üretilen sinyal oldukça zayıftır.ameliyathanede ortam ışığı nedenle teknik kullanımda iken kamerayı girmesini engelledi gerekecektir. Bu ortam ışığı doğal hariç tutulur laparoskopik uygulamalar geliştirilmesi için ICI özellikle ilginç kılabilir.

Biz bu yöntem ameliyathanede cerrahlar için değerli bir araç haline gelebilir umuyoruz. radyoaktivite yokluğu hem hasta ve işletim ekibine faydalıdır ve potansiyel olarak daha çekici bir alternatif haline bu tekniği render daha az güvenlik önlemleri gerekli kılmaktadır.

pürüzsüz nebulizatör çalışması ve konumlandırma iyi sonuçlar elde etmek için önemli bir rol oynamaktadır. Optimal açıları ve alanları varyans sinyal katkıda bulunabilir. kontrol kablosu özenle kapıdan koymak gerekir ve yeterli kablo sıkışık veya kapalı yırtık olmayacak şekilde biyoparlaklık okuyucu içinde kalmalıdır.

Sonuç olarak, chemiluminescence görüntüleme, moleküler görüntüleme için son derece cazip bir yeni bir yaklaşımdır. Bu köklü kimya bir temel üzerine kuruludur, ucuz ve hazır malzemeler kullanmaktadır ve radyasyon ve uyarma ışık kaynakları hem de uzak durur. Sonuç olarak, biz umutlu ve gelecekte, Kemiluminesan görüntüleme hastalığının cerrahi tedavisinde üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir emin hem de.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics