En ny teknikk for generering og Observing Chemiluminescence i en biologisk Setting

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Büchel, G. E., Carney, B., Tang, J., Zeglis, B. M., Eppinger, J., Reiner, T. A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting. J. Vis. Exp. (121), e54694, doi:10.3791/54694 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

I de siste tiårene, har bildeteknologi revolusjonert måten at leger diagnostisere og overvåke sykdommen. Disse bildeteknologier, derimot, har vært i stor grad begrenset til hele kroppen imaging-systemer, slik som positronemisjonstomografi (PET), singel foton-emisjon computertomografi (SPECT), computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI). Spesiell oppmerksomhet er betalt til kreft, og teknologiske bilde gjennombrudd har kraftig forbedret slik at denne sykdommen er diagnostisert og behandlet. Til tross for disse fremskrittene, er det ett sted hvor disse bildeteknologier bare ikke passer: operasjonsstuen. Mens hele kroppen imaging teknikker kan hjelpe i kirurgisk planlegging, de mangler vanligvis romlig oppløsning høye nok til å hjelpe leger avgjøre i sanntid om alle svulstvevet er fjernet eller resttumor vev forblir skjult ved de kirurgiske marginer 1. Å sørge for at ingen infiltrerendetumoravgrensninger er igjen er en av de viktigste kirurgiske mål, og kirurger må gå et stramt tau mellom streng og forsiktig vev reseksjon. Hvis for mye er fjernet, er uønskede bivirkninger for pasienten forverret; hvis for lite er fjernet, er gjentakelse priser økte med 2, 3. Derfor er det viktig å avgrense nøyaktig tumoravgrensninger, og vi tror at kjemiluminescens intraoperativ avbildning kan bidra til å forbedre nøyaktigheten av identifikasjon av tumormarginer ved å hjelpe kirurger å visual ondartet vev som ellers kunne forbli uoppdaget med etablerte teknikker.

Det er mange bildeteknologi for tiden under etterforskning for sin mulige verktøy som intrabildesystemer. Disse inkluderer p- og γ-stråling-utslipp sonder 4, optisk fluorescens 5, Raman-spektroskopi 6 >, 7, og Cherenkov luminescens 8, 9. Til dags dato, men ingen av disse har etablert seg som standard kliniske verktøy. Optisk fluorescensavbildning har så langt vist seg å være den mest lovende av disse teknikkene, og er derfor den mest utforsket. Selv om det allerede har blitt vist seg å være et verdifullt verktøy for mange anvendelser, er det ikke uten sine begrensninger. Faktisk er dens viktigste ulempen bakgrunnen fluorescens som genereres av iboende autofluorescent biologisk vev. Denne bakgrunnen autofluorescent signal er et produkt av magnetiseringen av det omgivende vev, i tillegg til fluoroforen, ved ekstern lyskilde som er nødvendig for generering av et fluorescerende signal. Fra et praktisk perspektiv, kan dette autofluorescence potensielt føre til lave signal-til-støy-forhold, som kan begrense nytten av denne teknologien i operasjonssalen.

RektorFordelen med chemiluminescence bildebehandling i løpet av fluorescens bildebehandling er at ingen eksitasjon lys er nødvendig. Som et resultat, er det ingen bakgrunn autofluorescens. I kjemiluminescens avbildning, blir eksitasjonsenergien i stedet generert kjemisk. Denne prosessen gir ingen utilsiktet bakgrunnssignal og kan derfor resultere i høyere signal-til-støy-forhold. Dette kan til slutt føre til mer presis og nøyaktig påvisning av kirurgiske marginer. Noe overraskende har nytten av denne tilnærmingen som en intraoperativ avbildningsteknikk forble uutforsket 10. Faktisk er det nærmeste eksempel på denne teknikken er oksidasjon av luminol ved myeloperoxydase i mus 11, 12, 13. Kjemiluminescens biomedisinsk bildebehandling er derfor en ganske uutforsket område av forskning som kan gi følgende fordeler: (1) minimal autofluorescence resulterer i et lavt bakgrunnssignal med hiGher signal-til-støy-forhold; (2) avstembare bølgelengder av kjemiluminescens-utslipp som strekker seg fra det synlige til det nær-infrarøde; og (3) functionalizable kjemiluminescerende komplekser, som i kombinasjon med linker teknologi og målrettet biomolekyler som allerede finnes, gir tilgang til hele biblioteker av målrettede molekylær avbildning sonder 14.

Dette proof-of-prinsippet studien illustrerer den potensielle nytten av kjemiluminescens bildebehandling i biomedisinsk innstillingen med en ruthenium-baserte bilde agent. De kjemiluminescerende egenskapene til denne forbindelsen er godt studert, med undersøkelser dateres tilbake til midten av 1960-tallet 15. Ved kjemisk aktivering, produserer lys på rundt 600 nm 16, som er godt egnet for medisinske avbildningsformål midlet. Aktiveringsenergien er levert av en redoks-reaksjon som fører til en eksitert tilstand-, som har en levetid på 650 ns i vann 17 -follskyldte ved generering av fotoner på avslapning av denne opphisset tilstand. Gjennom bruk av et spesiallaget fjernforstøver, var vi i stand til å detektere forbindelsen både ex vivo og in vivo. Resultatene fra innledende forsøk er svært lovende, noe som tyder på videre undersøkelser av denne teknologien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: Alle in vivo dyreforsøk beskrevet ble utført i henhold til godkjent protokoll og under de etiske retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Bygging av en forstøvningsanordningen

  1. Fest tre del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) loddrett i midten av del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) ved hjelp av to skruer (4 x 25 mm 2). Fest tre del C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) til midten av del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) ved hjelp av en skrue, slik at en del C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) kan fremdeles beveges. Se figur 1.
  2. Bore to hull gjennom den nedre sprøyteflaske avtrekkeren av en plast 3 oz mini sprøyter (D) og presse en stang av rustfritt stål (10 cm av 1/16 "stål) (E) ved å danne to sløyfer, en på hver sin side av utløseren. Pakk den nederste delen av sprayflaske med duct tape (F) for å hindre stripsene fra slipping av. Fest sprayflaske til tre del C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) ved hjelp av de to plast strips (28 cm) (G).
  3. Klipp av 011 servomotor (I) og koble den med løse kabler av servokontrollen (H). Deretter setter servomotoren til toppen av treet del A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) ved hjelp av tape.
  4. Fest en blyant (J) til servomotor spaken bruker binders (K). Tett koble de ytterste delene av blyant til stål stang looper som bruker plast dekket vri ledninger (L) og fest endene på blyanten med duct tape.
  5. Klipp av servomotorstyreenhet magnetiske kabelkontakt (M) og fest den til høyttalerkabel (N). Deretter tape servomotorstyreenhet til tre del B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Skjær en w1 kabel med magnetiske kontakter i to og legg den ene delen til den løse enden av kobber sPeaker kabel (1 m). Koble (magnetisk) i2 vippebryter og p1 strøm til tilgjengelig w1 kabel og et 9V batteri.

2. Følsomhet Fastsettelse av metode

  1. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, utarbeide løsninger av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i omvendt osmose vann (100 pl) i mengder på 260 mikrogram (347 nmol), 52 mikrogram (69 nmol), 26 mikrogram (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 ug (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), og 3 ng (3,5 pmol).
  2. Bland 100 ul av hver [Ru (bpy) 3] Cl2-løsning med 100 pl av en vandig oppløsning av ammonium-cerium-nitrat ((NH4) 2 Ce (NO3) 6) i vann (25 mM) på et objektglass.
  3. Sett opp oppkjøpet i bioluminescence leseren ved initialisering av bildebehandlingsprogrammer.
    1. Logg inn på brukerprofilen og se etter acquisisjon kontrollpanelet. Klikk på "initialisert" og vent til maskinen er klar.
    2. Se etter "Bildemodus" og sørge for at "Selvlysende" og "fotografier" er sjekket og at "Fluorescent" er avmerket.
    3. Change "Exposure Time" -innstillingen for "Selvlysende" 20 s. Sett de resterende innstillingene på "Selvlysende" som følger: "Binning": Medium; "F / stop": 1; og "Emission Filter": Open.
      MERK: eksponeringstider kanskje må tilpasses i henhold til instrumentering og eksperimentelle innstillingen som ble brukt, hvis forskjellig fra den presenterte oppsettet.
    4. For "Fotografi", kan du bruke følgende innstillinger: "Exposure Time": Auto; "Binning": Medium; og "F / stop": 8. Juster "Emne Høyde" i henhold til bildebehandling target.Look for "Field of View" rullegardinmenyen. Den første innstillingen er "C." Endres til "B" (14 cm avstand mellom cAmera og prøvestadiet).
  4. Sett opp forstøveren ved å plassere en mikroskopisk lysbilde på et ark av svart bygging papir på gulvet på bilde kammer for å beskytte den fra oksidasjonsmiddel. Bland en 100 μLdroplet av [Ru (bpy) 3] Cl 2-oppløsning med 100 mL av en vandig løsning av (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Følg den grønne boksen trådkors.
    1. Plasser bilde motivet på svart bygging papir, slik at området av interesse ligger i sentrum av den grønne lyskasse trådkors vises på prøven scenen. Forbered forstøver ved å ta av plast spray flaske fra tre-støtte. Fylle en oppløsning av trietylamin (1: 3 med vann / etanol) inn i plastbeholderen og feste den til den tre-støtte.
    2. Sett forstøveren inne bioluminescence leseren og sørge for at strømkabelen er koblet fra forstøveren ledningen. Kontroller at strømbryterener på, er vippebryteren av, og det røde lyset lyser Plasser forstøver slik at sprøytestrømmen peker mot området av interesse på bilde emnet, mens utsikten hindringer fra kameraet mot bildelagt av sprøytemunnstykkehodet minimeres.
    3. Plasser små, sorte biter av bygging papir enn noen potensielle hot spots (f.eks hvite merker på mikroskopiske lysbilder eller injeksjonssteder) for å skjerme dem fra spray. Plasser minst 40 cm av forstøverfjernledningen inne i bildebehandling kammeret, slik at den ikke forstyrrer bildelagt, forstøver, eller den magnetiske dør låsen. Lukk imaging system døren.
      MERK: trådkorset vil endre størrelsen basert på "Field of View" -innstillingen i "Living bilde;" sørge for at dette er satt til "B".
  5. Acquire et bilde ved å starte bildesekvensen. Klikk "Acquire" i "Acquisition Control Panel". På den første bilde sequhet, aktiverer autolagring hvis ønskelig (anbefales) og velge en datamappe. Ignorer "Edit Imaging Etiketter" dialogen til slutten av sekvensen.
    MERK: Kontrollprogramvaren viser instrumentets handlinger trinn-for-trinn i sanntid. Etter å ha forberedt målingen og flytte prøven scenen til riktig posisjon, åpnes det kameraet skodde og teller tidsmåling. Lukkeråpning kan også bli hørt av et klikk genereres av maskinen.
  6. Som lukkeren åpnes, spray tre pakker med en løsning av trietylamin (1: 3 i vann / etanol, 0,24 ± 0,04 ml per spray burst) ved å slå på bryteren tre ganger for å generere chemiluminescence.
    MERK: Prøven scenen vil bevege seg under målingen. La det være nok (minimum 40 cm) kabelen inne i instrumentet for å tillate dette. Sørg for at løsningen skal sprayes med forstøver kan strebet etter stigeledningen, og at det ikke er luftbobler i røret. Har flere reserve batteries for forstøver klar i tilfelle behov.

3. in vivo avbildning Etter Systemisk intravenøs injeksjon

  1. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør, forberede 100 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning inneholdende mellom 8 og 33 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl2. Fremstille en vandig oppløsning av (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i vann (25 mM) på samme tid.
  2. Intravenøst injisere 100 ul av [Ru (bpy) 3] Cl 2 inn i halevenen til friske mus (n = 5).
  3. Avlive mus 10 min etter injeksjon via CO 2 kvelning.
    1. Fjern skinnet med en Y-kutt fra overkroppen, og deretter fjerne kyst buen i en U-form for å avsløre hjertet og lungene. Perfuse musene ved å kutte et utløp i høyre atrium og injisering av 20 ml av PBS gjennom en 24 gauge nål inn i venstre hjertekammer 18. Skjær forsiktig gjennom magenHud og utsette nyrene og leveren. Skåret i lengderetningen gjennom organene for å skape en synlig snitt.
  4. Sett opp oppkjøpet som beskrevet i trinn 2.3-2.6, med følgende endringer.
    1. Etter grundig vasking av forstøveren plast reservoaret, fylle det med en oppløsning av (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i vann (25 mM) i stedet for trietylamin.
      MERK: Det er viktig å skylle forstøvermunnstykket etter hver bruk, siden utkrystalliserer (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kan ødelegge sprøytemunnstykket etter flere bruksområder.
  5. Bruk hele dyret eller organprøver for bildebehandling.
    1. For hele magen imaging, plasserer du musen kadaveret med åpen buk mot kameraet og hodet peker til baksiden av instrumentet. Sentrer det organ som skal avbildes (f.eks, lever eller nyre) i den grønne lyskasse trådkors.
    2. Feller enkelte organ avbildning og kvantifisering, fjerne musen fra bildebehandling instrument og pin det ned. Med start fra den allerede åpnede kroppshulrom, skjære de indre organer (f.eks, nyre, lever, lunge, muskel, milt, hjerne og hjerte). Skjær gjennom bakbenet huden til å skjære muskelvev. Åpne forsiktig skallen med en skalpell for å skjære hjernen.
      1. Dersom organ av interesse er lever, nyre eller milt, kuttet alle organer i halv lengderetningen, plassere hvert organ på en petriskål eller stykke svart bygging papir.
    3. Følg prosedyren beskrevet i trinn 2.3-2.6 å etablere den relative utslipp av den kjemiluminescerende markør for enkle organer.

4. in vivo avbildning av lymfeknuter

  1. Fremstille 10 ul av en PBS-oppløsning inneholdende 80 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl2. Fremstille en vandig oppløsning av (NH4) 2 Ce (NO3) 6 i water (25 mM) på samme tid.
  2. Injiser 10 ul av oppløsningen subdermalt inn i bakpoten hos friske mus (n = 5). Som en negativ kontroll, injisere den kontralaterale pote med 10 ul av rent PBS. Ofre mus via CO 2 kvelning 15 minutter etter injeksjonen. Fjern skinnet på begge bakbeina for å avsløre lymfe kanalene opp til knehasen lymfeknuter.
  3. Sett opp oppkjøpet som beskrevet i trinn 3.4.
  4. Fjern popliteal lymfeknuter fra begge bakben, kutte dem i to, og sprøyte dem med oksidasjonsmidlet på en petriskål, som beskrevet tidligere (trinn 3.5.3), i den hensikt å kvantifisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forstøver system som er beskrevet i protokollen seksjon 1 kan konstrueres fra lett tilgjengelige materialer ved en lav kostnad. Det er ment å være et innfelt for fjern utløst sprøyting av reduksjons / oksydasjonsmiddel inne i et bioluminescent leser (figur 1). Vårt design gjør for sikker drift av forstøver innenfor bioluminescence leseren på en 14 cm avstand fra linsen. Ingen dugg eller uskarpe objektivet ble observert under operasjonen. Vi har valgt den kommersielt tilgjengelige kjemiluminescerende middel [Ru (bpy) 3] Cl 2 for utvikling av vår metode basert på den lave pris, stabilitet i vandig oppløsning, vel beskrevne redoks-oppførsel, og kjemiluminescerende egenskaper (figur 2) 19. Den minimale detekterbare signalet kan bli bestemt som beskrevet i protokoll seksjon 2 ved oksidasjon av en dråpe av [Ru (bpy) 3] Cl 2 (100 ul, 6,9 pmol- 347 nmol i H 2 O) med (NH4) 2 Ce (NO 3) 6 (100 ul, 25 mM) på et objektglass. Deretter, ved bruk av forstøveren og sprøyte på en oppløsning av trietylamin (1: 3 med vann / etanol), blir den kjemiluminescerende signal utløses. I vårt tilfelle var den minimale påvisbare signal bestemt til å være 6,9 pmol / cm 2 (figur 3). Det kan tenkes, men at optimalisert reaksjonsbetingelser, kamera sensitiviteter, lukkertider, volumer, og reagenvolumer konsentrasjoner kan føre til enda lavere deteksjonstersklene. Disse reaksjonsbetingelser kan også brukes for å utforske og testing av kjemiluminescens av en hvilken som helst gitt kombinasjon av metallkomplekser, oksidasjonsmidler, og reduksjonsmidler.

Flytte til in vivo eksperimenter i protokoll §§ 3 og 4, kvinnelige naken (utav) mus 5-6 uker gamle og NU / J hannmus 6-8 uker gamle ble brukt. For intravenøse injeksjoner, mengder av8-33 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i 100 ul PBS pr mus (n = 5) ble valgt. Dyrene ble avlivet 10 minutter etter injeksjon, og bukhulen ble eksponert. Musene ble plassert i bioluminescent leseren med forstøver peker mot vevet av interesse (figur 4). For avbildning med intravenøst injisert [Ru (bpy) 3] Cl 2, ble den kjemiluminescerende signal som detekteres hovedsakelig i nyrene, noe som tyder sterkt nedsatt eliminasjon av den hydrofile lite molekyl (figur 5). Signal-til-støy-forhold for mus injisert med [Ru (bpy) 3] Cl 2 versus PBS var 27/1 for nyrene og 21/1 for leveren. For lymfeknuteavbildning, 80 nmol av [Ru (bpy) 3] Cl 2 i 10 ul PBS ble injisert subdermalt inn i bakfot pute av mus (n = 5). Mus ble ofret 15 minutter etter injeksjon av CO 2 kvelning. Huden som dekker både indre bakbena was fjernet for å eksponere den muskel, lymfeknuter, og lymfekar. Etterfølgende kjemiluminescens visualisering av knehasene lymfeknuter førte til observasjon at lymfeknuter som inneholder [Ru (bpy) 3] 2+ viser en 10 ± 4,3 ganger høyere utstråling enn ubehandlede de (167 000 p / (s × cm 2 × sr) og 17 000 p / (r x cm 2 x sr); p <0,028) (figur 6).

Figur 1
Figur 1: Fotografi av Nebulizer. Deler brukt: trekonstruksjon deler (A, B, C), sprayflaske (D), bøyd stål stang (E), duct tape (F), plast strips (G), 011 servo kontakten del (H), servomotor (I), blyant ( J) holdt av bøyd binders (K), plast dekket trådklips (L) w1 ledningskontakt (M) og høyttalerkabel (N) som fører til batteriet. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i refærbødighet 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Egenskaper til [Ru (bpy) 3] 2+. Struktur (A) og eksitasjon og emisjonsspektra (B) av [Ru (bpy) 3] 2+. Oksydasjon / reduksjon basert kjemiluminescerende katalytiske syklus (C). Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i referanse 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3: deteksjonsgrensen av [Ru (bpy) 3] 2+. Representative signalintensiteter ved forskjellige konsentrasjoner av [Ru (bpy) 3] 2+ på et objektglass (A). Imaging signal kvantifisering med deteksjonsgrensen (rød stiplet linje) og bakgrunn (svart stiplet linje) (B). Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i referanse 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Chemiluminescence Imaging. Skjematisk tegning av en mus og et forstøver plassert i bioluminescence leseren (A g>) og skjematisk tegning (B) av forstøver sprøyting på en mus. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i referanse 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Påvisning av [Ru (bpy) 3] 2+ etter systemisk administrasjon. Hvitt lys, chemiluminescence, og overlay (fra venstre til høyre). Bilder av en mus kroppens hulrom som ble injisert med 33 nmol [Ru (bpy) 3] 2+ og sprayet med (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Den hvite pilen peker mot høyre nyre. Dette tallet er basert på forskning opprinnelig publisert i referanse 19.ftp_upload / 54694 / 54694fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Påvisning av [Ru (bpy) 3] 2+ etter Subdermal Administration. Popliteal lymfeknute avbildning viser hvitt lys, chemiluminescence og sammensatte bilder for mus injisert med [Ru (bpy) 3] 2+ (øverst) og PBS (nederst) i baklemmene; 80 nmol i 10 ul PBS, avbildes 15 min etter injeksjon (A). Hvitt lys og sammensatte bilder for [Ru (bpy) 3] 2+ (øverst) og PBS (nederst) -behandlet skåret knehasen lymfeknuter (B). Kvantifisering av kjemiluminescerende signaler for PBS og [Ru (bpy) 3] 2+ behandlede lymfeknuter (C) sikret data representerer gjennomsnitt ± SD. Dette tallet er basert på forskning opprinneligpublisert inreference 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi presentert en teknologi som er i stand til optisk opptegning vev via emisjonen av fotoner som er opprettet av en kjemiluminescerende reporter. I motsetning til andre, mer etablerte teknologier 4, 5, 6, 7, 8, 9, dette kjemiluminescerende reporter systemet benytter en avbildning sonde som er ikke-radioaktivt og muliggjør deteksjon ved svært høye nivåer for følsomhet. Kanskje enda viktigere, ikke chemiluminescence bildebehandling ikke krever en hendelse lyskilde (som i optisk fluorescens bildebehandling) 20, et trekk som minimerer autofluorescence og drastisk reduserer bakgrunnssignaler.

Ruthenium reporter [Ru (bpy) 3] Cl 2 har en in vivo- toksisitet utholdelig for bildebehandling formål (intraperitoneal mus LD 50: 20 mg / kg) 21, er vannløselige (opp til 8 mm), og er stabil i blodet. De fysikalsk-kjemiske egenskaper av metallkomplekset er godt karakterisert og er allerede blitt undersøkt for fotodynamisk terapi av kreft 22, 23. Oksidasjonsmidlet (NH4) 2 Ce (NO3) 6 er blitt rapportert å ha meget lav toksisitet (oral rotte LD 50: 1600-3200 mg / kg) 24 og er oppløselig i vann ved konsentrasjoner på opp til 2,57 M ved 20 ° C 25. I denne artikkelen, er en visuell demonstrasjon samt tekstbasert veiledning for bygging av en fjernstyrt forstøvningsanordningen presentert. I tillegg gir vi robuste protokoller for å utføre chemiluminescence bildebehandling i en standard bioluminesens bildeenhet. Vi illustrere bruken av [Ru (bpy) 3] Cl 2 for visualizatipå av vev etter både intravenøs og subdermal injeksjoner i mus.

Men som med alle andre begynnende bildeteknologi, er det rom for forbedring av våre protokoller. Vi tror at denne proof-of-prinsippet studien kan få fart på utviklingen av flere Chemiluminescence programmer for levende systemer. Følgende punkter kan rettes til ytterligere forbedre teknologien og utvide sitt virkeområde.

En mindre andre generasjons fjern utløst sprøyting enheter ville tillate prøven å være nærmere kameraet, og dermed øke romlig oppløsning. Forbedret optisk utstyr kan ytterligere forbedre påvisningsgrensene for fremgangsmåten. Protokollen kan også bli utvidet til å avbilde levende dyr. Nøyaktig styring av dreiemomentet (av strøm og spenning) ville tillate en mer nøyaktig styring av volumet av reagensen frigjøres med hver spray. Det er viktig å holde forstøver godt vedlikeholdt. Ikke skylle forstøver kan ødelegge nozzle. Et nytt batteri er avgjørende for riktig utførelse av forstøver. Men alle de materialer som brukes for forstøveren er billig og lett kommersielt tilgjengelig. Etter etablerte syntetiske protokoller, den [Ru (bpy) 3] 2+ kompleks kan enkelt endres med ulike forbindelsesledd, inkludert maleimider 26, aminer 27, og NHS estere 28, 29. Dette ville gjøre det mulig bioconjugation til små molekyler, peptider, eller antistoffer, og vil derfor legge til rette for spesifikk målretting molekyl 30, 31, 32, 33. Til syvende og sist kan målrettet sonde levering aktivere kirurger til å identifisere små lesjoner og nøyaktig avgrense kirurgiske marginer i operasjonsstuen med meget høy spesifisitet. Også, innkapsling av meget vannoppløselig [Ru (bpy) 3] 2+ i nanomaterialer, både målrettet og vilkårlige-kan også gi rom for visualisering av lesjoner mens de er blitt kirurgisk fjernet 34, 35, 36. Til slutt, endre samordning sfære av metallkomplekset reporter og / eller endring av overgangsmetall senteret representerer attraktive ruter til å modulere og finjustere emisjonsbølgelengder innenfor det synlige og NIR spenner 37, 38.

Intraoperativ kjemiluminescens avbildning trenger en kjemiluminescerende reporter og, i vårt tilfelle, et oksidasjonsmiddel, som bare kan brukes innenfor rammen av deres toksisitet og oppløselighet. Vev-membraner kan representere en barriere for diffusjon av oksidasjonsmidlet inn i vevet, og dermed genereringen av signalet. Siden den kjemiluminescerende reporteren er bare genererer en foton per syklus, er det genererte signal temmelig svak.Omgivelseslyset i operasjonssalen må derfor være forhindret fra å komme inn i kameraet mens teknikken er i bruk. Dette kan gjengi ICI spesielt interessant for utviklingen av laparoskopiske applikasjoner, der lysforholdene er naturligvis utelukket.

Vi håper at denne metoden kan slå inn i et verdifullt verktøy for kirurger i operasjonssalen. Fraværet av radioaktivitet er gunstig for pasienten og operasjonsteamet like og gjør færre sikkerhetsregler er nødvendig, potensielt gjengi denne teknikken til et mer attraktivt alternativ.

Jevn drift av forstøveren og dens posisjonering spiller en avgjørende rolle for å oppnå gode resultater. Suboptimale vinkler og områder kan bidra til å signalisere variansen. Kontrollkabelen må bli satt gjennom døren med forsiktighet, og nok kabel må forbli inne bioluminescence leseren, slik at det ikke er trangt eller revet av.

Til syvende og sist, chemiluminescence bildebehandling er en svært attraktiv ny tilnærming til molekylær avbildning. Den er basert på et fundament av veletablert kjemi, sysselsetter rimelige og lett tilgjengelige materialer, og skyr både stråling og eksitasjon lyskilder. Som et resultat, er vi både håp og tro på at i fremtiden kan kjemiluminescens bildebehandling ha en dyp effekt på kirurgisk behandling av sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft 131404 Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm) Screwfix 79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayer Bed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) Metals Depot Int. Inc. 2192
Pencil Classic HB Papermate 58592
Paper clip Office Depot 221720
speaker cable RCA Inc. AH1650SN
Energizer 9V alkaline battery Energizer Holdings Inc. EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6V Hitech RCD USA Inc. 32082S
Name Company Catalog Number Comments
28 cm plastic cable ties General Electric Inc. 50725
Duct tape 3M Inc. 3939
littleBits w1 wire littleBits Inc. w1 wire
littleBits p1 power littleBits Inc. p1 power
littleBits i2 toggle switch littleBits Inc. i2 toggle switch
littleBits 011 servo littleBits Inc. 011 servo
20 cm plastic covered wire twist ties Four Star Plastics 71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich Inc. 224758
Ammonium cerium(IV) nitrate Sigma-Aldrich Inc. 22249
Isofluorane Baxter Healthcare 1001936060
PBS Sigma-Aldrich PBS1
Ethanol Sigma-Aldrich 2854
Triethylamine Sigma-Aldrich Inc. T0886
Water Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) mice Jackson Laboratories 1929 age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at  Jackson Laboratories 2019 age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence reader Caliper Live Science
Live Image 4.2 software Perkin-Elmer 128165
Microscope slides ThermoScientific 4951PLUS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. Springer. (2015).
  2. Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation - a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13, (9), 653-662 (2013).
  3. Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
  4. Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41, (3), 166-181 (2011).
  5. van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17, (10), 1315-1319 (2011).
  6. Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, (25), E2288-E2297 (2013).
  7. Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
  8. Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53, (9), 1438-1445 (2012).
  9. Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55, (1), 95-98 (2014).
  10. Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, (4), 455-461 (2009).
  11. Lee, J. -J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49, (29), 3016-3018 (2013).
  12. Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6, (10), 765-769 (2007).
  13. Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2, (12), 1025-1030 (2010).
  14. Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88, (1), 170-202 (2016).
  15. Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88, (20), 4745-4746 (1966).
  16. Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
  17. Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. Handbook of Photochemistry 3rd Ed. CRC Press Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL, USA. 379-404 (2006).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. (2016).
  20. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  21. Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9, (3), 371-381 (1956).
  22. Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
  23. Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
  24. Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54, (5), 663-670 (1965).
  25. Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. Pergamon Press. (1983).
  26. Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
  27. Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112, (8), 2949-2957 (2008).
  28. Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84, (6), 2769-2775 (2012).
  29. Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
  30. Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108, (1), 29-35 (2012).
  31. Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
  32. Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21, (40), 14146-14155 (2015).
  33. Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9, (5), 1146-1159 (2014).
  34. Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79, (1), 171-180 (2014).
  35. Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97, (4), 463-465 (2010).
  36. Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
  37. Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
  38. Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139, (22), 6028-6035 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics